果树学报2010，27（2）:207～212
Journal of Fruit Science
基于EST 数据库的葡萄APETALA2基因
cDNA 克隆及其表达分析
王
晨，刘
洪，房经贵*，宋长年，曹
雪，杨
光，章
镇
（南京农业大学园艺学院，南京210095）
摘
要：APETALA2（AP2）是拟南芥生长发育特别是花器官发育过程中重要的调控基因。利用生物信息学方法以拟
南芥APETALA2基因cDNA 序列作为模板，对葡萄EST 数据库进行同源检索筛选，电子克隆出葡萄AP2基因（Vv-
AP2）cDNA 序列。以香悦葡萄花cDNA 为模板，根据电子克隆的葡萄AP2基因cDNA 序列设计特异引物，分别利用RACE 技术和特异PCR 技术获得该基因3’末端和5’末端，序列拼接后获得葡萄的APETALA2基因的cDNA 全长。
该cDNA 的全长为2208bp ，命名为Vv-AP2。Vv-AP2核苷酸序列有一个1536bp 完整的开放读码框（ORF ），其5’与3’末端非翻译区分别为268bp 和376bp 。其中，3’末端含有28bp 的Ploy +（A ）。该基因在GenBank 基因数据库的注册号为FJ809943。氨基酸推导结果表明该cDNA 共编码了511个氨基酸，具备完全保守的核定位信号序列（KKSR ）以及2个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR 和SYBR Green I 实时定量RT-PCR 初步分析了Vv-AP2在葡萄叶、茎、花序、花等不同器官中的表达水平。其中，Vv-AP2在花序和花中的表达量明显高于叶和茎。
关键词：葡萄；Vv-AP2；基因克隆；表达分析中图分类号：S663．1
文献标识码：A
文章编号：1009－9980(2010)02－207－06
Cloning and expression analysis of APETALA2gene from grapevine （Vitis vinifera ）based on EST database
WANG Chen ，LIU Hong ，FANG Jing-gui *，SONG Chang-nian ，CAO Xue ，YANG Guang ，ZHANG Zhen
（College of Horticulture ，Nanjing Agricultural University ，Nanjing ，Jiangsu 210095China ）
Abstract :APETALA2（AP2）plays an important role in Arabidopsis development ，especially in the development of flower or -gans. Based on the relative conservation of plant homologous genes ，a full-length Vitis vinifera homologue of AP2（Vv-AP2）was bioinformatically cloned in this study. Accordingly ，the 5’-and 3’-end sequences were obtained from cDNA of flower of Xiang yue grapevine cultivar by 3’RACE and specific PCR with two gene-specific primers designed against the Vv-AP2se -quence ，based on the full length cDNA of Vv-AP2（2208bp ）which was spliced. This Vv-AP2cDNA included an open reading frame （ORF ）of 1536nucleotides ，5’-untranslated region （UTR ）of 268bp ，and 3'-UTR of 376bp. The 3’-UTR contains a Poly +（A ）of 28bp. The sequence has been deposited in GenBank database with the accession number of FJ809943. The deduced amino acid sequence of Vv-AP2includes 551amino acids ，contains a putative nuclear localization signal sequence （KKSR ）and two highly conserved AP2domains. The semi-quantitative RT-PCR and SYBR Green I Real-time qRT-PCR were employed to analyze the expression of Vv-AP2in different organs of grapevine and the result showed that Vv-AP2is expressed in much higher level in inflorescence and flower than that in leaf and stem. Key words :Grapevine ；Vv-AP2；Gene cloning ；Expression
APETALA2（AP2）是拟南芥一系列调节花发育的重要基因之一。AP2编码一个转录因子，其最明显
的功能是参与调控花器官和种子的发育[1-4]。AP2在拟南芥的所有营养器官及种子发育的各个阶段均有表达，其不仅调控花分生组织特异性、花器官特异
收稿日期：2009－05－04
接受日期:2009－08－03
基金项目：国家博士后基金（[1**********]）
性、花器官数量、种子产量，而且在保持茎端分生组织中干细胞小区等方面也起着重要作用[5-7]，有关其生理作用以及调控功能的研究一直受到重视。Lauter 等[8]在玉米中研究发现，AP2的同源基因（glossy15）在幼叶向成熟叶以及营养生长向生殖生长的转型方
作者简介：王晨，硕士，研究方向为果树基因组学。Tel ：[1**********]，E-mail ：[email protected]
觹通讯作者。Author for correspondence．Tel:025-84399069, E-mail ：[email protected]
208
果树学报27卷
面具有重要调控作用。因此，该基因可能在植物的整个生长发育过程，尤其是发育阶段的转变及生殖器官的发育中发挥重要作用。目前已经从拟南芥[1]、苹果[9]、草莓[10]、番茄[11]、玉米[8]、矮牵牛[12]等植物中克隆到了AP2的同源基因。在矮牵牛和烟草的研究中还发现
[12-13]
1
1.1
材料和方法
电子克隆
根据不同物种间同源基因的核酸序列相对保守
的特点，在GenBank 的核酸（nr/nt）数据库中检索拟南芥的AP2基因序列（U12546），并以U12546序列为探针对葡萄属EST 数据库进行BLAST 检索，获得与拟南芥AP2基因同源的葡萄EST 片段；从获得的葡萄EST 片段中选出同源性最高的一条
：它们的AP2同源基因与拟南芥中的
AP2基因功能不尽相同，说明不同植物间AP2同源
基因在功能上存在着一定的差异。在不同植物上开展AP2同源基因功能的分析对于认识基因的功能特点以及进一步利用具有重要意义。
葡萄（Vitis vinifera ）是世界性的重要果树之一，也是继拟南芥、水稻、杨树之后完成全基因测序的第
EV231889，再对葡萄EST 数据库进行BLAST 检索，
得到多条与之高度同源的葡萄EST 序列。将获得的
EST 序列用DNAStar 软件进行首尾拼接，获得新的Contig ，进一步将获得的Contig 反复对葡萄EST 公共数据库进行BLAST 检索、拼接，最后获得目的基
因的电子克隆全长cDNA 。
4种开花植物[14-15]。葡萄一直是基因组学与后基因组
学研究的重要植物材料，也是分子生物学研究的重要对象。Boss 等[16]在2000年预测在将来的20年中对葡萄基因以及基因功能的认识将促进通过基因工程手段对葡萄结果能力、果实成熟期以及植株生长习性等进行更有效调控。所有这些必将对葡萄产量与品质以及田间管理的操作产生重要影响。葡萄全基因组的测序无疑为这一预测的实现提供了重要保障。在葡萄上开展AP2基因功能的分析，不仅对认识葡萄花器官发育与童期的转变等有着重要的理论价值，而且对在农业生产中更有效地利用该基因也具有重要的意义。我们采用生物信息学的方法以拟南芥AP2的基因序列为模板，对葡萄EST 数据库进行反复同源筛选、延伸，获得葡萄AP2cDNA 的全长序列，并以香悦葡萄花cDNA 为模板，经RACE 技术、电子克隆和RT-PCR 技术获得葡萄的cDNA 全长，命名为VvAP2，并对其核苷酸及氨基酸序列特征以及在葡萄不同器官中的表达进行了分析。
表1
1.21.2.1
实验克隆材料
3a 生葡萄的叶、茎（茎为当年新梢顶
部第2、3、4节间的茎段）、花序、花（花为未盛开的花朵）于2008年4月下旬到6月下旬采自江苏省南京市江宁区汤山果园（南京农业大学试验基地）。大肠杆菌（Escherichia coli ）菌株DH5α由本实验室保存。
PowerScript II TM 反转录酶购自Clontech 公司，DNase 酶Ⅰ、LA-Taq 酶、Ex-Taq 酶、pMD-18T 载体、dNTP 、DNA Marker 购自TaKaRa 公司，Trizol Reagent 购自Invitrogen 公司，荧光定量染料SYBR Green Ⅰ购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，DNA 回收试剂
盒、DL 2000Plus DNA Marker 为北京全式金生物技术有限公司生产。各种引物由上海英俊生物技术有限公司（Invitrogen ）合成，其编号及序列见表1。
1.2.2RNA 提取与纯化花组织总RNA 的提取按
引物序列及预期片段大小
Table 1Sequence of primers and pre-production length
编号
序列
预期片段大小
用途
Code No. P01P02P03P04P05P06P07P08P09P10P11P12
Sequence (5'-3')
30VN AACTGGAAGATGGGAATCTCATATATGGG GCAGGACTGCAGCTGACTGACTAC TATTGGGCAGTTGAGGATAGACG
CATGGGTCACTGAGAAGCCGAATATTTTACTG GCTCGCTGTTTTGCAGTTCTAC AACATAGGTGAGGCCGCACTT AGCCCCACCATACCATGTAA CCTCTTCATATCCCCCAACA
Predicted size of amplified product/bpUse
cDNA 合成cDNA synthesis
扩增Vv-AP2基因3' 端3'-end amplification 扩增Vv-AP2基因5' 端5'-end amplification Vv-AP2基因ORF 扩增Complete ORF amplification 扩增ubi
Ubi amplification 定量RT-PCR
Quantitative RT-PCR
±[**************]20
注：粗线和双下划线是相互匹配的引物与接头；下划线为添加的酶切位点，GAGCTC 为Sac I ，GGATCC 为Bam H I 。
Note:Thick line and double underline shading denotes matching primers or adaptors; GAGCTC and GGATCC underlined in primers indicates restriction enzyme sites of Sac I and Bam H I.
2期王晨等:基于EST 数据库的葡萄APETALA2基因cDNA 克隆及其表达分析209
照Trizol Reagent 说明书进行。mRNA 的纯化采用
mRNA Isolation Promega 公司生产的PloyATtract 1
达特点。为确保半定量RT-PCR 和实时荧光定量
PCR 的特异性，引物P11与P12被设计在Vv-AP2
基因的3’非翻译区（3’UTR ）。内标基因是利用葡萄
System IV 试剂盒进行。1.2.3
cDNA 合成
以mRNA 为模板，引物P01反
转录合成cDNA 第一条链，引物P02延伸加帽子，空气加热条件下42℃保温1h ，75℃保温10min ，冰上冷却2min 后，-70℃保存备用。
Ubi 的特异性引物（P09和P10）PCR 扩增获得的长
度为141bp 的基因片断。利用Rotor-Gene 荧光定量
PCR 仪进行实时定量RCR 的反应体系按SYBR Green Ⅰ（TOYOBO ）说明书进行，其优化后的反应条
件为：95℃预变性60s ，95℃15s 、57℃15s ，72℃20s 、45个循环，每实验3次重复，实验数据用Lin -RegPCR （Ramakers et al. ，2003）[17]和Excel 软件分
析。
1.2.4基因3’和5’末端PCR 扩增以cDNA 为模
板用引物P03/P04进行PCR 扩增获得基因的3’末端（3’UTR 区）。反应体系为50μL ：LA-Taq 酶0.50
μL ，10×PCR buffer （Mg 2＋plus ）5μL ，dNTP Mixture 4μL ，cDNA 2μL ，引物各1μL ，反应参数为94℃预变性3min ，5个循环，94℃30s 、70℃30s 、72℃3min 、5个循环，94℃30s 、68℃30s 、72℃3min 、25个循环，72℃延伸10min 。琼脂糖凝胶电泳检测
后用DNA 回收试剂盒回收目标片段进行T/A克隆，
2
2.1
结果与分析
葡萄Vv-AP2cDNA 全长的电子克隆
利用拟南芥U12546为信息探针，对葡萄EST
数据库进行BLAST 检索，得到1个保守性高的EST 序列EV231889，然后以此序列作为种子序列
DNA 测序由上海博亚生物技术有限公司完成（下同）。用电子克隆获得基因的5’末端（5’UTR 区），再
根据电子克隆的序列，设计特异引物P05/P06，进行特异PCR 获得基因的5’末端。反应参数为94℃预变性3min ，94℃30s 、60℃30s 、72℃2min 、35个循环，72℃延伸10min 。反应体系同3’末端扩增。
BLAST 检索葡萄EST 数据库，将检出的与种子序列同源性较高的或有部分重叠的EST 序列（CB922024，CF511859，CB974375，EC953584，CF511859，EV231890，CB974442）拼接组装为重叠群（Contig ），再以此重叠群序列重复以上BLAST 检
索过程，反复进行EST 重叠群序列的拼接和比对，最后获得长度为2208bp 的Vv-AP2cDNA 全长序列。
1.2.5基因ORF 的扩增以cDNA 为模板用引物
P07/P08进行PCR 扩增，反应体系为50μL ：cDNA 2μL ，引物各2μL ，Ex -Taq 酶0.50μL ，10×PCR buffer （Mg 2＋plus ）5μL ，dNTP Mixture 4μL ，cDNA 2μL ，引物各1μL ，反应参数同上。
1.2.6生物信息学分析利用DNAMAN5.22软件
对Vv-AP2的ORF 、3’末端和5’末端等3个序列进行拼接分析；该基因的核苷酸和氨基酸序列分别利用NCBI 的BLASTn 和BLASTp （http://blast.ncbi.nlm.
2.2葡萄Vv-AP2cDNA 全长的获得
根据电子克隆的Vv-AP2的cDNA 全长设计特
异引物P03，以葡萄花器官来源cDNA 为模板，与引物P04进行3’RACE 扩增，经克隆测序得到该基因的3’末端（1012bp ），用电子克隆得到该基因的生物信息学的5’末端，即5’UTR 区（268bp ），根据电子克隆的序列设计特异引物P05/P06，并用特异
nih.gov/Blast.cgi）与苹果M-AP2（AF332215）、枳AP2
（EU883665）、拟南芥AP2（U12546）、矮牵牛
PhAP2A （AF132001）、豌豆AP2（AAK14326）、番茄AP2（ACD62792）、松树AP2（BAD16603）、水稻AP2
（AA065862）、玉米AP2（ABR19870）的相应序列进行相似性分析。
PCR 扩增，经克隆测序获得该基因的5’末端，经BLAST 比对与电子克隆的序列相一致。利用引物P07和P08，以葡萄花器官来源cDNA 为模板获得长
度为1536bp 的全长ORF 。对3’端、5’端以及ORF 全长拼接获得Vv-AP2的cDNA 全长为2208bp 。
1.3葡萄Vv-AP2基因的表达分析
从不同葡萄器官中提取的总RNA 用DNase Ⅰ
酶（RNase free ）消化和氯仿抽提后分别取2μg 以
Vv-AP2的全长序列包括长度为1536bp 的开放阅读框（ORF ），268bp 的5’非翻译区（5’UTR ），376bp 的3’非翻译区（3’UTR ）以及28bp 的poly +（A ）。该
基因在GenBank 基因数据库的注册号为FJ809943。
P01引物反转录合成的cDNA 做模板，用Primer-BLAST （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast ）设计的引物P11和P12进行半定量RT-PCR 和实时定量PCR 研究Vv-AP2在不同器官中的表
2.3葡萄APETALA2的ORF 区及其氨基酸序列由VvAP2cDNA 的ORF 区推导共编码511个
与分析
210
果树学报27卷
氨基酸（图1），并对该序列进行分析发现，Vv-AP2编码的氨基酸序列与其他植物的AP2氨基酸序列均有2个具有高度保守的序列即AP2结构域，该结构域可以识别DNA 顺式作用元件（Cis-acting Ele -
因。
用DNAMAN5.22软件对葡萄AP2氨基酸序列与苹果M-AP2（AF332215）、枳AP2（EU883665）、拟南芥AP2（U12546）、矮牵牛PhAP2A （AF132001）、豌豆AP2（AAK14326）、番茄AP2（ACD62792）、松树
ment ）并与之结合[18]。用DNAMAN5.22软件将其与
拟南芥的AP2结构域相比具有高度的同源性，分别为96.5%和94.1%；在其第143～152氨基酸还含有1个碱性区域，内含核定位信号KKSR ，且该序列与拟南芥的核定位信号序列完全相同；在VvAP2的N 端第15～28氨基酸还含有一段富含丝氨酸的转录激活区域，该区域是3个典型转录因子（AP1、AP2、LFY ）的序列之一，具有促进该基因转录的作用。上述结果表明，从葡萄中分离出的目标基因是AP2的同源基
[***********][***********][***********]531
AP2（BAD16603）、水稻AP2（AA065862）、玉米AP2
（ABR19870）的相应序列进行同源性比较，结果表明：葡萄AP2氨基酸序列与矮牵牛、枳、苹果的AP2的同源性较高，分别为67.5%、65.5%和64.7%，与豌豆、拟南芥、番茄、松树、水稻的同源性为58.2%、
49.5%、48.2%、42.9%、36.2%，与玉米的同源性最低仅为35.7%。这些AP2同源基因氨基酸序列同源性
的不同表明它们在功能上可能存在着一定的差异。
图1Vv-AP2cDNA 的ORF 区及由其推导的氨基酸序列
黑体ATG 与TGA 分别为起始密码子和终止密码子。方框为两个保守的AP2结构域即AP2-R1和AP2-R2，下划线表示富含丝氨酸的转录激活区域。粗线部分表示10个碱性氨基酸区域内含核定位信号（KKSR ）。
Fig. 1Nucleotide sequence of the open reading frame of Vv-AP2and the deduced amino acids
ATG （start codon ）and TGA （stop codon ）are showed in bold. Two boxes delineate the AP2domains （AP2-R1and AP2-R2）. Underlined residues indicate a transcriptional activation domain which are highly serine-rich region. Thick line highlights the putative nuclear localization signal sequence （KKSR ）with 10-amino acids.
2期
王晨等:基于EST 数据库的葡萄APETALA2基因cDNA 克隆及其表达分析211
例如，矮牵牛和烟草的AP2类似基因与拟南芥中的
AP2基因功能就不尽相同。上述植物的AP2氨基酸
序列的系统树（图2）分析也显示了相似的结果：葡萄AP2氨基酸序列与矮牵牛、枳[19]、苹果的AP2的进化关系较近，与水稻、玉米等的亲缘关系较远；总体上是双子叶植物的氨基酸序列的相似性高于松科和单子叶植物。
松Pinus thunbergii 矮牵牛Petunia
番茄Solanum lycopersicun 枳Poncirus trifoliata 葡萄Vitis vinifera
苹果Malus
豌豆Pisum sativuma 拟南芥Arabidopsis thaliana 水稻Oryza sativa 玉米Zea mays
图2
Vv-AP2推导序列与多种植物的AP2氨基酸系统树AP2and its homologues in other plants
Fig. 2Phylogenetic tree of the amino acid sequence of Vv-
2.4
Vv-AP2在葡萄不同器官中的表达分析
采用半定量RT-PCR 法对Vv-AP2基因进行器
3讨论
尽管葡萄是第4种全基因组测序的开花植物，但是由于葡萄高效遗传转化体系建立的难度大，葡萄功能基因组学研究明显滞后于拟南芥、水稻等模式植物。以生物信息学为基础的基因克隆措施仍然是获得与认识葡萄重要性状关键调控基因的主要手段。本研究以拟南芥APETALA2基因的cDNA 序列作为模板，对葡萄EST 数据库进行同源检索筛选，电子克隆出Vv-AP2基因的cDNA 序列，进一步以葡萄花cDNA 为模板以及葡萄cDNA 序列对应的特异引物，分别利用RACE 技术和特异PCR 技术成功获得了Vv-AP2基因的cDNA 全长。本研究对于克隆葡萄以及其他果树的基因具有一定的参考价值。
基于对ap2突变体的分析，人们发现拟南芥中
官特异性表达分析（图3），结果表明，在叶、茎、花序、花等各器官均扩增出大小约为150bp 的片段，经克隆测序获得该扩增片段的精确长度为141bp ，且该片断均为Vv-AP2的3’UTR 片断，与引物设计的预期扩增序列相一致。尽管Vv-AP2在葡萄上述器官均有表达，但存在着一定的表达差异，Vv-AP2在花序和花中的表达水平明显比叶和茎高。进一步用荧光定量PCR 方法检测在各器官中的表达量（图
4），得到与半定量RT-PCR 相一致的结果。Vv-AP2
在葡萄叶、茎、花序、花等不同器官均能表达的特点说明该基因编码的蛋白是一种普遍存在的转录因子，而其在这些不同器官中表达水平的不同则又说明了该转录因子在不同器官发育过程中所起的作用大小存在差异。
1
VvAP2UB1
图3
半定量RT-PCR 检测Vv-AP2基因在葡萄不同组织中的表达
1、2、3、4分别代表叶、茎、花序、花等不同组织
AP2基因不仅在花瓣和萼片的形成过程中起重要作用，而且与AP1、LFY 及CAL 等花的分生组织决定
基因相互作用，共同参与花分生组织的早期建立，如：花分生特性的建立，花器官特性的特化和花器官形成的调节，花同源异型基因活性的时空调节[1，19]。
234
Jofuku 等[1]报道，AP2不仅在拟南芥的花分生组织和
四轮花器官中表达，在茎、叶等营养器官中亦有表达。宿红艳等[10]采用RT-PCR 方法分析SAP2在草莓不同组织中的表达情况，结果显示SAP2在草莓营养组织、花芽以及不同花器官中均有表达。因此，该基因在植物的各个生长发育阶段，尤其是生殖器官的发育中发挥重要作用。本研究从葡萄花cDNA
Fig. 3Expression of Vv-AP2gene in different tissues of
grapevine by semi-quantitative RT-PCR
1. Leaf ；2. Stem ；3. Inflorescence ；4. Flower
212
果树学报27卷
中成功分离出AP2的同源基因Vv-AP2，该基因编码的蛋白质具有AP2家族典型的特征，并对包括葡萄在内的10种植物的AP2同源基因的氨基酸序列进行同源性比较，它们的同源性存在不同程度上的差异，而且它们在核定位信号序列和AP2结构域之外的序列差别较大；接着采用半定量RT-PCR 和荧光定量PCR 对Vv-AP2在葡萄不同组织中的表达情况进行分析，得到与在拟南芥、草莓、玉米中相似的结论，说明Vv-AP2对葡萄营养与生殖器官的发育都具有一定作用，但作用的大小可能存在着差异，进一步验证了Vv-AP2在葡萄不同空间表达的差异性，关于其在葡萄不同时期表达，将是我们的另一相关实验中研究的内容，本文不再多做描述。
为了更充分地认识Vv-AP2的功能，我们将利用构建Vv-AP2正义和反义表达载体通过转化葡萄开展更深层次的基因功能分析。此外，关于Vv-AP2调控哪些下游基因、如何调控这些基因来影响花的发育等方面的问题，目前还不太清楚，也将是我们进一步研究Vv-AP2的一个方向。参考文献References :
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Journal of Fruit Science
基于EST 数据库的葡萄APETALA2基因
cDNA 克隆及其表达分析
王
晨，刘
洪，房经贵*，宋长年，曹
雪，杨
光，章
镇
（南京农业大学园艺学院，南京210095）
摘
要：APETALA2（AP2）是拟南芥生长发育特别是花器官发育过程中重要的调控基因。利用生物信息学方法以拟
南芥APETALA2基因cDNA 序列作为模板，对葡萄EST 数据库进行同源检索筛选，电子克隆出葡萄AP2基因（Vv-
AP2）cDNA 序列。以香悦葡萄花cDNA 为模板，根据电子克隆的葡萄AP2基因cDNA 序列设计特异引物，分别利用RACE 技术和特异PCR 技术获得该基因3’末端和5’末端，序列拼接后获得葡萄的APETALA2基因的cDNA 全长。
该cDNA 的全长为2208bp ，命名为Vv-AP2。Vv-AP2核苷酸序列有一个1536bp 完整的开放读码框（ORF ），其5’与3’末端非翻译区分别为268bp 和376bp 。其中，3’末端含有28bp 的Ploy +（A ）。该基因在GenBank 基因数据库的注册号为FJ809943。氨基酸推导结果表明该cDNA 共编码了511个氨基酸，具备完全保守的核定位信号序列（KKSR ）以及2个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR 和SYBR Green I 实时定量RT-PCR 初步分析了Vv-AP2在葡萄叶、茎、花序、花等不同器官中的表达水平。其中，Vv-AP2在花序和花中的表达量明显高于叶和茎。
关键词：葡萄；Vv-AP2；基因克隆；表达分析中图分类号：S663．1
文献标识码：A
文章编号：1009－9980(2010)02－207－06
Cloning and expression analysis of APETALA2gene from grapevine （Vitis vinifera ）based on EST database
WANG Chen ，LIU Hong ，FANG Jing-gui *，SONG Chang-nian ，CAO Xue ，YANG Guang ，ZHANG Zhen
（College of Horticulture ，Nanjing Agricultural University ，Nanjing ，Jiangsu 210095China ）
Abstract :APETALA2（AP2）plays an important role in Arabidopsis development ，especially in the development of flower or -gans. Based on the relative conservation of plant homologous genes ，a full-length Vitis vinifera homologue of AP2（Vv-AP2）was bioinformatically cloned in this study. Accordingly ，the 5’-and 3’-end sequences were obtained from cDNA of flower of Xiang yue grapevine cultivar by 3’RACE and specific PCR with two gene-specific primers designed against the Vv-AP2se -quence ，based on the full length cDNA of Vv-AP2（2208bp ）which was spliced. This Vv-AP2cDNA included an open reading frame （ORF ）of 1536nucleotides ，5’-untranslated region （UTR ）of 268bp ，and 3'-UTR of 376bp. The 3’-UTR contains a Poly +（A ）of 28bp. The sequence has been deposited in GenBank database with the accession number of FJ809943. The deduced amino acid sequence of Vv-AP2includes 551amino acids ，contains a putative nuclear localization signal sequence （KKSR ）and two highly conserved AP2domains. The semi-quantitative RT-PCR and SYBR Green I Real-time qRT-PCR were employed to analyze the expression of Vv-AP2in different organs of grapevine and the result showed that Vv-AP2is expressed in much higher level in inflorescence and flower than that in leaf and stem. Key words :Grapevine ；Vv-AP2；Gene cloning ；Expression
APETALA2（AP2）是拟南芥一系列调节花发育的重要基因之一。AP2编码一个转录因子，其最明显
的功能是参与调控花器官和种子的发育[1-4]。AP2在拟南芥的所有营养器官及种子发育的各个阶段均有表达，其不仅调控花分生组织特异性、花器官特异
收稿日期：2009－05－04
接受日期:2009－08－03
基金项目：国家博士后基金（[1**********]）
性、花器官数量、种子产量，而且在保持茎端分生组织中干细胞小区等方面也起着重要作用[5-7]，有关其生理作用以及调控功能的研究一直受到重视。Lauter 等[8]在玉米中研究发现，AP2的同源基因（glossy15）在幼叶向成熟叶以及营养生长向生殖生长的转型方
作者简介：王晨，硕士，研究方向为果树基因组学。Tel ：[1**********]，E-mail ：[email protected]
觹通讯作者。Author for correspondence．Tel:025-84399069, E-mail ：[email protected]
208
果树学报27卷
面具有重要调控作用。因此，该基因可能在植物的整个生长发育过程，尤其是发育阶段的转变及生殖器官的发育中发挥重要作用。目前已经从拟南芥[1]、苹果[9]、草莓[10]、番茄[11]、玉米[8]、矮牵牛[12]等植物中克隆到了AP2的同源基因。在矮牵牛和烟草的研究中还发现
[12-13]
1
1.1
材料和方法
电子克隆
根据不同物种间同源基因的核酸序列相对保守
的特点，在GenBank 的核酸（nr/nt）数据库中检索拟南芥的AP2基因序列（U12546），并以U12546序列为探针对葡萄属EST 数据库进行BLAST 检索，获得与拟南芥AP2基因同源的葡萄EST 片段；从获得的葡萄EST 片段中选出同源性最高的一条
：它们的AP2同源基因与拟南芥中的
AP2基因功能不尽相同，说明不同植物间AP2同源
基因在功能上存在着一定的差异。在不同植物上开展AP2同源基因功能的分析对于认识基因的功能特点以及进一步利用具有重要意义。
葡萄（Vitis vinifera ）是世界性的重要果树之一，也是继拟南芥、水稻、杨树之后完成全基因测序的第
EV231889，再对葡萄EST 数据库进行BLAST 检索，
得到多条与之高度同源的葡萄EST 序列。将获得的
EST 序列用DNAStar 软件进行首尾拼接，获得新的Contig ，进一步将获得的Contig 反复对葡萄EST 公共数据库进行BLAST 检索、拼接，最后获得目的基
因的电子克隆全长cDNA 。
4种开花植物[14-15]。葡萄一直是基因组学与后基因组
学研究的重要植物材料，也是分子生物学研究的重要对象。Boss 等[16]在2000年预测在将来的20年中对葡萄基因以及基因功能的认识将促进通过基因工程手段对葡萄结果能力、果实成熟期以及植株生长习性等进行更有效调控。所有这些必将对葡萄产量与品质以及田间管理的操作产生重要影响。葡萄全基因组的测序无疑为这一预测的实现提供了重要保障。在葡萄上开展AP2基因功能的分析，不仅对认识葡萄花器官发育与童期的转变等有着重要的理论价值，而且对在农业生产中更有效地利用该基因也具有重要的意义。我们采用生物信息学的方法以拟南芥AP2的基因序列为模板，对葡萄EST 数据库进行反复同源筛选、延伸，获得葡萄AP2cDNA 的全长序列，并以香悦葡萄花cDNA 为模板，经RACE 技术、电子克隆和RT-PCR 技术获得葡萄的cDNA 全长，命名为VvAP2，并对其核苷酸及氨基酸序列特征以及在葡萄不同器官中的表达进行了分析。
表1
1.21.2.1
实验克隆材料
3a 生葡萄的叶、茎（茎为当年新梢顶
部第2、3、4节间的茎段）、花序、花（花为未盛开的花朵）于2008年4月下旬到6月下旬采自江苏省南京市江宁区汤山果园（南京农业大学试验基地）。大肠杆菌（Escherichia coli ）菌株DH5α由本实验室保存。
PowerScript II TM 反转录酶购自Clontech 公司，DNase 酶Ⅰ、LA-Taq 酶、Ex-Taq 酶、pMD-18T 载体、dNTP 、DNA Marker 购自TaKaRa 公司，Trizol Reagent 购自Invitrogen 公司，荧光定量染料SYBR Green Ⅰ购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，DNA 回收试剂
盒、DL 2000Plus DNA Marker 为北京全式金生物技术有限公司生产。各种引物由上海英俊生物技术有限公司（Invitrogen ）合成，其编号及序列见表1。
1.2.2RNA 提取与纯化花组织总RNA 的提取按
引物序列及预期片段大小
Table 1Sequence of primers and pre-production length
编号
序列
预期片段大小
用途
Code No. P01P02P03P04P05P06P07P08P09P10P11P12
Sequence (5'-3')
30VN AACTGGAAGATGGGAATCTCATATATGGG GCAGGACTGCAGCTGACTGACTAC TATTGGGCAGTTGAGGATAGACG
CATGGGTCACTGAGAAGCCGAATATTTTACTG GCTCGCTGTTTTGCAGTTCTAC AACATAGGTGAGGCCGCACTT AGCCCCACCATACCATGTAA CCTCTTCATATCCCCCAACA
Predicted size of amplified product/bpUse
cDNA 合成cDNA synthesis
扩增Vv-AP2基因3' 端3'-end amplification 扩增Vv-AP2基因5' 端5'-end amplification Vv-AP2基因ORF 扩增Complete ORF amplification 扩增ubi
Ubi amplification 定量RT-PCR
Quantitative RT-PCR
±[**************]20
注：粗线和双下划线是相互匹配的引物与接头；下划线为添加的酶切位点，GAGCTC 为Sac I ，GGATCC 为Bam H I 。
Note:Thick line and double underline shading denotes matching primers or adaptors; GAGCTC and GGATCC underlined in primers indicates restriction enzyme sites of Sac I and Bam H I.
2期王晨等:基于EST 数据库的葡萄APETALA2基因cDNA 克隆及其表达分析209
照Trizol Reagent 说明书进行。mRNA 的纯化采用
mRNA Isolation Promega 公司生产的PloyATtract 1
达特点。为确保半定量RT-PCR 和实时荧光定量
PCR 的特异性，引物P11与P12被设计在Vv-AP2
基因的3’非翻译区（3’UTR ）。内标基因是利用葡萄
System IV 试剂盒进行。1.2.3
cDNA 合成
以mRNA 为模板，引物P01反
转录合成cDNA 第一条链，引物P02延伸加帽子，空气加热条件下42℃保温1h ，75℃保温10min ，冰上冷却2min 后，-70℃保存备用。
Ubi 的特异性引物（P09和P10）PCR 扩增获得的长
度为141bp 的基因片断。利用Rotor-Gene 荧光定量
PCR 仪进行实时定量RCR 的反应体系按SYBR Green Ⅰ（TOYOBO ）说明书进行，其优化后的反应条
件为：95℃预变性60s ，95℃15s 、57℃15s ，72℃20s 、45个循环，每实验3次重复，实验数据用Lin -RegPCR （Ramakers et al. ，2003）[17]和Excel 软件分
析。
1.2.4基因3’和5’末端PCR 扩增以cDNA 为模
板用引物P03/P04进行PCR 扩增获得基因的3’末端（3’UTR 区）。反应体系为50μL ：LA-Taq 酶0.50
μL ，10×PCR buffer （Mg 2＋plus ）5μL ，dNTP Mixture 4μL ，cDNA 2μL ，引物各1μL ，反应参数为94℃预变性3min ，5个循环，94℃30s 、70℃30s 、72℃3min 、5个循环，94℃30s 、68℃30s 、72℃3min 、25个循环，72℃延伸10min 。琼脂糖凝胶电泳检测
后用DNA 回收试剂盒回收目标片段进行T/A克隆，
2
2.1
结果与分析
葡萄Vv-AP2cDNA 全长的电子克隆
利用拟南芥U12546为信息探针，对葡萄EST
数据库进行BLAST 检索，得到1个保守性高的EST 序列EV231889，然后以此序列作为种子序列
DNA 测序由上海博亚生物技术有限公司完成（下同）。用电子克隆获得基因的5’末端（5’UTR 区），再
根据电子克隆的序列，设计特异引物P05/P06，进行特异PCR 获得基因的5’末端。反应参数为94℃预变性3min ，94℃30s 、60℃30s 、72℃2min 、35个循环，72℃延伸10min 。反应体系同3’末端扩增。
BLAST 检索葡萄EST 数据库，将检出的与种子序列同源性较高的或有部分重叠的EST 序列（CB922024，CF511859，CB974375，EC953584，CF511859，EV231890，CB974442）拼接组装为重叠群（Contig ），再以此重叠群序列重复以上BLAST 检
索过程，反复进行EST 重叠群序列的拼接和比对，最后获得长度为2208bp 的Vv-AP2cDNA 全长序列。
1.2.5基因ORF 的扩增以cDNA 为模板用引物
P07/P08进行PCR 扩增，反应体系为50μL ：cDNA 2μL ，引物各2μL ，Ex -Taq 酶0.50μL ，10×PCR buffer （Mg 2＋plus ）5μL ，dNTP Mixture 4μL ，cDNA 2μL ，引物各1μL ，反应参数同上。
1.2.6生物信息学分析利用DNAMAN5.22软件
对Vv-AP2的ORF 、3’末端和5’末端等3个序列进行拼接分析；该基因的核苷酸和氨基酸序列分别利用NCBI 的BLASTn 和BLASTp （http://blast.ncbi.nlm.
2.2葡萄Vv-AP2cDNA 全长的获得
根据电子克隆的Vv-AP2的cDNA 全长设计特
异引物P03，以葡萄花器官来源cDNA 为模板，与引物P04进行3’RACE 扩增，经克隆测序得到该基因的3’末端（1012bp ），用电子克隆得到该基因的生物信息学的5’末端，即5’UTR 区（268bp ），根据电子克隆的序列设计特异引物P05/P06，并用特异
nih.gov/Blast.cgi）与苹果M-AP2（AF332215）、枳AP2
（EU883665）、拟南芥AP2（U12546）、矮牵牛
PhAP2A （AF132001）、豌豆AP2（AAK14326）、番茄AP2（ACD62792）、松树AP2（BAD16603）、水稻AP2
（AA065862）、玉米AP2（ABR19870）的相应序列进行相似性分析。
PCR 扩增，经克隆测序获得该基因的5’末端，经BLAST 比对与电子克隆的序列相一致。利用引物P07和P08，以葡萄花器官来源cDNA 为模板获得长
度为1536bp 的全长ORF 。对3’端、5’端以及ORF 全长拼接获得Vv-AP2的cDNA 全长为2208bp 。
1.3葡萄Vv-AP2基因的表达分析
从不同葡萄器官中提取的总RNA 用DNase Ⅰ
酶（RNase free ）消化和氯仿抽提后分别取2μg 以
Vv-AP2的全长序列包括长度为1536bp 的开放阅读框（ORF ），268bp 的5’非翻译区（5’UTR ），376bp 的3’非翻译区（3’UTR ）以及28bp 的poly +（A ）。该
基因在GenBank 基因数据库的注册号为FJ809943。
P01引物反转录合成的cDNA 做模板，用Primer-BLAST （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast ）设计的引物P11和P12进行半定量RT-PCR 和实时定量PCR 研究Vv-AP2在不同器官中的表
2.3葡萄APETALA2的ORF 区及其氨基酸序列由VvAP2cDNA 的ORF 区推导共编码511个
与分析
210
果树学报27卷
氨基酸（图1），并对该序列进行分析发现，Vv-AP2编码的氨基酸序列与其他植物的AP2氨基酸序列均有2个具有高度保守的序列即AP2结构域，该结构域可以识别DNA 顺式作用元件（Cis-acting Ele -
因。
用DNAMAN5.22软件对葡萄AP2氨基酸序列与苹果M-AP2（AF332215）、枳AP2（EU883665）、拟南芥AP2（U12546）、矮牵牛PhAP2A （AF132001）、豌豆AP2（AAK14326）、番茄AP2（ACD62792）、松树
ment ）并与之结合[18]。用DNAMAN5.22软件将其与
拟南芥的AP2结构域相比具有高度的同源性，分别为96.5%和94.1%；在其第143～152氨基酸还含有1个碱性区域，内含核定位信号KKSR ，且该序列与拟南芥的核定位信号序列完全相同；在VvAP2的N 端第15～28氨基酸还含有一段富含丝氨酸的转录激活区域，该区域是3个典型转录因子（AP1、AP2、LFY ）的序列之一，具有促进该基因转录的作用。上述结果表明，从葡萄中分离出的目标基因是AP2的同源基
[***********][***********][***********]531
AP2（BAD16603）、水稻AP2（AA065862）、玉米AP2
（ABR19870）的相应序列进行同源性比较，结果表明：葡萄AP2氨基酸序列与矮牵牛、枳、苹果的AP2的同源性较高，分别为67.5%、65.5%和64.7%，与豌豆、拟南芥、番茄、松树、水稻的同源性为58.2%、
49.5%、48.2%、42.9%、36.2%，与玉米的同源性最低仅为35.7%。这些AP2同源基因氨基酸序列同源性
的不同表明它们在功能上可能存在着一定的差异。
图1Vv-AP2cDNA 的ORF 区及由其推导的氨基酸序列
黑体ATG 与TGA 分别为起始密码子和终止密码子。方框为两个保守的AP2结构域即AP2-R1和AP2-R2，下划线表示富含丝氨酸的转录激活区域。粗线部分表示10个碱性氨基酸区域内含核定位信号（KKSR ）。
Fig. 1Nucleotide sequence of the open reading frame of Vv-AP2and the deduced amino acids
ATG （start codon ）and TGA （stop codon ）are showed in bold. Two boxes delineate the AP2domains （AP2-R1and AP2-R2）. Underlined residues indicate a transcriptional activation domain which are highly serine-rich region. Thick line highlights the putative nuclear localization signal sequence （KKSR ）with 10-amino acids.
2期
王晨等:基于EST 数据库的葡萄APETALA2基因cDNA 克隆及其表达分析211
例如，矮牵牛和烟草的AP2类似基因与拟南芥中的
AP2基因功能就不尽相同。上述植物的AP2氨基酸
序列的系统树（图2）分析也显示了相似的结果：葡萄AP2氨基酸序列与矮牵牛、枳[19]、苹果的AP2的进化关系较近，与水稻、玉米等的亲缘关系较远；总体上是双子叶植物的氨基酸序列的相似性高于松科和单子叶植物。
松Pinus thunbergii 矮牵牛Petunia
番茄Solanum lycopersicun 枳Poncirus trifoliata 葡萄Vitis vinifera
苹果Malus
豌豆Pisum sativuma 拟南芥Arabidopsis thaliana 水稻Oryza sativa 玉米Zea mays
图2
Vv-AP2推导序列与多种植物的AP2氨基酸系统树AP2and its homologues in other plants
Fig. 2Phylogenetic tree of the amino acid sequence of Vv-
2.4
Vv-AP2在葡萄不同器官中的表达分析
采用半定量RT-PCR 法对Vv-AP2基因进行器
3讨论
尽管葡萄是第4种全基因组测序的开花植物，但是由于葡萄高效遗传转化体系建立的难度大，葡萄功能基因组学研究明显滞后于拟南芥、水稻等模式植物。以生物信息学为基础的基因克隆措施仍然是获得与认识葡萄重要性状关键调控基因的主要手段。本研究以拟南芥APETALA2基因的cDNA 序列作为模板，对葡萄EST 数据库进行同源检索筛选，电子克隆出Vv-AP2基因的cDNA 序列，进一步以葡萄花cDNA 为模板以及葡萄cDNA 序列对应的特异引物，分别利用RACE 技术和特异PCR 技术成功获得了Vv-AP2基因的cDNA 全长。本研究对于克隆葡萄以及其他果树的基因具有一定的参考价值。
基于对ap2突变体的分析，人们发现拟南芥中
官特异性表达分析（图3），结果表明，在叶、茎、花序、花等各器官均扩增出大小约为150bp 的片段，经克隆测序获得该扩增片段的精确长度为141bp ，且该片断均为Vv-AP2的3’UTR 片断，与引物设计的预期扩增序列相一致。尽管Vv-AP2在葡萄上述器官均有表达，但存在着一定的表达差异，Vv-AP2在花序和花中的表达水平明显比叶和茎高。进一步用荧光定量PCR 方法检测在各器官中的表达量（图
4），得到与半定量RT-PCR 相一致的结果。Vv-AP2
在葡萄叶、茎、花序、花等不同器官均能表达的特点说明该基因编码的蛋白是一种普遍存在的转录因子，而其在这些不同器官中表达水平的不同则又说明了该转录因子在不同器官发育过程中所起的作用大小存在差异。
1
VvAP2UB1
图3
半定量RT-PCR 检测Vv-AP2基因在葡萄不同组织中的表达
1、2、3、4分别代表叶、茎、花序、花等不同组织
AP2基因不仅在花瓣和萼片的形成过程中起重要作用，而且与AP1、LFY 及CAL 等花的分生组织决定
基因相互作用，共同参与花分生组织的早期建立，如：花分生特性的建立，花器官特性的特化和花器官形成的调节，花同源异型基因活性的时空调节[1，19]。
234
Jofuku 等[1]报道，AP2不仅在拟南芥的花分生组织和
四轮花器官中表达，在茎、叶等营养器官中亦有表达。宿红艳等[10]采用RT-PCR 方法分析SAP2在草莓不同组织中的表达情况，结果显示SAP2在草莓营养组织、花芽以及不同花器官中均有表达。因此，该基因在植物的各个生长发育阶段，尤其是生殖器官的发育中发挥重要作用。本研究从葡萄花cDNA
Fig. 3Expression of Vv-AP2gene in different tissues of
grapevine by semi-quantitative RT-PCR
1. Leaf ；2. Stem ；3. Inflorescence ；4. Flower
212
果树学报27卷
中成功分离出AP2的同源基因Vv-AP2，该基因编码的蛋白质具有AP2家族典型的特征，并对包括葡萄在内的10种植物的AP2同源基因的氨基酸序列进行同源性比较，它们的同源性存在不同程度上的差异，而且它们在核定位信号序列和AP2结构域之外的序列差别较大；接着采用半定量RT-PCR 和荧光定量PCR 对Vv-AP2在葡萄不同组织中的表达情况进行分析，得到与在拟南芥、草莓、玉米中相似的结论，说明Vv-AP2对葡萄营养与生殖器官的发育都具有一定作用，但作用的大小可能存在着差异，进一步验证了Vv-AP2在葡萄不同空间表达的差异性，关于其在葡萄不同时期表达，将是我们的另一相关实验中研究的内容，本文不再多做描述。
为了更充分地认识Vv-AP2的功能，我们将利用构建Vv-AP2正义和反义表达载体通过转化葡萄开展更深层次的基因功能分析。此外，关于Vv-AP2调控哪些下游基因、如何调控这些基因来影响花的发育等方面的问题，目前还不太清楚，也将是我们进一步研究Vv-AP2的一个方向。参考文献References :
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