微生物的分离纯化及鉴定
一、基本原理 微生物的分离纯化是研究微生物的基本方法。将特定的微生物个体从群体中或从混杂的微生物群体中分离出来的技术叫作分离；在特定环境中只让 1种来自同一祖先的微生物群体生存的技术叫作纯化。
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。
土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。
二、实验器材 1、培养基：高氏1号琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，PDA 培养基
2、其他：盛9ml 无菌水的试管，盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，10％酚，无菌培养皿，无菌室，培养箱，高压蒸汽灭菌锅，记号笔等
3、材料：土壤（若未分离出想要得到的菌，则再加其他材料）
三、培养基的配方及配制步骤
1、高氏1号培养基（1000ml ，培养放线菌）：可溶性淀粉（20g ），KNO3（1g ），K2HPO4（0.5g ），MgSO4· 7H2O （0.5g ），NaCl （0.5g ），FeSO4· 7H2O （0.01g ），琼脂 20g ，pH=7.4-7.6，121℃灭菌20min 。和改良的差别就在于有没有FeSO4· 7H2O 高氏常常配完后变成褐色也是由于Fe2+氧化为Fe3+的关系，所以常常有人用螯合的FeSO4，防止氧化。 称量和溶化按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需其他各类培养基水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分，并依次溶化，对微量成分FeSO4 ．7 H2 O可先配成高浓度的贮备液，按比例换算后再加入。待所有试剂完全溶解后，补充水分到所需的总体积。配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的试剂中，在加热融化，最后补充所损失的水分。
2、牛肉膏蛋白胨培养基（1000ml ，分离细菌）
牛肉膏 0.5g
蛋白胨 1g
氯化钠 0.5g
琼脂 2g
蒸馏水 100mL
pH 7.0～7.2
灭菌 1.05kg/cm2，22min
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl 放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接
放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。
3、马丁氏培养基（1000ml ，分离真菌）
KH2PO4 1g
MgSO4·7H2O 0．5g
蛋白胨 5g
葡萄糖 10g
琼脂 15—20g 水1000ml
pH 自然
此培养液1000ml 加1%孟加拉红水溶液3．3ml 。临用时每100ml 培养基中加1%链霉素液0．3ml 。
4、PDA 培养基（1000ml ，分离真菌）
马铃薯 300克葡萄糖 20克
琼脂 15~20克自来水 1000毫升
自然PH
其做法是先洗净去皮, 再称取300g 马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，再据实际实验需要加葡萄糖和琼脂，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。
四、样品的采集（根据要培养的菌种选择所需的样品，样品要含有实验所需的菌种，如土壤中含有放线菌）
土壤采集：选择肥沃的土壤，去表层2-3cm ，用铲子向下挖3-10cm 的土壤，用已灭好菌的密封袋装好。（本组采用学校大门左边小树林的土壤）
五、分离与纯化的方法
A 、稀释涂布平板法
1．样品稀释液的制备准确称取待测样品l0g ，放入装有90ml 无菌水并放有小玻璃珠的250ml 三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min ，使微生物细胞分散，静置20-30s ，即成10-1稀释液；再用1ml 无菌吸管，吸取10-1稀释液lml ，移入装有9ml 无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml ，
移入装有9ml 无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6等一系列稀释菌液。
用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度。
2．平板接种培养平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。
（1）混合平板培养法将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml 放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml 放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各lml 放入编号10-5的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。
（2）涂抹平板计数法涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml 菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min ，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落。
B 、平板划线法
1．融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。
2．倒平板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15m1) ，平置，待凝固。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶) 塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中) 。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平
置于桌面上，待凝后即为平板。
3．作分区标记在皿底将整个平板划分成A 、B 、C 、D 四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120度左右（平板转动一定角度约60度），以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D 区与A 区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。
4．划线操作
(1)挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
(2)划A 区：将平板倒置于煤气（酒精）灯旁, 左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁) ，右手拿接种环先在A 区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定) 。划完A 区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内) ，以防止杂菌的污染。
(3)划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B 区转到上方，接种环通过A 区(菌源区) 将菌带到B 区，随即划数条致密的平行线。再从B 区作C 区的划线。最后经C 区作D 区的划线，D 区的线条应与A 区平行，但划D 区时切勿重新接触A 、B 区，以免极该两区中浓密的菌液带到D 区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
5．恒温培养：将划线平板倒置，于37℃（或28℃）培养，24h 后观察.
各培养基涂布菌液时对稀释度的选择温度所需平板数
牛肉膏蛋白胨培养基（细菌）37 3*3=9
高氏1号培养基（放线菌）28 3*3=9
PDA/马丁培养基（真菌）30 3*3=9
微生物的分离纯化及鉴定
一、基本原理 微生物的分离纯化是研究微生物的基本方法。将特定的微生物个体从群体中或从混杂的微生物群体中分离出来的技术叫作分离；在特定环境中只让 1种来自同一祖先的微生物群体生存的技术叫作纯化。
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。
土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。
二、实验器材 1、培养基：高氏1号琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，PDA 培养基
2、其他：盛9ml 无菌水的试管，盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，10％酚，无菌培养皿，无菌室，培养箱，高压蒸汽灭菌锅，记号笔等
3、材料：土壤（若未分离出想要得到的菌，则再加其他材料）
三、培养基的配方及配制步骤
1、高氏1号培养基（1000ml ，培养放线菌）：可溶性淀粉（20g ），KNO3（1g ），K2HPO4（0.5g ），MgSO4· 7H2O （0.5g ），NaCl （0.5g ），FeSO4· 7H2O （0.01g ），琼脂 20g ，pH=7.4-7.6，121℃灭菌20min 。和改良的差别就在于有没有FeSO4· 7H2O 高氏常常配完后变成褐色也是由于Fe2+氧化为Fe3+的关系，所以常常有人用螯合的FeSO4，防止氧化。 称量和溶化按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需其他各类培养基水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分，并依次溶化，对微量成分FeSO4 ．7 H2 O可先配成高浓度的贮备液，按比例换算后再加入。待所有试剂完全溶解后，补充水分到所需的总体积。配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的试剂中，在加热融化，最后补充所损失的水分。
2、牛肉膏蛋白胨培养基（1000ml ，分离细菌）
牛肉膏 0.5g
蛋白胨 1g
氯化钠 0.5g
琼脂 2g
蒸馏水 100mL
pH 7.0～7.2
灭菌 1.05kg/cm2，22min
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl 放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接
放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。
3、马丁氏培养基（1000ml ，分离真菌）
KH2PO4 1g
MgSO4·7H2O 0．5g
蛋白胨 5g
葡萄糖 10g
琼脂 15—20g 水1000ml
pH 自然
此培养液1000ml 加1%孟加拉红水溶液3．3ml 。临用时每100ml 培养基中加1%链霉素液0．3ml 。
4、PDA 培养基（1000ml ，分离真菌）
马铃薯 300克葡萄糖 20克
琼脂 15~20克自来水 1000毫升
自然PH
其做法是先洗净去皮, 再称取300g 马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，再据实际实验需要加葡萄糖和琼脂，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。
四、样品的采集（根据要培养的菌种选择所需的样品，样品要含有实验所需的菌种，如土壤中含有放线菌）
土壤采集：选择肥沃的土壤，去表层2-3cm ，用铲子向下挖3-10cm 的土壤，用已灭好菌的密封袋装好。（本组采用学校大门左边小树林的土壤）
五、分离与纯化的方法
A 、稀释涂布平板法
1．样品稀释液的制备准确称取待测样品l0g ，放入装有90ml 无菌水并放有小玻璃珠的250ml 三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min ，使微生物细胞分散，静置20-30s ，即成10-1稀释液；再用1ml 无菌吸管，吸取10-1稀释液lml ，移入装有9ml 无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml ，
移入装有9ml 无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6等一系列稀释菌液。
用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度。
2．平板接种培养平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。
（1）混合平板培养法将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml 放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml 放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各lml 放入编号10-5的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。
（2）涂抹平板计数法涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml 菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min ，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落。
B 、平板划线法
1．融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。
2．倒平板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15m1) ，平置，待凝固。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶) 塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中) 。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平
置于桌面上，待凝后即为平板。
3．作分区标记在皿底将整个平板划分成A 、B 、C 、D 四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120度左右（平板转动一定角度约60度），以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D 区与A 区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。
4．划线操作
(1)挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
(2)划A 区：将平板倒置于煤气（酒精）灯旁, 左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁) ，右手拿接种环先在A 区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定) 。划完A 区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内) ，以防止杂菌的污染。
(3)划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B 区转到上方，接种环通过A 区(菌源区) 将菌带到B 区，随即划数条致密的平行线。再从B 区作C 区的划线。最后经C 区作D 区的划线，D 区的线条应与A 区平行，但划D 区时切勿重新接触A 、B 区，以免极该两区中浓密的菌液带到D 区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
5．恒温培养：将划线平板倒置，于37℃（或28℃）培养，24h 后观察.
各培养基涂布菌液时对稀释度的选择温度所需平板数
牛肉膏蛋白胨培养基（细菌）37 3*3=9
高氏1号培养基（放线菌）28 3*3=9
PDA/马丁培养基（真菌）30 3*3=9