发酵豆粕中水溶性蛋白含量的测定
1 方法原理
用水提取大豆中的水溶性蛋白，硫酸使含氮物转化成为硫酸铵，加强碱蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，用标准盐酸滴定计算含氮量，乘以换算系数计算出大豆中水溶性蛋白的含量。 2、试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 2.1 硫酸（H2SO4）。 2.2 盐酸(HCl)。
2.3 20g/L硼酸溶液：称取100g硼酸（H3BO4）溶于5000mL水中。
2.4 400g/L氢氧化钠溶液：称取2000g氢氧化钠（NaOH）溶于5000mL水中。 2.5 盐酸标准溶液[c(HCl)=0.1mol/L]：量取8.3mL盐酸，溶于1000mL水中。 标定：精密称取经270℃～300℃干燥恒重过的基准碳酸钠约0.15g，加水50mL溶解，加甲基红—溴甲酚绿混合指示剂10滴，用本液滴定到溶液由绿色变为紫红色。煮沸2min，冷却至室温， 继续滴定到溶液由绿色变为暗紫色，同时做空白试验。
盐酸标准溶液的浓度按式（1）计算： C= 式中：
m—无水碳酸钠的质量，单位为克（g）； V1—盐酸溶液用量，单位为毫升（mL）；
V2—空白试验盐酸溶液用量，单位为毫升（mL）； 0.0530—Na2CO3的毫克当量。 2.6 混合指示剂。
m
………………………………………………(1)
V1−V2×0.0530
1.0g/L甲基红乙醇溶液：称取0.1g甲基红溶于100mL乙醇中；5.0g/L溴甲酚绿乙醇溶液：称取0.5g溴甲酚绿溶于100mL乙醇中；两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月。
2.7 混合催化剂[（CuSO4+K2SO4）=10+100]:称取10g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和100g硫酸钾（K2SO4）,混匀，研磨，过 0.42mm筛。 2.8 硫酸铵。 3、仪器设备
3.1 实验室用样品粉碎机或研钵。 3.2 分样筛: 孔径0.45mm(40目)。 3.3 分析天平: 感量0.0001g。 3.4 滴定管: 酸式, 25或10mL。 3.5 具塞三角瓶: 250mL。 3.6 恒温振荡器。 3.7 消煮炉或电炉。
3.8 凯氏烧瓶: 100或500mL。
3.9 凯氏蒸馏装置: 常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式。 3.10 三角瓶: 250mL。 3.11 容量瓶: 100mL。 3.12 消煮管：250 mL。
3.13 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动，全自动蛋白质测定仪。 3.14 离心机。 3.15 中速定性滤纸。 4 操作步骤与计算 4.1 游离氨含量的测定 4.1.1 操作步骤
称取粉碎试样3-5g（精确至0.01g）于250mL三角瓶中。吸取100mL 20℃蒸馏水于三角瓶中，振摇使试样不结块，均匀分散。 将三角瓶固定于摇床，温度控制在(20士2)℃.，振荡60 min。 取下三角瓶，将溶液用中速定性滤纸过滤。过滤完毕后，取10mL上清液，上机蒸馏、滴定；或采用常量直接蒸馏式或
半微量水蒸气蒸馏式凯氏蒸馏装置蒸馏、滴定。 4.1.2 计算
游离氨含量（﹪）={[(V-V0)×C×0.017×100]/(m×10)}×100%
式中：
V——滴定样品消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； V0——滴定空白消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； C ——盐酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； m ——试样的质量，单位为克（g）； 0.017——铵根离子的毫克当量数。
4.2 水溶性蛋白的测定 4.2.1 操作步骤
称取发酵豆粕m 3～5g（准确至0.0001 g）于250mL具塞三角瓶内，准确加入100.00mL蒸馏水。摇匀后，室温振荡30min，静置5min，将上清液倒入50mL离心管内,4800r/min，离心15min。
取上清液10.00mL于消化管内，加入2g～3g混合催化剂，12mL浓硫酸， 将蒸馏管置于通风橱中加热消化。开始用100℃低温加热0.5h，至黑泡沫消失，控制瓶中泡沫不超过瓶管的2/3，然后再升温至400℃～430℃，加热1.5h，至消化液呈透明的蓝紫色时，继续加热0.5h。
冷却后，缓慢向消化管内加入约10mL蒸馏水，摇匀，冷却后蒸馏。2%的硼酸溶液吸收，0.1mol/L的盐酸溶液滴定，消耗盐酸体积V。 4.2.2 计算：
CP水(%)={[（V-V0）×CHCL×0.014×6.25×100]/(m×10)} ×100% —游离氨含量（﹪）×0.014×6.25∕0.017
式中：
V——滴定样品消化液所耗盐酸标准溶液的体积，mL； V0——滴定空白消化液所耗盐酸标准溶液的体积，mL； C ——盐酸标准溶液的浓度，mol/L；
m ——试样的质量，g； 0.014━氮的毫克当量数；
6.25 ━氮换算成蛋白质的平均系数。
二、发酵豆粕中小肽含量的测定——三氯乙酸沉淀法
1、方法原理
试样用三氯乙酸（水）溶解后，使蛋白质和大分子肽沉淀，过滤，上清液消化蒸馏滴定，测定三氯乙酸（水）沉淀蛋白的量，减去游离氨的量既得小肽的量。 2、试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 2.1 硫酸（H2SO4）。 2.2 盐酸(HCl)。
2.3 20g/L硼酸溶液：称取100g硼酸（H3BO4）溶于5000mL水中。
2.4 400g/L氢氧化钠溶液：称取2000g氢氧化钠（NaOH）溶于5000mL水中。 2.5 盐酸标准溶液[c(HCl)=0.1mol/L]：量取8.3mL盐酸，溶于1000mL水中。 标定：精密称取经270℃～300℃干燥恒重过的基准碳酸钠约0.15g，加水50mL溶解，加甲基红—溴甲酚绿混合指示剂10滴，用本液滴定到溶液由绿色变为紫红色。煮沸2min，冷却至室温， 继续滴定到溶液由绿色变为暗紫色，同时做空白试验。
盐酸标准溶液的浓度按式（1）计算： C= 式中：
m—无水碳酸钠的质量，单位为克（g）； V1—盐酸溶液用量，单位为毫升（mL）；
m
………………………………………………(1)
V1−V2×0.0530
V2—空白试验盐酸溶液用量，单位为毫升（mL）； 0.0530—Na2CO3的毫克当量。 2.6 混合指示剂。
1.0g/L甲基红乙醇溶液：称取0.1g甲基红溶于100mL乙醇中；5.0g/L溴甲酚绿乙醇溶液：称取0.5g溴甲酚绿溶于100mL乙醇中；两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月。
2.7 混合催化剂[（CuSO4+K2SO4）=10+100]:称取10g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和100g硫酸钾（K2SO4）,混匀，研磨，过 0.42mm筛。 2.8 硫酸铵。
2.9 150g/L三氯乙酸溶液：取150g三氯乙酸溶于1000mL水中。 3、仪器设备
3.1 实验室用样品粉碎机或研钵。 3.2 分样筛: 孔径0.45mm(40目)。 3.3 分析天平: 感量0.0001g。 3.4 滴定管: 酸式, 25或10mL。 3.5 具塞三角瓶: 250mL。 3.6 恒温振荡器。 3.7 消煮炉或电炉。
3.8 凯氏烧瓶: 100或500mL。
3.9 凯氏蒸馏装置: 常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式。 3.10 三角瓶: 250mL。 3.11 容量瓶: 100mL。 3.12 消煮管：250 mL。
3.13 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动，全自动蛋白质测定仪。 3.14 离心机。 3.15 中速定性滤纸。 4 操作步骤与计算 4.1 游离氨含量的测定 4.1.1 操作步骤
称取粉碎试样3-5g（精确至0.01g）于250mL三角瓶中。吸取100mL 20℃蒸馏水于三角瓶中，振摇使试样不结块，均匀分散。 将三角瓶固定于摇床，温度控制在(20士2)℃.，振荡60 min。 取下三角瓶，将溶液用中速定性滤纸过滤。过滤完毕后，取10mL上清液，上机蒸馏、滴定；或采用常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式凯氏蒸馏装置蒸馏、滴定。 4.1.2 计算
游离氨含量（﹪）={[(V-V0)×C×0.017×100]/(m×10)}×100% 式中：
V——滴定样品消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； V0——滴定空白消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； C ——盐酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； m ——试样的质量，单位为克（g）； 0.017——铵根离子的毫克当量数。 4.2 小肽含量的测定 4.2.1 操作步骤
称取发酵豆粕m 3～5g（准确至0.0001 g）于250mL具塞三角瓶内，准确加入100.00mL 150g/L的三氯乙酸溶液。摇匀后，室温振荡30min，静置5min，将上清液倒入50mL离心管内,4800r/min，离心15min。
取上清液10.00mL于消化管内，加入2g～3g混合催化剂，12mL浓硫酸，420℃消化1.5h。冷却后，缓慢向消化管内加入约10mL蒸馏水，摇匀，冷却后蒸馏。2%的硼酸溶液吸收，0.1mol/L的盐酸溶液滴定，消耗盐酸体积V。 4.2.2. 计算：
小肽含量（﹪）= CP三氯乙酸(%)—游离氨含量（﹪）×0.014×6.25∕0.017； CP三氯乙酸(%)={[（V-V0）×CHCL×0.014×6.25×100]/(m×10)} ×100% 二式中：
V——滴定样品消化液所耗盐酸标准溶液的体积，mL； V0——滴定空白消化液所耗盐酸标准溶液的体积，mL； C ——盐酸标准溶液的浓度，mol/L；
m ——试样的质量，g； 0.014━氮的毫克当量数；
6.25 ━氮换算成蛋白质的平均系数； 0.017——铵根离子的毫克当量数。
三、发酵豆粕中总酸的测定——NaOH 滴定法
1 原理
根据酸碱中和反应的实质: H++OH-= H2O，即K·C标·V标= C待·V待。已知碱的体积,并知道NaOH标准溶液的物质的量浓度,可以计算出发酵豆粕中总酸的含量（由乳酸折算成总酸）。 2 试剂和材料
2.1 NaOH标准溶液[C(NaOH)=0.1mol/L]：称取4.000g NaOH溶于1000mL新沸
过的冷水中。
标定：取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.6g,精密称定，加新沸过的冷水50mL，振摇，使其尽量溶解，加酚酞指示液2滴，用本液滴定；在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。每1mL氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于20.42mg的邻苯二甲酸氢钾。 2.2 NaOH标准溶液[C(NaOH)=0.02mol/L]：0.1 mol/L NaOH标准溶液加新沸过
的冷水稀释制成。必要时，可用盐酸滴定液（0.02mol/L）标定浓度。 2.3 酚酞指示液：取酚酞1g，加乙醇100mL使溶解，即得。 3.仪器、设备
3.1 分析天平，感量0.001g。 3.2 容量瓶：100、1000mL。 3.3 烧杯：100 mL。 3.4 磁力搅拌器。 3.5 高速离心机。 3.6 离心管：50mL。
3.7 碱式滴定管：10或20mL。 3.8 pH计：分度值0.05。 3.9 粉碎机。 4 测定步骤
称取样品10g（准确至0.001g），加到250mL烧杯中，加蒸馏水100mL（因搅拌时一些粉末会贴壁，需用玻璃棒，可先加90mL，再用10mL冲洗玻璃棒），在磁力搅拌器上搅拌30min 后，过滤于锥形瓶中（或转入50mL离心管中，4000rpm 离心5min），准确移取滤液10.00mL，加入40.00mL新沸过的冷水后，用0.02M 的标准NaOH溶液滴定，酚酞为指示剂（2-3滴），至溶液变为粉红色为滴定终点（若样品颜色太深，难以观察终点，以pH=8.15为滴定终点）。记录消耗的NaOH的体积，记为V (mL)。 同时做空白对照。 5 计算
式中：V: 样品消耗标准NaOH溶液的体积数，mL；
V0: 未发酵豆粕滴定消耗标准NaOH溶液的体积数，mL； CNaOH: NaOH溶液的浓度，mol/L； 90.08: 乳酸的分子量； m:称取样品的质量，g。
乳酸%﹦
m×
（V-V0）×CNaOH××
90.08 1000
×100
四 发酵豆粕中寡糖的测定— 薄层层析法（TLC）
1.原理
植物组织的可溶性糖可用一定浓度的乙醇提取出来，经去杂除去糖提取液中蛋白质等干扰测糖的杂质，获得较纯的可溶性糖混合液，薄层层析是一种基于被分离物质的极性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。 2.试剂和材料
2.1 水苏糖和棉籽糖标准品（均为sigma公司）。
2.2 水苏糖和棉籽糖标样：用80％的乙醇溶液，分别配制2%的水苏糖和0.5%的棉籽糖标样溶液，4℃保藏备用。 2.3 乙醇溶液：80%、95%。
2.4 展开剂：正丙醇：乙酸：水＝1：1：0.1。
2.5 显色剂：将10mL正磷酸的加入90mL95%乙醇溶液中混匀，再加入0.1g的1-萘酚使之充分溶解，常温储存备用。 3.仪器、设备
3.1 200×60×200mm层析缸。
3.2 200×100mm G型硅胶层析板，厚度：0.20～0.25mm。 3.3 微量进样器1ul、5ul。 3.4 电热恒温水浴锅。 3.5 高速离心机。 3.6 电热鼓风干燥箱。
3.7 冰箱：控制温度于4℃±3℃。 4. 测定步骤
4.1 样品提取液的制备
准确称取发酵豆粕样品5.0g 于250mL 三角瓶中，加入50.0mL 80％的乙醇溶液，70℃水浴浸提1h。取10mL浸提液，10000rpm离心10min，4℃保藏备用。4.2 硅胶板预处理
硅胶板使用前进行切割处理：两侧边缘各割0.5cm硅胶层，上边缘割1cm，以消除硅胶涂布不均现象，然后把硅胶板放入100-105℃烘箱中活化一小时。 4.3 点样
取活化过的硅胶G薄板，根据测样量的多少，在距底边2cm水平线上确定几个点，应相互间隔1cm，其中一个点点棉籽糖和水苏糖标准溶液，剩余点点样品提取液。标样点样量为1μL，样品点样量为5μL，室温风干点样点。 4.4 展开
在层析缸中加入合适量的展开液，并在内壁上贴两条与缸一样高、宽浸透展开剂的滤纸条，密封。硅胶板倒置放在层析缸较高的一面，饱和约1h。再将硅胶板正放在层析缸较低的一面，在120ml展开液中展开，展开至离硅胶板前沿1~2cm 处（此过程大约4h）。即可停止展层，取出自然晾干或用吹风机吹干。 4.5 显色
喷淋显色剂，在140℃下烘5min 显色。
五 SDS-PAGE电泳方法
1 SDS-PAGE电泳试剂的配制
1.1 Acr/Bis：丙烯酰胺 29.2 g，甲叉双丙烯酰胺 0.8 g，ddH2O定容至100 mL，4℃保存。
1.2 10% SDS：SDS 10 g，用ddH2O定容至100 mL。
1.3 1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)：Tris 18.15 g，用80 mL ddH2O溶解，用HCl 调pH=8.8，ddH2O定容至100 mL，4℃保存。
1.4 0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.8)：Tris 6 g，用60 mL ddH2O溶解，用HCl 调pH=6.8，ddH2O定容至100 mL，4 ℃保存。
1.5 10×电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 30.3 g，甘氨酸 144.0 g，SDS 10.0 g，去离子水定容至1 L。
1.6 10% APS：APS 0.1 g，1 mL ddH2O溶解，分装后冻存于-20 ℃。 1.7 5×样品缓冲液(Loading Buffer)：甘油2.5mL，10% SDS 2mL，0.5%(w/v)溴酚兰0.2 mL，β-巯基乙醇 500 μL，0.5 mol/L Tris-HCl (pH 6.8) 1.25 mL，ddH2O定容至10 mL。
1.8 染色液：考马斯亮兰R-250 1.25 g，冰醋酸 50 mL，甲醇 200 mL，去离子水定容至500 mL，过滤后可反复多次使用。
1.9 脱色液：乙醇 200 mL，冰醋酸 100 mL，去离子水 700 mL。 2、SDS-PAGE电泳凝胶的配制
12% 分离胶(8 mL) ddH2O 1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8
Acr/Bis 10% SDS 10% APS TEMED
3、SDS-PAGE电泳方法
3.1 样品处理：称取1g精细粉碎的样品至20mlTris-Hcl缓冲液中（pH8.0 0.1mol/L），室温振荡1h，低温高速离心（10000r 20min）。所得上清即可用于SDS-PAGE。将40 μL上清与10 μL 5×样品缓冲液混合，沸水中煮5 min。标样与样品做同样处理。
3.2 电泳过程：用微量进样器取20 μL上样液，加于电泳孔中，200 V电压恒压电泳40 min。电泳完毕后将胶取下，用考马斯亮兰染色液染色30 min，脱色液脱色摇床脱色。
2.70 mL 2 mL 3.2 mL 80 μL 50 μL 5 μL
4% 浓缩胶(2.5 mL) ddH2O 0.5 mol/L Tris-HCl，pH6.8
Acr/Bis 10%SDS 10%APS TEMED
1.525 mL 625 μL 325 μL 25 μL 50 μL 5 μL
发酵豆粕中水溶性蛋白含量的测定
1 方法原理
用水提取大豆中的水溶性蛋白，硫酸使含氮物转化成为硫酸铵，加强碱蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，用标准盐酸滴定计算含氮量，乘以换算系数计算出大豆中水溶性蛋白的含量。 2、试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 2.1 硫酸（H2SO4）。 2.2 盐酸(HCl)。
2.3 20g/L硼酸溶液：称取100g硼酸（H3BO4）溶于5000mL水中。
2.4 400g/L氢氧化钠溶液：称取2000g氢氧化钠（NaOH）溶于5000mL水中。 2.5 盐酸标准溶液[c(HCl)=0.1mol/L]：量取8.3mL盐酸，溶于1000mL水中。 标定：精密称取经270℃～300℃干燥恒重过的基准碳酸钠约0.15g，加水50mL溶解，加甲基红—溴甲酚绿混合指示剂10滴，用本液滴定到溶液由绿色变为紫红色。煮沸2min，冷却至室温， 继续滴定到溶液由绿色变为暗紫色，同时做空白试验。
盐酸标准溶液的浓度按式（1）计算： C= 式中：
m—无水碳酸钠的质量，单位为克（g）； V1—盐酸溶液用量，单位为毫升（mL）；
V2—空白试验盐酸溶液用量，单位为毫升（mL）； 0.0530—Na2CO3的毫克当量。 2.6 混合指示剂。
m
………………………………………………(1)
V1−V2×0.0530
1.0g/L甲基红乙醇溶液：称取0.1g甲基红溶于100mL乙醇中；5.0g/L溴甲酚绿乙醇溶液：称取0.5g溴甲酚绿溶于100mL乙醇中；两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月。
2.7 混合催化剂[（CuSO4+K2SO4）=10+100]:称取10g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和100g硫酸钾（K2SO4）,混匀，研磨，过 0.42mm筛。 2.8 硫酸铵。 3、仪器设备
3.1 实验室用样品粉碎机或研钵。 3.2 分样筛: 孔径0.45mm(40目)。 3.3 分析天平: 感量0.0001g。 3.4 滴定管: 酸式, 25或10mL。 3.5 具塞三角瓶: 250mL。 3.6 恒温振荡器。 3.7 消煮炉或电炉。
3.8 凯氏烧瓶: 100或500mL。
3.9 凯氏蒸馏装置: 常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式。 3.10 三角瓶: 250mL。 3.11 容量瓶: 100mL。 3.12 消煮管：250 mL。
3.13 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动，全自动蛋白质测定仪。 3.14 离心机。 3.15 中速定性滤纸。 4 操作步骤与计算 4.1 游离氨含量的测定 4.1.1 操作步骤
称取粉碎试样3-5g（精确至0.01g）于250mL三角瓶中。吸取100mL 20℃蒸馏水于三角瓶中，振摇使试样不结块，均匀分散。 将三角瓶固定于摇床，温度控制在(20士2)℃.，振荡60 min。 取下三角瓶，将溶液用中速定性滤纸过滤。过滤完毕后，取10mL上清液，上机蒸馏、滴定；或采用常量直接蒸馏式或
半微量水蒸气蒸馏式凯氏蒸馏装置蒸馏、滴定。 4.1.2 计算
游离氨含量（﹪）={[(V-V0)×C×0.017×100]/(m×10)}×100%
式中：
V——滴定样品消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； V0——滴定空白消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； C ——盐酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； m ——试样的质量，单位为克（g）； 0.017——铵根离子的毫克当量数。
4.2 水溶性蛋白的测定 4.2.1 操作步骤
称取发酵豆粕m 3～5g（准确至0.0001 g）于250mL具塞三角瓶内，准确加入100.00mL蒸馏水。摇匀后，室温振荡30min，静置5min，将上清液倒入50mL离心管内,4800r/min，离心15min。
取上清液10.00mL于消化管内，加入2g～3g混合催化剂，12mL浓硫酸， 将蒸馏管置于通风橱中加热消化。开始用100℃低温加热0.5h，至黑泡沫消失，控制瓶中泡沫不超过瓶管的2/3，然后再升温至400℃～430℃，加热1.5h，至消化液呈透明的蓝紫色时，继续加热0.5h。
冷却后，缓慢向消化管内加入约10mL蒸馏水，摇匀，冷却后蒸馏。2%的硼酸溶液吸收，0.1mol/L的盐酸溶液滴定，消耗盐酸体积V。 4.2.2 计算：
CP水(%)={[（V-V0）×CHCL×0.014×6.25×100]/(m×10)} ×100% —游离氨含量（﹪）×0.014×6.25∕0.017
式中：
V——滴定样品消化液所耗盐酸标准溶液的体积，mL； V0——滴定空白消化液所耗盐酸标准溶液的体积，mL； C ——盐酸标准溶液的浓度，mol/L；
m ——试样的质量，g； 0.014━氮的毫克当量数；
6.25 ━氮换算成蛋白质的平均系数。
二、发酵豆粕中小肽含量的测定——三氯乙酸沉淀法
1、方法原理
试样用三氯乙酸（水）溶解后，使蛋白质和大分子肽沉淀，过滤，上清液消化蒸馏滴定，测定三氯乙酸（水）沉淀蛋白的量，减去游离氨的量既得小肽的量。 2、试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 2.1 硫酸（H2SO4）。 2.2 盐酸(HCl)。
2.3 20g/L硼酸溶液：称取100g硼酸（H3BO4）溶于5000mL水中。
2.4 400g/L氢氧化钠溶液：称取2000g氢氧化钠（NaOH）溶于5000mL水中。 2.5 盐酸标准溶液[c(HCl)=0.1mol/L]：量取8.3mL盐酸，溶于1000mL水中。 标定：精密称取经270℃～300℃干燥恒重过的基准碳酸钠约0.15g，加水50mL溶解，加甲基红—溴甲酚绿混合指示剂10滴，用本液滴定到溶液由绿色变为紫红色。煮沸2min，冷却至室温， 继续滴定到溶液由绿色变为暗紫色，同时做空白试验。
盐酸标准溶液的浓度按式（1）计算： C= 式中：
m—无水碳酸钠的质量，单位为克（g）； V1—盐酸溶液用量，单位为毫升（mL）；
m
………………………………………………(1)
V1−V2×0.0530
V2—空白试验盐酸溶液用量，单位为毫升（mL）； 0.0530—Na2CO3的毫克当量。 2.6 混合指示剂。
1.0g/L甲基红乙醇溶液：称取0.1g甲基红溶于100mL乙醇中；5.0g/L溴甲酚绿乙醇溶液：称取0.5g溴甲酚绿溶于100mL乙醇中；两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月。
2.7 混合催化剂[（CuSO4+K2SO4）=10+100]:称取10g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和100g硫酸钾（K2SO4）,混匀，研磨，过 0.42mm筛。 2.8 硫酸铵。
2.9 150g/L三氯乙酸溶液：取150g三氯乙酸溶于1000mL水中。 3、仪器设备
3.1 实验室用样品粉碎机或研钵。 3.2 分样筛: 孔径0.45mm(40目)。 3.3 分析天平: 感量0.0001g。 3.4 滴定管: 酸式, 25或10mL。 3.5 具塞三角瓶: 250mL。 3.6 恒温振荡器。 3.7 消煮炉或电炉。
3.8 凯氏烧瓶: 100或500mL。
3.9 凯氏蒸馏装置: 常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式。 3.10 三角瓶: 250mL。 3.11 容量瓶: 100mL。 3.12 消煮管：250 mL。
3.13 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动，全自动蛋白质测定仪。 3.14 离心机。 3.15 中速定性滤纸。 4 操作步骤与计算 4.1 游离氨含量的测定 4.1.1 操作步骤
称取粉碎试样3-5g（精确至0.01g）于250mL三角瓶中。吸取100mL 20℃蒸馏水于三角瓶中，振摇使试样不结块，均匀分散。 将三角瓶固定于摇床，温度控制在(20士2)℃.，振荡60 min。 取下三角瓶，将溶液用中速定性滤纸过滤。过滤完毕后，取10mL上清液，上机蒸馏、滴定；或采用常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式凯氏蒸馏装置蒸馏、滴定。 4.1.2 计算
游离氨含量（﹪）={[(V-V0)×C×0.017×100]/(m×10)}×100% 式中：
V——滴定样品消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； V0——滴定空白消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； C ——盐酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； m ——试样的质量，单位为克（g）； 0.017——铵根离子的毫克当量数。 4.2 小肽含量的测定 4.2.1 操作步骤
称取发酵豆粕m 3～5g（准确至0.0001 g）于250mL具塞三角瓶内，准确加入100.00mL 150g/L的三氯乙酸溶液。摇匀后，室温振荡30min，静置5min，将上清液倒入50mL离心管内,4800r/min，离心15min。
取上清液10.00mL于消化管内，加入2g～3g混合催化剂，12mL浓硫酸，420℃消化1.5h。冷却后，缓慢向消化管内加入约10mL蒸馏水，摇匀，冷却后蒸馏。2%的硼酸溶液吸收，0.1mol/L的盐酸溶液滴定，消耗盐酸体积V。 4.2.2. 计算：
小肽含量（﹪）= CP三氯乙酸(%)—游离氨含量（﹪）×0.014×6.25∕0.017； CP三氯乙酸(%)={[（V-V0）×CHCL×0.014×6.25×100]/(m×10)} ×100% 二式中：
V——滴定样品消化液所耗盐酸标准溶液的体积，mL； V0——滴定空白消化液所耗盐酸标准溶液的体积，mL； C ——盐酸标准溶液的浓度，mol/L；
m ——试样的质量，g； 0.014━氮的毫克当量数；
6.25 ━氮换算成蛋白质的平均系数； 0.017——铵根离子的毫克当量数。
三、发酵豆粕中总酸的测定——NaOH 滴定法
1 原理
根据酸碱中和反应的实质: H++OH-= H2O，即K·C标·V标= C待·V待。已知碱的体积,并知道NaOH标准溶液的物质的量浓度,可以计算出发酵豆粕中总酸的含量（由乳酸折算成总酸）。 2 试剂和材料
2.1 NaOH标准溶液[C(NaOH)=0.1mol/L]：称取4.000g NaOH溶于1000mL新沸
过的冷水中。
标定：取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.6g,精密称定，加新沸过的冷水50mL，振摇，使其尽量溶解，加酚酞指示液2滴，用本液滴定；在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。每1mL氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于20.42mg的邻苯二甲酸氢钾。 2.2 NaOH标准溶液[C(NaOH)=0.02mol/L]：0.1 mol/L NaOH标准溶液加新沸过
的冷水稀释制成。必要时，可用盐酸滴定液（0.02mol/L）标定浓度。 2.3 酚酞指示液：取酚酞1g，加乙醇100mL使溶解，即得。 3.仪器、设备
3.1 分析天平，感量0.001g。 3.2 容量瓶：100、1000mL。 3.3 烧杯：100 mL。 3.4 磁力搅拌器。 3.5 高速离心机。 3.6 离心管：50mL。
3.7 碱式滴定管：10或20mL。 3.8 pH计：分度值0.05。 3.9 粉碎机。 4 测定步骤
称取样品10g（准确至0.001g），加到250mL烧杯中，加蒸馏水100mL（因搅拌时一些粉末会贴壁，需用玻璃棒，可先加90mL，再用10mL冲洗玻璃棒），在磁力搅拌器上搅拌30min 后，过滤于锥形瓶中（或转入50mL离心管中，4000rpm 离心5min），准确移取滤液10.00mL，加入40.00mL新沸过的冷水后，用0.02M 的标准NaOH溶液滴定，酚酞为指示剂（2-3滴），至溶液变为粉红色为滴定终点（若样品颜色太深，难以观察终点，以pH=8.15为滴定终点）。记录消耗的NaOH的体积，记为V (mL)。 同时做空白对照。 5 计算
式中：V: 样品消耗标准NaOH溶液的体积数，mL；
V0: 未发酵豆粕滴定消耗标准NaOH溶液的体积数，mL； CNaOH: NaOH溶液的浓度，mol/L； 90.08: 乳酸的分子量； m:称取样品的质量，g。
乳酸%﹦
m×
（V-V0）×CNaOH××
90.08 1000
×100
四 发酵豆粕中寡糖的测定— 薄层层析法（TLC）
1.原理
植物组织的可溶性糖可用一定浓度的乙醇提取出来，经去杂除去糖提取液中蛋白质等干扰测糖的杂质，获得较纯的可溶性糖混合液，薄层层析是一种基于被分离物质的极性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。 2.试剂和材料
2.1 水苏糖和棉籽糖标准品（均为sigma公司）。
2.2 水苏糖和棉籽糖标样：用80％的乙醇溶液，分别配制2%的水苏糖和0.5%的棉籽糖标样溶液，4℃保藏备用。 2.3 乙醇溶液：80%、95%。
2.4 展开剂：正丙醇：乙酸：水＝1：1：0.1。
2.5 显色剂：将10mL正磷酸的加入90mL95%乙醇溶液中混匀，再加入0.1g的1-萘酚使之充分溶解，常温储存备用。 3.仪器、设备
3.1 200×60×200mm层析缸。
3.2 200×100mm G型硅胶层析板，厚度：0.20～0.25mm。 3.3 微量进样器1ul、5ul。 3.4 电热恒温水浴锅。 3.5 高速离心机。 3.6 电热鼓风干燥箱。
3.7 冰箱：控制温度于4℃±3℃。 4. 测定步骤
4.1 样品提取液的制备
准确称取发酵豆粕样品5.0g 于250mL 三角瓶中，加入50.0mL 80％的乙醇溶液，70℃水浴浸提1h。取10mL浸提液，10000rpm离心10min，4℃保藏备用。4.2 硅胶板预处理
硅胶板使用前进行切割处理：两侧边缘各割0.5cm硅胶层，上边缘割1cm，以消除硅胶涂布不均现象，然后把硅胶板放入100-105℃烘箱中活化一小时。 4.3 点样
取活化过的硅胶G薄板，根据测样量的多少，在距底边2cm水平线上确定几个点，应相互间隔1cm，其中一个点点棉籽糖和水苏糖标准溶液，剩余点点样品提取液。标样点样量为1μL，样品点样量为5μL，室温风干点样点。 4.4 展开
在层析缸中加入合适量的展开液，并在内壁上贴两条与缸一样高、宽浸透展开剂的滤纸条，密封。硅胶板倒置放在层析缸较高的一面，饱和约1h。再将硅胶板正放在层析缸较低的一面，在120ml展开液中展开，展开至离硅胶板前沿1~2cm 处（此过程大约4h）。即可停止展层，取出自然晾干或用吹风机吹干。 4.5 显色
喷淋显色剂，在140℃下烘5min 显色。
五 SDS-PAGE电泳方法
1 SDS-PAGE电泳试剂的配制
1.1 Acr/Bis：丙烯酰胺 29.2 g，甲叉双丙烯酰胺 0.8 g，ddH2O定容至100 mL，4℃保存。
1.2 10% SDS：SDS 10 g，用ddH2O定容至100 mL。
1.3 1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)：Tris 18.15 g，用80 mL ddH2O溶解，用HCl 调pH=8.8，ddH2O定容至100 mL，4℃保存。
1.4 0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.8)：Tris 6 g，用60 mL ddH2O溶解，用HCl 调pH=6.8，ddH2O定容至100 mL，4 ℃保存。
1.5 10×电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 30.3 g，甘氨酸 144.0 g，SDS 10.0 g，去离子水定容至1 L。
1.6 10% APS：APS 0.1 g，1 mL ddH2O溶解，分装后冻存于-20 ℃。 1.7 5×样品缓冲液(Loading Buffer)：甘油2.5mL，10% SDS 2mL，0.5%(w/v)溴酚兰0.2 mL，β-巯基乙醇 500 μL，0.5 mol/L Tris-HCl (pH 6.8) 1.25 mL，ddH2O定容至10 mL。
1.8 染色液：考马斯亮兰R-250 1.25 g，冰醋酸 50 mL，甲醇 200 mL，去离子水定容至500 mL，过滤后可反复多次使用。
1.9 脱色液：乙醇 200 mL，冰醋酸 100 mL，去离子水 700 mL。 2、SDS-PAGE电泳凝胶的配制
12% 分离胶(8 mL) ddH2O 1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8
Acr/Bis 10% SDS 10% APS TEMED
3、SDS-PAGE电泳方法
3.1 样品处理：称取1g精细粉碎的样品至20mlTris-Hcl缓冲液中（pH8.0 0.1mol/L），室温振荡1h，低温高速离心（10000r 20min）。所得上清即可用于SDS-PAGE。将40 μL上清与10 μL 5×样品缓冲液混合，沸水中煮5 min。标样与样品做同样处理。
3.2 电泳过程：用微量进样器取20 μL上样液，加于电泳孔中，200 V电压恒压电泳40 min。电泳完毕后将胶取下，用考马斯亮兰染色液染色30 min，脱色液脱色摇床脱色。
2.70 mL 2 mL 3.2 mL 80 μL 50 μL 5 μL
4% 浓缩胶(2.5 mL) ddH2O 0.5 mol/L Tris-HCl，pH6.8
Acr/Bis 10%SDS 10%APS TEMED
1.525 mL 625 μL 325 μL 25 μL 50 μL 5 μL