原代细胞培养相关产品 市场拓展培训
Your Reliable Source of Human and Animal Primary Cells
齐氏生物科技有限公司
2015年第三次经销商培训会 技术部 张亚洲
Your Your Reliable Reliable Source Source of of Human Human and and Animal Animal Primary Primary Cells Cells
目录
原代细胞培养基本概念
原代细胞培养基本要求
原代细胞培养基本技术
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原代细胞培养
指的是将细胞从动物体中直接取出，模 拟体内生理环境，在适当温度、氧气浓度和 一定营养条件下，使之生存和生长并维持其 结构和功能的方法。
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优点
组织细胞刚
脱离生物体，生 物性状尚未发生
较大变化，在一 定程度上能够反 映体内的状态。
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传代培养
原代培养的细胞在 生长、增殖一定时间后
，由于空间不足或细胞 密度过大导致营养枯竭
，会影响细胞的生长， 因此需要进行分瓶培养
，即称为传代培养。
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培养细胞的生长方式及类型
贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大
体分为（1）成纤维细胞型细胞（2）上皮细胞
型细胞（3）多形型细胞 悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。
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（1）成纤维细胞型细胞
梭形或不规则三角形，细胞中央有卵圆形核，2-3个突起，
生长时呈放射状、漩涡状走向。
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（2）上皮型细胞
扁平、多角形，圆形核，连成单层细胞时呈鹅卵石状。
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（3）多形型细胞
形态上不规则型的细胞，一般分胞体和胞突两部分 ,
如神经组织源细胞。
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（4）悬浮生长型细胞
胞体始终呈球形，培养效率高、易大规模生产。
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贴附生长型细胞的生长过程
游离期 贴壁期
潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
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原代细胞培养基本要求
常用仪器设备 培养器皿 培养基
血清
其他细胞培养试剂
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培养基
干粉培养基和液体培
养基 常用的培养基类型 RPMI-1640、H-DMEM、 L-DMEM、DMEM/F12、 M199、α-MEM等。
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血清
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）； ②多种金属离子； ③激素；
④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；
⑤各种生长因子； ⑥转移蛋白；
⑦不明成分；
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血清使用注意事项
① 血清必须贮存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃，请勿超 过一个月。 ② 逐步解冻法: -20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装。 ③ 勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变 得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到 破坏，而影响血清之品质。 ④ 热灭活（heat-inactivation）是指56℃, 30 min加热已 完全解冻之血清。此热处理之目的是使血清中之补体成 份去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会 造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。
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谷氨酰胺
谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都
要添加。由于谷氨酰胺在溶液中很容易降解，4℃下放置2
周即可分解约50%，所以都是在使用前添加。 使用终浓度为1-4mM，一般配制为100倍浓缩液，过滤除菌， 分装后-20℃保存。
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原代细胞培养基本技术
• 细胞原代培养 • 细胞换液与传代 • 细胞冻存与复苏
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原代细胞培养流程图
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原代细胞纯化方式-差速贴壁法
小鼠心肌成纤维细胞、小鼠心肌细胞
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原代细胞纯化方式-密度梯度分离法
小鼠肝星状细胞
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原代细胞纯化方式-化学药物法
大鼠神经元
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小鼠主动脉内皮细胞
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小鼠主动脉平滑肌细胞
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大鼠膀胱上皮细胞
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大鼠食管上皮细胞
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大鼠气管上皮细胞
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大鼠胃粘膜上皮细胞
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细胞换液
换液：
全量换液和半量换液 换液时机的选择：
培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸 性物质积累增多，pH值下降，营养液酸化 变黄。
细胞状态
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细胞传代
• 细胞生长密度不高时，不能急于传代；
• 原代培养的贴壁细胞需控制消化时间； • 吹打已消化的细胞应减少机械损伤；
• 首次传代时细胞接种数量要多一些；
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细胞冻存
细胞冷冻要点
冻存过程要缓慢： – 4℃ 30 分钟→-20℃ 60 分钟 →-80℃ 16－18 小时（或过夜） →液氮长期保存 – 或使用程序降温盒，每秒下降1 ℃ 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。 细胞浓度控制在：5x106－2x107/ml。
常用细胞冷冻保存液
• 10％DMSO＋20%血清+基础培养基 • 10％甘油＋20%血清+基础培养基
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细胞复苏
• 快速解冻
– 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻 管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）
• 解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的 细胞培养瓶中直接进行培养，24 h后再用新鲜完 全培养液替换旧培养液，以去除DMSO • 如果细胞对冷冻保护剂特别敏感
– 解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完 全生长培养液的培养瓶中
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问题分析：活性和纯度低
组织的质量和位置； 酶液的种类和消化时间； 培养液的成分和质量；
培养瓶或皿的预处理；
传代、冻存和复苏的步骤。
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齐氏生物科技有限公司 订购电话：400-8822-003 销售热线：[1**********] 网址： www.chiscientific.cn 邮箱： [email protected]
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目录
原代细胞培养基本概念
原代细胞培养基本要求
原代细胞培养基本技术
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原代细胞培养
指的是将细胞从动物体中直接取出，模 拟体内生理环境，在适当温度、氧气浓度和 一定营养条件下，使之生存和生长并维持其 结构和功能的方法。
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优点
组织细胞刚
脱离生物体，生 物性状尚未发生
较大变化，在一 定程度上能够反 映体内的状态。
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传代培养
原代培养的细胞在 生长、增殖一定时间后
，由于空间不足或细胞 密度过大导致营养枯竭
，会影响细胞的生长， 因此需要进行分瓶培养
，即称为传代培养。
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培养细胞的生长方式及类型
贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大
体分为（1）成纤维细胞型细胞（2）上皮细胞
型细胞（3）多形型细胞 悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。
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（1）成纤维细胞型细胞
梭形或不规则三角形，细胞中央有卵圆形核，2-3个突起，
生长时呈放射状、漩涡状走向。
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（2）上皮型细胞
扁平、多角形，圆形核，连成单层细胞时呈鹅卵石状。
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形态上不规则型的细胞，一般分胞体和胞突两部分 ,
如神经组织源细胞。
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（4）悬浮生长型细胞
胞体始终呈球形，培养效率高、易大规模生产。
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贴附生长型细胞的生长过程
游离期 贴壁期
潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
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常用仪器设备 培养器皿 培养基
血清
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培养基
干粉培养基和液体培
养基 常用的培养基类型 RPMI-1640、H-DMEM、 L-DMEM、DMEM/F12、 M199、α-MEM等。
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血清
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）； ②多种金属离子； ③激素；
④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；
⑤各种生长因子； ⑥转移蛋白；
⑦不明成分；
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血清使用注意事项
① 血清必须贮存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃，请勿超 过一个月。 ② 逐步解冻法: -20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装。 ③ 勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变 得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到 破坏，而影响血清之品质。 ④ 热灭活（heat-inactivation）是指56℃, 30 min加热已 完全解冻之血清。此热处理之目的是使血清中之补体成 份去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会 造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。
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谷氨酰胺
谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都
要添加。由于谷氨酰胺在溶液中很容易降解，4℃下放置2
周即可分解约50%，所以都是在使用前添加。 使用终浓度为1-4mM，一般配制为100倍浓缩液，过滤除菌， 分装后-20℃保存。
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原代细胞培养基本技术
• 细胞原代培养 • 细胞换液与传代 • 细胞冻存与复苏
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原代细胞培养流程图
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原代细胞纯化方式-差速贴壁法
小鼠心肌成纤维细胞、小鼠心肌细胞
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小鼠肝星状细胞
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原代细胞纯化方式-化学药物法
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小鼠主动脉内皮细胞
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大鼠膀胱上皮细胞
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细胞换液
换液：
全量换液和半量换液 换液时机的选择：
培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸 性物质积累增多，pH值下降，营养液酸化 变黄。
细胞状态
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细胞传代
• 细胞生长密度不高时，不能急于传代；
• 原代培养的贴壁细胞需控制消化时间； • 吹打已消化的细胞应减少机械损伤；
• 首次传代时细胞接种数量要多一些；
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细胞冻存
细胞冷冻要点
冻存过程要缓慢： – 4℃ 30 分钟→-20℃ 60 分钟 →-80℃ 16－18 小时（或过夜） →液氮长期保存 – 或使用程序降温盒，每秒下降1 ℃ 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。 细胞浓度控制在：5x106－2x107/ml。
常用细胞冷冻保存液
• 10％DMSO＋20%血清+基础培养基 • 10％甘油＋20%血清+基础培养基
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细胞复苏
• 快速解冻
– 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻 管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）
• 解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的 细胞培养瓶中直接进行培养，24 h后再用新鲜完 全培养液替换旧培养液，以去除DMSO • 如果细胞对冷冻保护剂特别敏感
– 解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完 全生长培养液的培养瓶中
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问题分析：活性和纯度低
组织的质量和位置； 酶液的种类和消化时间； 培养液的成分和质量；
培养瓶或皿的预处理；
传代、冻存和复苏的步骤。
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