生物化学研究进展

生物化学研究进展

作业

题目 用三种方法测定血清葡萄糖

姓名 朱 军 光

学号 1017104111

班级专业 农业资源与环境专业

题目：用各种方法测定血清葡萄糖

姓名：朱军光

专业：农业资源与环境专业

摘 要：不同苯原酚化合物用于GOD-Trinder 法测定血糖的比较研究和GOD-POD 方法结合两点法测定血糖和葡萄糖含量的测定——碘量法

。对苯酚、2,4-二氯苯酚、2,6-二氯苯酚及间-苯二酚等四种苯原酚化合物作为过氧化酶（POD ）催化4-氨基安替比林（4-AA ）-过氧化氢一酚显色体系测定血糖的葡萄糖氧化酶法(GODTrinder)进行比较研究。 结果表明，苯酚、2，4一二氯苯酚及间一苯二酚三种苯原酚分别构成GODPOD4一A”HzQ一酚显色体系测定血 糖时，其检测结果均无显著性差异(P>o．05) ，但2，4一二氯苯酚显色体系的显色灵敏度、方法的精密度和准 确度均优于苯酚显色体系。间一苯二酚显色体系灵敏度不及苯酚，但检测速度快，线性范围宽，可用于较高浓 度葡萄糖溶液的在线快速分析。用GOD —POD 方法结合两点法测定血清葡萄糖，葡萄糖含量的测定——碘量法 。

关键词：葡萄糖；血清；葡萄糖氧化酶；过氧化物酶；生物化学检验：GOD —POD 两点法；葡萄糖含量的测定——碘量法

正文

己糖激酶法(HK)和葡萄糖氧化酶(GOD)法已得到普遍应用。GOD 法又可分为速率法和比色法，后者即G0n Trinder法，采用葡萄糖氧化酶偶联过氧化物酶(POD)，以4一氨基安替比林(4一AA) 一HzQ 一苯酚作为显色体系[7]，由于具有特异性强、操作简单等优点，已成为目前血糖测定的常规。光谱学与光谱分析，不同苯原酚化合物用于GOD —Trinder 法测定血糖的比较研究，方法，其缺点是灵敏度较低。本文用苯酚、2，4一二氯苯酚、2，6一二氯苯酚及间一苯二酚等四种苯原酚分别与4一AA_Hz 02构成显色体系测定血糖，并对其进行方法学比较研究，以寻求更为灵敏、准确、快速的血糖测定方法，取得满意结果。

1实验部分

1．1仪器与试剂 SP-2100型分光光度计(计算机控制) ，pH3C 型数字式酸度计，CS501型超级恒温箱。o ．1 n101．L-1磷酸盐缓冲液(pH 7．o) ；葡萄糖标准液；酶试剂(含GOD ，POD ，4一AA ，用O ．1m01．L_1磷酸盐缓冲液配制) ；酚试剂(分别为苯酚溶液，2，4一二氯苯酚溶液，2，6一二氯苯酚溶液，间一苯二酚溶液，浓度均为o ．1 In01．L_1) 酶酚混合试剂：取酶试剂与酚试剂等体积混合而成。试验用水为二次蒸馏水。

1．2实验方法

取3支试管，分别标明“测定”、“标准”和“空白”，在测定管中加入20弘L 血清，标准管中加入20肛L 葡萄糖标准液，空白管中加入20“L蒸馏

水，各管中再加入3．o mL酶酚混合试剂，混匀。置37℃水浴中反应至显色完全，冷却到室温，用分光光度计选取其最大吸收波长为测定波长，空白调零，分别测定各管吸光度。按下式计算血糖含量血糖(㈣l·L-1) 一(A测／A 标准)×q际准

光谱学与光谱分析

2结果与讨论

2．1吸收光谱按实验方法测定不同酶酚混合试剂与同一样品显色后的吸收光谱，苯酚、2，4一二氯苯酚、2，6一二氯苯酚和间一苯二酚与4一AA 构成的偶联对测定葡萄糖时的最大吸收波长及相应的表观摩尔吸光系数(A一／m ，鼽／L·cml‘mol-1) 分别为：505，5．68×103；510，1．53×104；515，7．85×10。；485，2．27×10。。其中以2，4一二氯苯酚显色灵敏度最高，约为苯酚的3倍；间～苯二酚的显色灵敏度较低，为苯酚的o ．4倍。

2．2显色时间取5加1．L_1葡萄糖标准液分别用四种酶酚混合试剂0．5，0．4，0.3,0.2,0.1,0。在37℃恒温比色皿中显色，选取其最大吸收波长作为测定波长，立即进行时间扫描测试，4一AA-苯酚体系25 min显色完全，此后吸光度几乎不再随时间变化，可见该色原体系稳定性良好，只是灵敏度略低；4一AA 一2，4一二氯苯酚体系20 min显色完全，生成的有色化合物亦非常稳定，且显色灵敏度最高；4一AA-26一二氯苯酚体系显色完全所需时间为13 min ，但生成的有色化合物稳定性较差；间一苯二酚显色速度最快(仅为9min) 且生成的有色化合物稳定性好，其缺点是显色灵敏度较低。实验还发现，待测样品中葡萄糖浓度增高，到达反应点的时间缩短。临床检测中，由于血糖浓度分布范围较大，使用苯酚、2，4一二氯苯酚或间一苯二酚显色体系的显色时间分别以37℃水浴30，25，10 min为宜。2．3酶的浓度及介质酸度的选择试剂中酶的浓度对血糖测定影响较大，选用适当的可使反应在较短的时间内完成，且产物颜色稳定。实验发现，反应终溶液中GOD 或POD 用量少于4 U·L_1应速度明显变慢，到达显色终点的时间延长，酶用量过多又造成浪费。酶的活性亦受反应介质的酸度和温度的影响。GOD 和POD 在pH 6．6～8．o 范围均具有良好的催化活性，pH8．5时催化活性下降，且反应终点的吸光度降低。本试验选取GOD 和POD 的浓度均为6 U·L，测定介质为pH 7．2的磷酸盐缓冲液。2．4线性范围与检测限用四种酶酚混合试剂分别测定葡萄糖系列标准溶液的吸光度，得出各方法的线性回归方程、线性范围、相关系数及检测限(空白值的3倍标准偏差) ，可知4一AA_2，6一二氯苯酚显色体系的线性范围较窄，加之显色稳定性不高，不宜用于血糖测定，因此不再予以讨论。2．5精密度和回收率用三种不同酶酚混合试剂分别对不同血清样品进行精密度和加标回收试验。2．6样品测定用三种酶酚混合试剂分别测定样品中血糖含量。

光谱学与光谱分析

配对资料的t 检验表明，三种方法测定血糖的结果无显著性差异(P>o．05) 。结论苯酚、2，4一二氯苯酚及间一苯二酚三种苯原酚分别构成GoDPOD4一AA —Hz 02一酚显色体系测定血糖时，其检测结果均无显著性差异，但2，4一二氯苯酚显色体系的显色灵敏度方法的精密度和准确度均优于苯酚显色体系。问一苯二酚显色体系虽然灵敏度较低，但检测速度快，线性范围宽，可用于较高浓度葡萄糖溶液的在线快速分析。

血清葡萄糖测定是临床生物化学的常规检测方法。目前，葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖是国内外常用的检测方 法之一，酶法测定方法主要有葡萄糖氧化酶法

(GOD—POD) 、 已糖激酶法(HK)、葡萄糖脱氢酶法，以前两种检测方法较为 常见。己糖激酶法由于采用己糖激酶和辅酶，测定波长为 340hm，能有效避免血清中过氧化物、浊度和色素的影响，是目 前血糖测定中的参考方法¨J。但存在着试剂昂贵和受仪器限 制等不足之处，葡萄糖氧化酶法试剂比己糖激酶法试剂便宜， 是目前最常用的血糖测定方法。目前，国内厂商所提供的葡 萄糖氧化酶法的试剂测定大多采用单一试剂，易受血清中过 氧化物、胆红质、血红蛋白和色素等物质的干扰【21，且由于实 验方法为终点法，为尽快得到血糖结果，并排除一些物质的干 扰，本实验在葡萄糖氧化酶终点法的基础上，用两点酶动力学 方法测定血清中葡萄糖，测定快速，结果准确， 1材料与方法

1．1仪器

CIBA CORNING 565半自动生化分析仪。

1．2试剂

葡萄糖氧化酶试剂由保定长城临床试剂公司提供。生化

质控血清选用中生北控定值质控血清。

1．2．1

酶试剂 葡萄糖氧化酶(GOD)、过氧化物酶(POD)、4

一氨基安替比林(4一时lP) 、磷酸盐缓冲液(pH 7．4 PBS)。

1．2．3酶工作液配制按酶：酚：蒸馏水=3：3：3比例配制。

1．3方法

1．3．1原法(终点法) 根据试剂盒内说明进行。 1．3．2两点动力学：半

生化分析仪编制主要参数。

测定管、标准管、空白管分别加入工作液各l 如l ，启动仪

器进入工作状态，予温工作液，吸人工作液调零．当出现ASP

STAND 时，将20山标准液加入工作液中混匀，然后吸人，以

。标定因数，出现 ASP SAMPLE，将20一血清样品加入工作液

原法的线性范围 0—20 mmol／L ，两点法的线性范围0—

28 mmol／Lo

2 ．2精密度

用中生 2l 项质控血清分别做批内、批间20次，5干扰实验

本实验方法由于采用两点测定的固定时间法，仅测定工

作液生成醌亚胺量的吸光度增加值，因此，可部分消除脂血、

血红蛋白、胆红质、氟化钠一草酸钾等物质的干扰，但对过氧

化物的干扰仍无法消除。

2．3相关性 ．

原法与两点法之间高度相关，y 屎挂=8．22、x 两点法=8．10，=O．998X+0．136(r=0．999) 。参加省、市室间质评本法均取 得满意成绩。 2 ．4回收实验

把一定浓度的葡萄糖分别加到4份不同葡萄糖浓度的血 y

清中，再测定血清葡萄糖浓度，求出各自回收率，

2．5稳定性

测试温度为37'U ，本法定标后如采用因数，试剂在2qC 一8qC 可稳定一周，CV 值2．26％，工作液2℃一8℃存储可稳定。自从在Trinder 反应中应用葡萄糖氧化酶测定血糖以来，葡萄精氧化酶法已广泛应用于常规临床化学中，但也存在着一些物质和色素原的干扰，本法可部分避免一些物质的干扰。糖尿病的防治工作。特别是糖尿病酮症酸中毒等急症病人的抢救工作。

-葡萄糖含量的测定——碘量法

二、实验原理

I 2与NaOH 作用可生成次碘酸钠(NaIO)，次碘酸钠可将葡萄糖(C6H 12O 6) 分子中的醛基定量地氧化为羧基。未与葡萄糖作用的次碘酸钠在碱性溶液中歧化生成NaI 和NaIO 3，当酸化时NaIO 3又恢复成I 2析出，用Na 2S 2O 3标准溶液滴定析出的I 2，从而可计算出葡萄糖的含量。涉及到的反应如下：

1) I2与NaOH 作用生成NaIO 和NaI ：

I 2 + 2OH- = IO- + I- + H2O

2) C6H 12O 6和NaIO 定量作用：

C 6H 12O 6 + IO- = C6H 12O 7 + I-

总反应式为：I 2 + C6H 12O 6 + 2OH- = C6H 12O 7 + 2I- + H2O

3) 未与葡萄糖作用的NaIO 在碱性溶液中歧化成NaI 和NaIO 3：

3IO - = IO3- + 2I-

4) 在酸性条件下，NaIO 3又恢复成I 2析出：

IO 3- + 5I- + 6H+ = 3I2 + 3H2O

5) 用Na 2S 2O 3滴定析出的I 2

I 2 + 2S2O 32- = S4O 62- + 2I-

因为1mol 葡萄糖与1molI 2作用，而1molIO -可产生1molI 2从而可以测定出葡萄糖的含量。

三、仪器与试剂

分析天平、台秤、烧杯、酸式滴定管、碱式滴定管、容量瓶(250mL)、移液管(25mL)、锥形瓶(250mL)、碘量瓶(250mL)

I 2(s)(A.R.)、KI(s)(A.R.)、Na 2S 2O 3(s)(A.R.)、Na 2CO 3(s)(A.R.)、K 2Cr 2O 7(s)(A.R. ，于140℃电烘箱中干燥2h ，贮于干燥器中备用) 、KI(20%)、

HCl(6mol·L ) 、淀粉溶液(0.5%)、NaOH(2mol·L ) 、葡萄糖试样(0.05%)。 －１－１

四、实验步骤

葡萄糖含量的测定

移取25.00mL 葡萄糖试液于碘量瓶中，从酸式滴定管中加入25.00mL I2标准溶液。一边摇动，一边缓慢加入2mol·L 1NaOH 溶液1、学会间接碘量法测定葡萄糖含量的方法原理，进一步掌握返滴定法技能。

2、进一步熟悉酸滴定管的操作，掌握有色溶液滴定时体积的正确读法。 -二、实验原理

I 2与NaOH 作用可生成次碘酸钠(NaIO)，次碘酸钠可将葡萄糖(C6H 12O 6) 分子中的醛基定量地氧化为羧基。未与葡萄糖作用的次碘酸钠在碱性溶液中歧化生成NaI 和NaIO 3，当酸化时NaIO 3又恢复成I 2析出，用Na 2S 2O 3标准溶液滴定析出的I 2，从而可计算出葡萄糖的含量。涉及到的反应如下：

1) I2与NaOH 作用生成NaIO 和NaI ：

I 2 + 2OH- = IO- + I- + H2O

2) C6H 12O 6和NaIO 定量作用：

C 6H 12O 6 + IO- = C6H 12O 7 + I-

总反应式为：I 2 + C6H 12O 6 + 2OH- = C6H 12O 7 + 2I- + H2O

3) 未与葡萄糖作用的NaIO 在碱性溶液中歧化成NaI 和NaIO 3：

3IO - = IO3- + 2I-

4) 在酸性条件下，NaIO 3又恢复成I 2析出：

IO 3- + 5I- + 6H+ = 3I2 + 3H2O

5) 用Na 2S 2O 3滴定析出的I 2

I 2 + 2S2O 32- = S4O 62- + 2I-

因为1mol 葡萄糖与1molI 2作用，而1molIO -可产生1molI 2从而可以测定出葡萄糖的含量。

三、仪器与试剂

分析天平、台秤、烧杯、酸式滴定管、碱式滴定管、容量瓶(250mL)、移液管(25mL)、锥形瓶(250mL)、碘量瓶(250mL)

I 2(s)(A.R.)、KI(s)(A.R.)、Na 2S 2O 3(s)(A.R.)、Na 2CO 3(s)(A.R.)、K 2Cr 2O 7(s)(A.R. ，于140℃电烘箱中干燥2h ，贮于干燥器中备用) 、KI(20%)、HCl(6mol·L －１) 、淀粉溶液(0.5%)、NaOH(2mol·L －１) 、葡萄糖试样(0.05%)。

四、实验步骤

葡萄糖含量的测定

移取25.00mL 葡萄糖试液于碘量瓶中，从酸式滴定管中加入25.00mL I2标准溶液。一边摇动，一边缓慢加入2mol·L ，直至溶液呈浅黄色。将碘量瓶加塞放置10～15min 后，加2mL 6mol·L -1HCl 使成酸性，立即用Na 2S 2O 3溶液滴定至溶液呈淡黄色时，加入2mL 淀粉指示剂，继续滴定蓝色消失即为终点。平行测定三次，计算试样中葡萄糖的含量(以g·L -1表示) ，要求相对平均偏差小于0.3%。

注释

一定要待I 2完全溶解后再转移。做完实验后，剩余的I2溶液应倒入回收瓶中。

碘易受有机物的影响，不可使用软木塞、橡皮塞，并应贮存于棕色瓶内避光保存。配制和装液时应戴上手套。I 2溶液不能装在碱式滴定管中。

本方法可视作葡萄糖注射液中葡萄糖含量的测定。测定时可视注射液的浓度将其适当稀释。

无碘量瓶时可用锥形瓶盖上表面皿代替。

加NaOH 的速度不能过快，否则过量NaIO 来不及氧化C 6H 12O 6就歧化成与C 6H 12O 6反应的NaIO 3和NaI ，使测定结果偏低。

在氧化微葡萄糖时滴加NaOH 的速度要慢，且加完后要放置一段时间？而在酸化后则要立即用Na 2S 2O 3标准溶液滴定，IO -在氧化微葡萄糖时滴加NaOH 的速度要慢，否则过量的IO -还来不及和葡萄糖反应就歧化为氧化性较差的IO 3-，可能导致葡萄糖不能完全被氧化。在碱性溶液中生成的IO 3-和I -在酸化时又生成I 2，而I 2易挥发，所以酸化后要立即滴定。

参考文献

1. 王乐新; 赵志敏; 姚红兵 血液的红外吸收光谱分析及应用研究[期刊论文]- 光谱学与光谱分析 2002(06)

2. 黄应平 血红蛋白作为过氧化物模拟酶催化显色体系的研究与应用

[期刊论文]- 分析化学 2001(04)

3. 邱江; 潘红春; 韩崇家光谱学与光谱分析) ，1999(06)

4. Rairo Reljic 1992(04)

5. 李忠琴. 许小平. 王武 双酶偶联催化分光光度法测定血清次黄嘌呤[期刊论文]- 光谱学与光谱分析 2008(9)

6. 邓健. 廖力夫. 吕笑笑. 刘传湘. 匡艳华 尿海藻糖酶活性催化光度法测定[期刊论文]- 中国公共卫生 2008(1)

7. 李忠琴. 邬敏辰. 许小平. 王武 偶联酶催化分光光度法测定黄嘌呤[期刊论文]- 化学通报（印刷版） 2007(7)

8. 周序开，中华医学检验杂志，1982，5(1)：56

9. 朱忠勇 实用医学检验学 1997

10. 中华人民共和国卫生部医政司 全国临床检验操

作规程 2006

生物化学研究进展

作业

题目 用三种方法测定血清葡萄糖

姓名 朱 军 光

学号 1017104111

班级专业 农业资源与环境专业

题目：用各种方法测定血清葡萄糖

姓名：朱军光

专业：农业资源与环境专业

摘 要：不同苯原酚化合物用于GOD-Trinder 法测定血糖的比较研究和GOD-POD 方法结合两点法测定血糖和葡萄糖含量的测定——碘量法

。对苯酚、2,4-二氯苯酚、2,6-二氯苯酚及间-苯二酚等四种苯原酚化合物作为过氧化酶（POD ）催化4-氨基安替比林（4-AA ）-过氧化氢一酚显色体系测定血糖的葡萄糖氧化酶法(GODTrinder)进行比较研究。 结果表明，苯酚、2，4一二氯苯酚及间一苯二酚三种苯原酚分别构成GODPOD4一A”HzQ一酚显色体系测定血 糖时，其检测结果均无显著性差异(P>o．05) ，但2，4一二氯苯酚显色体系的显色灵敏度、方法的精密度和准 确度均优于苯酚显色体系。间一苯二酚显色体系灵敏度不及苯酚，但检测速度快，线性范围宽，可用于较高浓 度葡萄糖溶液的在线快速分析。用GOD —POD 方法结合两点法测定血清葡萄糖，葡萄糖含量的测定——碘量法 。

关键词：葡萄糖；血清；葡萄糖氧化酶；过氧化物酶；生物化学检验：GOD —POD 两点法；葡萄糖含量的测定——碘量法

正文

己糖激酶法(HK)和葡萄糖氧化酶(GOD)法已得到普遍应用。GOD 法又可分为速率法和比色法，后者即G0n Trinder法，采用葡萄糖氧化酶偶联过氧化物酶(POD)，以4一氨基安替比林(4一AA) 一HzQ 一苯酚作为显色体系[7]，由于具有特异性强、操作简单等优点，已成为目前血糖测定的常规。光谱学与光谱分析，不同苯原酚化合物用于GOD —Trinder 法测定血糖的比较研究，方法，其缺点是灵敏度较低。本文用苯酚、2，4一二氯苯酚、2，6一二氯苯酚及间一苯二酚等四种苯原酚分别与4一AA_Hz 02构成显色体系测定血糖，并对其进行方法学比较研究，以寻求更为灵敏、准确、快速的血糖测定方法，取得满意结果。

1实验部分

1．1仪器与试剂 SP-2100型分光光度计(计算机控制) ，pH3C 型数字式酸度计，CS501型超级恒温箱。o ．1 n101．L-1磷酸盐缓冲液(pH 7．o) ；葡萄糖标准液；酶试剂(含GOD ，POD ，4一AA ，用O ．1m01．L_1磷酸盐缓冲液配制) ；酚试剂(分别为苯酚溶液，2，4一二氯苯酚溶液，2，6一二氯苯酚溶液，间一苯二酚溶液，浓度均为o ．1 In01．L_1) 酶酚混合试剂：取酶试剂与酚试剂等体积混合而成。试验用水为二次蒸馏水。

1．2实验方法

取3支试管，分别标明“测定”、“标准”和“空白”，在测定管中加入20弘L 血清，标准管中加入20肛L 葡萄糖标准液，空白管中加入20“L蒸馏

水，各管中再加入3．o mL酶酚混合试剂，混匀。置37℃水浴中反应至显色完全，冷却到室温，用分光光度计选取其最大吸收波长为测定波长，空白调零，分别测定各管吸光度。按下式计算血糖含量血糖(㈣l·L-1) 一(A测／A 标准)×q际准

光谱学与光谱分析

2结果与讨论

2．1吸收光谱按实验方法测定不同酶酚混合试剂与同一样品显色后的吸收光谱，苯酚、2，4一二氯苯酚、2，6一二氯苯酚和间一苯二酚与4一AA 构成的偶联对测定葡萄糖时的最大吸收波长及相应的表观摩尔吸光系数(A一／m ，鼽／L·cml‘mol-1) 分别为：505，5．68×103；510，1．53×104；515，7．85×10。；485，2．27×10。。其中以2，4一二氯苯酚显色灵敏度最高，约为苯酚的3倍；间～苯二酚的显色灵敏度较低，为苯酚的o ．4倍。

2．2显色时间取5加1．L_1葡萄糖标准液分别用四种酶酚混合试剂0．5，0．4，0.3,0.2,0.1,0。在37℃恒温比色皿中显色，选取其最大吸收波长作为测定波长，立即进行时间扫描测试，4一AA-苯酚体系25 min显色完全，此后吸光度几乎不再随时间变化，可见该色原体系稳定性良好，只是灵敏度略低；4一AA 一2，4一二氯苯酚体系20 min显色完全，生成的有色化合物亦非常稳定，且显色灵敏度最高；4一AA-26一二氯苯酚体系显色完全所需时间为13 min ，但生成的有色化合物稳定性较差；间一苯二酚显色速度最快(仅为9min) 且生成的有色化合物稳定性好，其缺点是显色灵敏度较低。实验还发现，待测样品中葡萄糖浓度增高，到达反应点的时间缩短。临床检测中，由于血糖浓度分布范围较大，使用苯酚、2，4一二氯苯酚或间一苯二酚显色体系的显色时间分别以37℃水浴30，25，10 min为宜。2．3酶的浓度及介质酸度的选择试剂中酶的浓度对血糖测定影响较大，选用适当的可使反应在较短的时间内完成，且产物颜色稳定。实验发现，反应终溶液中GOD 或POD 用量少于4 U·L_1应速度明显变慢，到达显色终点的时间延长，酶用量过多又造成浪费。酶的活性亦受反应介质的酸度和温度的影响。GOD 和POD 在pH 6．6～8．o 范围均具有良好的催化活性，pH8．5时催化活性下降，且反应终点的吸光度降低。本试验选取GOD 和POD 的浓度均为6 U·L，测定介质为pH 7．2的磷酸盐缓冲液。2．4线性范围与检测限用四种酶酚混合试剂分别测定葡萄糖系列标准溶液的吸光度，得出各方法的线性回归方程、线性范围、相关系数及检测限(空白值的3倍标准偏差) ，可知4一AA_2，6一二氯苯酚显色体系的线性范围较窄，加之显色稳定性不高，不宜用于血糖测定，因此不再予以讨论。2．5精密度和回收率用三种不同酶酚混合试剂分别对不同血清样品进行精密度和加标回收试验。2．6样品测定用三种酶酚混合试剂分别测定样品中血糖含量。

光谱学与光谱分析

配对资料的t 检验表明，三种方法测定血糖的结果无显著性差异(P>o．05) 。结论苯酚、2，4一二氯苯酚及间一苯二酚三种苯原酚分别构成GoDPOD4一AA —Hz 02一酚显色体系测定血糖时，其检测结果均无显著性差异，但2，4一二氯苯酚显色体系的显色灵敏度方法的精密度和准确度均优于苯酚显色体系。问一苯二酚显色体系虽然灵敏度较低，但检测速度快，线性范围宽，可用于较高浓度葡萄糖溶液的在线快速分析。

血清葡萄糖测定是临床生物化学的常规检测方法。目前，葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖是国内外常用的检测方 法之一，酶法测定方法主要有葡萄糖氧化酶法

(GOD—POD) 、 已糖激酶法(HK)、葡萄糖脱氢酶法，以前两种检测方法较为 常见。己糖激酶法由于采用己糖激酶和辅酶，测定波长为 340hm，能有效避免血清中过氧化物、浊度和色素的影响，是目 前血糖测定中的参考方法¨J。但存在着试剂昂贵和受仪器限 制等不足之处，葡萄糖氧化酶法试剂比己糖激酶法试剂便宜， 是目前最常用的血糖测定方法。目前，国内厂商所提供的葡 萄糖氧化酶法的试剂测定大多采用单一试剂，易受血清中过 氧化物、胆红质、血红蛋白和色素等物质的干扰【21，且由于实 验方法为终点法，为尽快得到血糖结果，并排除一些物质的干 扰，本实验在葡萄糖氧化酶终点法的基础上，用两点酶动力学 方法测定血清中葡萄糖，测定快速，结果准确， 1材料与方法

1．1仪器

CIBA CORNING 565半自动生化分析仪。

1．2试剂

葡萄糖氧化酶试剂由保定长城临床试剂公司提供。生化

质控血清选用中生北控定值质控血清。

1．2．1

酶试剂 葡萄糖氧化酶(GOD)、过氧化物酶(POD)、4

一氨基安替比林(4一时lP) 、磷酸盐缓冲液(pH 7．4 PBS)。

1．2．3酶工作液配制按酶：酚：蒸馏水=3：3：3比例配制。

1．3方法

1．3．1原法(终点法) 根据试剂盒内说明进行。 1．3．2两点动力学：半

生化分析仪编制主要参数。

测定管、标准管、空白管分别加入工作液各l 如l ，启动仪

器进入工作状态，予温工作液，吸人工作液调零．当出现ASP

STAND 时，将20山标准液加入工作液中混匀，然后吸人，以

。标定因数，出现 ASP SAMPLE，将20一血清样品加入工作液

原法的线性范围 0—20 mmol／L ，两点法的线性范围0—

28 mmol／Lo

2 ．2精密度

用中生 2l 项质控血清分别做批内、批间20次，5干扰实验

本实验方法由于采用两点测定的固定时间法，仅测定工

作液生成醌亚胺量的吸光度增加值，因此，可部分消除脂血、

血红蛋白、胆红质、氟化钠一草酸钾等物质的干扰，但对过氧

化物的干扰仍无法消除。

2．3相关性 ．

原法与两点法之间高度相关，y 屎挂=8．22、x 两点法=8．10，=O．998X+0．136(r=0．999) 。参加省、市室间质评本法均取 得满意成绩。 2 ．4回收实验

把一定浓度的葡萄糖分别加到4份不同葡萄糖浓度的血 y

清中，再测定血清葡萄糖浓度，求出各自回收率，

2．5稳定性

测试温度为37'U ，本法定标后如采用因数，试剂在2qC 一8qC 可稳定一周，CV 值2．26％，工作液2℃一8℃存储可稳定。自从在Trinder 反应中应用葡萄糖氧化酶测定血糖以来，葡萄精氧化酶法已广泛应用于常规临床化学中，但也存在着一些物质和色素原的干扰，本法可部分避免一些物质的干扰。糖尿病的防治工作。特别是糖尿病酮症酸中毒等急症病人的抢救工作。

-葡萄糖含量的测定——碘量法

二、实验原理

I 2与NaOH 作用可生成次碘酸钠(NaIO)，次碘酸钠可将葡萄糖(C6H 12O 6) 分子中的醛基定量地氧化为羧基。未与葡萄糖作用的次碘酸钠在碱性溶液中歧化生成NaI 和NaIO 3，当酸化时NaIO 3又恢复成I 2析出，用Na 2S 2O 3标准溶液滴定析出的I 2，从而可计算出葡萄糖的含量。涉及到的反应如下：

1) I2与NaOH 作用生成NaIO 和NaI ：

I 2 + 2OH- = IO- + I- + H2O

2) C6H 12O 6和NaIO 定量作用：

C 6H 12O 6 + IO- = C6H 12O 7 + I-

总反应式为：I 2 + C6H 12O 6 + 2OH- = C6H 12O 7 + 2I- + H2O

3) 未与葡萄糖作用的NaIO 在碱性溶液中歧化成NaI 和NaIO 3：

3IO - = IO3- + 2I-

4) 在酸性条件下，NaIO 3又恢复成I 2析出：

IO 3- + 5I- + 6H+ = 3I2 + 3H2O

5) 用Na 2S 2O 3滴定析出的I 2

I 2 + 2S2O 32- = S4O 62- + 2I-

因为1mol 葡萄糖与1molI 2作用，而1molIO -可产生1molI 2从而可以测定出葡萄糖的含量。

三、仪器与试剂

分析天平、台秤、烧杯、酸式滴定管、碱式滴定管、容量瓶(250mL)、移液管(25mL)、锥形瓶(250mL)、碘量瓶(250mL)

I 2(s)(A.R.)、KI(s)(A.R.)、Na 2S 2O 3(s)(A.R.)、Na 2CO 3(s)(A.R.)、K 2Cr 2O 7(s)(A.R. ，于140℃电烘箱中干燥2h ，贮于干燥器中备用) 、KI(20%)、

HCl(6mol·L ) 、淀粉溶液(0.5%)、NaOH(2mol·L ) 、葡萄糖试样(0.05%)。 －１－１

四、实验步骤

葡萄糖含量的测定

移取25.00mL 葡萄糖试液于碘量瓶中，从酸式滴定管中加入25.00mL I2标准溶液。一边摇动，一边缓慢加入2mol·L 1NaOH 溶液1、学会间接碘量法测定葡萄糖含量的方法原理，进一步掌握返滴定法技能。

2、进一步熟悉酸滴定管的操作，掌握有色溶液滴定时体积的正确读法。 -二、实验原理

I 2与NaOH 作用可生成次碘酸钠(NaIO)，次碘酸钠可将葡萄糖(C6H 12O 6) 分子中的醛基定量地氧化为羧基。未与葡萄糖作用的次碘酸钠在碱性溶液中歧化生成NaI 和NaIO 3，当酸化时NaIO 3又恢复成I 2析出，用Na 2S 2O 3标准溶液滴定析出的I 2，从而可计算出葡萄糖的含量。涉及到的反应如下：

1) I2与NaOH 作用生成NaIO 和NaI ：

I 2 + 2OH- = IO- + I- + H2O

2) C6H 12O 6和NaIO 定量作用：

C 6H 12O 6 + IO- = C6H 12O 7 + I-

总反应式为：I 2 + C6H 12O 6 + 2OH- = C6H 12O 7 + 2I- + H2O

3) 未与葡萄糖作用的NaIO 在碱性溶液中歧化成NaI 和NaIO 3：

3IO - = IO3- + 2I-

4) 在酸性条件下，NaIO 3又恢复成I 2析出：

IO 3- + 5I- + 6H+ = 3I2 + 3H2O

5) 用Na 2S 2O 3滴定析出的I 2

I 2 + 2S2O 32- = S4O 62- + 2I-

因为1mol 葡萄糖与1molI 2作用，而1molIO -可产生1molI 2从而可以测定出葡萄糖的含量。

三、仪器与试剂

分析天平、台秤、烧杯、酸式滴定管、碱式滴定管、容量瓶(250mL)、移液管(25mL)、锥形瓶(250mL)、碘量瓶(250mL)

I 2(s)(A.R.)、KI(s)(A.R.)、Na 2S 2O 3(s)(A.R.)、Na 2CO 3(s)(A.R.)、K 2Cr 2O 7(s)(A.R. ，于140℃电烘箱中干燥2h ，贮于干燥器中备用) 、KI(20%)、HCl(6mol·L －１) 、淀粉溶液(0.5%)、NaOH(2mol·L －１) 、葡萄糖试样(0.05%)。

四、实验步骤

葡萄糖含量的测定

移取25.00mL 葡萄糖试液于碘量瓶中，从酸式滴定管中加入25.00mL I2标准溶液。一边摇动，一边缓慢加入2mol·L ，直至溶液呈浅黄色。将碘量瓶加塞放置10～15min 后，加2mL 6mol·L -1HCl 使成酸性，立即用Na 2S 2O 3溶液滴定至溶液呈淡黄色时，加入2mL 淀粉指示剂，继续滴定蓝色消失即为终点。平行测定三次，计算试样中葡萄糖的含量(以g·L -1表示) ，要求相对平均偏差小于0.3%。

注释

一定要待I 2完全溶解后再转移。做完实验后，剩余的I2溶液应倒入回收瓶中。

碘易受有机物的影响，不可使用软木塞、橡皮塞，并应贮存于棕色瓶内避光保存。配制和装液时应戴上手套。I 2溶液不能装在碱式滴定管中。

本方法可视作葡萄糖注射液中葡萄糖含量的测定。测定时可视注射液的浓度将其适当稀释。

无碘量瓶时可用锥形瓶盖上表面皿代替。

加NaOH 的速度不能过快，否则过量NaIO 来不及氧化C 6H 12O 6就歧化成与C 6H 12O 6反应的NaIO 3和NaI ，使测定结果偏低。

在氧化微葡萄糖时滴加NaOH 的速度要慢，且加完后要放置一段时间？而在酸化后则要立即用Na 2S 2O 3标准溶液滴定，IO -在氧化微葡萄糖时滴加NaOH 的速度要慢，否则过量的IO -还来不及和葡萄糖反应就歧化为氧化性较差的IO 3-，可能导致葡萄糖不能完全被氧化。在碱性溶液中生成的IO 3-和I -在酸化时又生成I 2，而I 2易挥发，所以酸化后要立即滴定。

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5. 李忠琴. 许小平. 王武 双酶偶联催化分光光度法测定血清次黄嘌呤[期刊论文]- 光谱学与光谱分析 2008(9)

6. 邓健. 廖力夫. 吕笑笑. 刘传湘. 匡艳华 尿海藻糖酶活性催化光度法测定[期刊论文]- 中国公共卫生 2008(1)

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作规程 2006