Biolog 微生物鉴定步骤
一 检测原理
Biolog 微生物鉴定系统测试的是微生物在鉴定板中利用或氧化化和物的能力。测试会产生特征性的紫色孔模式，组成代谢指纹。所有必需的营养物质和生化试剂都预先加进96孔板中，四唑紫是一种氧化还原染料，指示碳源的利用情况。. 鉴定步骤非常简单，纯化分离到的菌株经扩大培养，再制成接种液加到鉴定板中。在培养过程中，一些孔中的化学物质能被氧化并将显色物质成紫色，对照孔（A-1）和阴性孔仍然为无色。鉴定板在相应的培养条件下培养4-6小时或16-24小时即可形成代谢模式。系统软件自动和数据库对比，如果能找到合适的匹配，就可以得出一个鉴定结果。
二 所需器材和消耗品：
培养基、接种液、巯基乙酸钠、长棉签、接种棒、储液槽、八道移液器、移液器头、浊度仪、浊度标准品、控温培养箱和相应的鉴定板。其中接种液自行配制，接种棒、储液槽可选用国产品牌代替。
三 鉴定步骤：
第一步：
在用户自己的培养基上纯化菌株，如果菌株为冻干或冷冻样品，需要传代培养2-3代，让菌株恢复活力。
对纯化好的菌株做革兰氏染色，确定菌株是革兰氏阴性还是阳性。观察菌落外部形态或用显微镜观察菌株形态，确定是酵母还是丝状真菌，是球菌还是杆菌。
如果是革兰氏阴性菌，还需要最终确认是肠道菌、非肠道菌或苛生菌。方法是，氧化酶阳性或氧化酶阴性但三糖铁实验为K/K或K/Aw ，则该菌株为非肠道菌(GN-NENT)，氧化酶阴性以及三糖铁实验为A/A或K/A，则该菌株为肠道菌(GN-ENT)。如果菌株①需要在巧克力培养基上或需要6.5% CO2培养，②在BUG+B培养基上生长非
常差，形成针尖大小的菌落，那么可以认为这些菌是苛生菌(GN-FAS)。大多数苛生菌都是从哺乳动物的呼吸道里分离出来的，如Actinobacillus, Alysiella, Brucella, Capnocytophaga, CDC Group DF-3, CDC Group EF-4, Eikenella, Haemophilus, Kingella, Moraxella, Neisseria, Simonsiella, Suttonella,和Taylorella 。
如果是革兰氏阳性菌，用革兰氏染色可以很容易的区分球菌和杆菌，推荐再做一个过氧化氢酶实验，最终确定是球菌还是杆菌。通过革兰氏染色或观察菌落形态可以区分出芽孢杆菌。
微生物的扩大培养应该用Biolog 推荐的培养基和培养条件，以便使微生物达到最佳的代谢活性，进而准确的和数据库中的代谢模式匹配。
微生物应该是新鲜的，确保其处于指数增长期，因为一些菌株在达到稳定期时会失去生存能力或代谢活性，推荐的培养周期为4-24个小时。
如果扩大培养的量不足以配制相应的浊度，可以培养多个平板，培养时间可以延长到48个小时。 第二步：
首先确定浊度仪没开启电源的时候，指针应指在0%，如果没有，用螺丝刀调整。开启电源，取未开盖的装有接种液的试管，擦干净管壁，放入浊度仪，指针应指在100%，如果没有，旋动右方旋钮。然后用浊度标准管检验，读数在±2%都是正常的。要使用哪管接种液，就用相应的试管做100%校正，不要在浊度仪的光路中旋转试管。 在鉴定革兰氏阴性肠道菌和苛生菌的时候，在接种液里应该加准确三滴巯基乙酸钠。巯基乙酸钠的作用是抑制芽孢形成，并且可以部分或完全的抑制A-1或其它孔由于微生物利用自身分泌的聚多糖荚膜而出现的紫色。一些非肠道菌液需要添加巯基乙酸钠。
按照下列步骤制备均匀的菌悬液：用接种液将棉签稍微浸湿，用棉签在菌落上面轻轻的滚动可以将菌落取到接种液中，从而不会将培养基或其它营养物质带入接种液。先取单菌落，不够再取生长紧密的菌落。在试管内壁接种液液面的上方，旋转挤压棉签可以将菌落团分散。然后上下移动棉签，将分散的菌落和接种液充分混合形成均一，无菌团的菌悬液。如果菌悬液有菌团，可以让菌团沉到管底。 调整浊度直至达到允许的范围，增加接种液或添加菌落可以降低或升高菌悬液的密度。 将菌悬液接种到鉴定板上，不要超过20分钟。如果长时间部接种到鉴定板上，一些菌会失去代谢活性。 第三步： 将鉴定板编上相应的号码。把菌悬液倒入储液槽，不要全部倒入，因为试管底部可能有未分散的菌团。按照不同的鉴定板所需的加样量进行移液器的程序选择，将移液器头安放到移液器上，必要时可以用手加固，以免
造成上方漏气。吸取菌悬液，观察每个移液器头中的液面是否一致，如果不一致，放出菌悬液，加固移液器头。加完菌悬液后，盖上盖子。 第四步：
培养环境根据所鉴定的菌株种类而定。准备一个塑料容器，在底部铺上湿纸巾，把鉴定板放在纸巾上，可以防止鉴定板外缘孔水分的蒸发。对于革兰氏阴性阳性菌，鉴定板培养4-6个小时可以进行一次读数，过夜培养（16-24个小时）可再进行一次读数。厌氧菌在培养20-24个小时后进行一次读数即可。酵母和丝状真菌所需培养时间稍长，一般间隔24个小时读一次数。 第五步：
开启读数仪和电脑，打开Biolog 软件，并对读数仪进行初始化，设置好各项参数（培养时间、菌株名称、菌株编号、菌株类型），用纸巾擦干净培养好的鉴定板底部，放入读数仪，A-1孔位于左上方。即可点击“Read This”进行读数。鉴定结果自动显示在屏幕下方，将所得数据进行保存即可。
四 注意事项
为了得到准确和可重复性的结果，务必注意下列事项。
1. 所要进行鉴定的微生物必须是纯种，此系统不是为在混合菌群中鉴定单一菌种而设计的。
2. 在鉴定之前，选择合适的培养基和进行适量的传代培养是非常重要的。在接种之前，许多菌种会因为培养条件的不同而产生不同的代谢模式。
3. 在操作过程中必须使用无菌器材和进行无菌操作，杂菌的污染会干扰结果。
4. 大多数消耗品为一次使用，重复使用的如试管，移液器枪头必须把去污剂清洗干净。
5. 在将菌悬液接种到鉴定板之前，应把鉴定板拿出冰箱，让鉴定板恢复到常温。因为有些菌种（如Neisseria ）对温度的快速变化很敏感。
6. 仔细校正浊度计，接种菌悬液的浊度应在规定的范围内。
7. 鉴定板中包含多种对温度和光照敏感的物质，如果个别孔出现棕黑色，说明碳源已经被降解。有时候，在保质期内或超过保质期不长的时间里，个别孔会出现黄色或粉红色，这是正常的。 8. Biolog 是基于测试活菌的代谢特性。一些菌在很短的时间里会由于温度、pH 和渗透压的压力而丧失代谢活性。
所以为了获得良好的鉴定结果必须确保菌种为活菌，操作要小心。 9. 为了延长鉴定板的保质期限，应在2-8℃的条件下避光保存。
生态板（ECO ）
一 鉴定步骤
①土壤样品的采集，将土壤样品加入到灭菌水里接种。30 min后，用移液枪取1 mL污泥到1．5mL 离心管中。 ②在10 000 r／min 下离心20 min，弃去上清液，加1 mL生理盐水，在振荡器上振动5 min使之混匀；再于10 000 r ／min 下离心20 min，重复2次，除去其中的碳源；弃去上清液，加1 mL生理盐水，在振荡器上振动5 min使之混匀，于2 000 r／min 下离心1 min。
③ 取上清液倒人装有20 mL已灭菌生理盐水(NaC1，0．85％) 的试管中，并使其OD 590维持在0．13±0．02。 ④ 将上述稀释液加入Biolog ECO微平板中，(150 L／孔) ，然后在20℃下培养，每隔12 h用Biolog 细菌自动读数仪读取数据，连续测定10 d。
二 数据处理方法（采用SAS 统计软件进行多样性指数差异显著分析和主成分分析）
1采用Biolog 微平板培养120h 的数据进行数据统计，○采用Shannon 指数、Shannon 均匀度、Simpson 指数、Mclniosh 指数和Mclniosh 均匀度各种多样性指数来反映细菌群落代谢功能的多样性。
2Biolog ECO 平板反应一般采用每孔颜色平均变化率(AWCD)来描述。○计算公式为：{AWCD=[Σ(Ci—R)]／31}。其中，Ci 是除对照孔外各孔吸光度值，R 是对照孔吸光度值。
3通过主成分分析(PCA)将Biolog 生态板(ECO) 平板的31种碳源的测定结果形成的描述细菌群落代谢特征的多○
元向量变换为互不相关的主元向量（PC1和PC2是主元向量的分量），在降维后的主元向量空间中可以用点的位置直观地反映出不同细菌群落的代谢特征。
免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。它以酶作为标记物，与抗体或抗原联结，与相应的抗原或抗体作用后，通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量，亦可用于组织
中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术。
目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA ），它是使抗原或抗体吸附于固相载体，使随后进行的抗原抗体反应均在载体表面进行，从而简化了分离步骤，提高了灵敏度，即可检测抗原，也可检测抗体。实验方法包括间接法、夹心法及竞争法。
为了检测抗原可用夹心法。将特异性抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯制成的小管、小盘或小孔）上，然后加被测溶液，倘样品中有相应抗原，则与抗体在载体表面形成复合物。洗涤后加入酶标记的特异性抗体，后者通过抗原也结合到载体的表面。洗去过剩的标记抗体，加入酶的底物，在一定时间内经酶催化产生的有色产物的量与溶液中抗原含量成正比，可用肉眼观察或分光光度计测定。
为了检测抗体可用间接法。使抗原吸附于载体上，然后加入被测血清，如有抗体，则与抗原在载体上形成复合物。洗涤后加酶标记的抗球蛋白（抗抗体）与之反应。洗涤后加底物显色，有色产物的量与抗体的量成正比。
常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP ）和碱性磷酸酶（AP ），相应的底物分别是邻苯二胺（OPD ）和对硝基苯磷酸盐，前者呈色反应为棕黄色，后者为蓝色。可用目测定性，也可用酶标仪测定光密度（OD ）值以反映抗原含量。
即:酶联免疫吸附剂测定原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的
比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
Biolog 微生物鉴定步骤
一 检测原理
Biolog 微生物鉴定系统测试的是微生物在鉴定板中利用或氧化化和物的能力。测试会产生特征性的紫色孔模式，组成代谢指纹。所有必需的营养物质和生化试剂都预先加进96孔板中，四唑紫是一种氧化还原染料，指示碳源的利用情况。. 鉴定步骤非常简单，纯化分离到的菌株经扩大培养，再制成接种液加到鉴定板中。在培养过程中，一些孔中的化学物质能被氧化并将显色物质成紫色，对照孔（A-1）和阴性孔仍然为无色。鉴定板在相应的培养条件下培养4-6小时或16-24小时即可形成代谢模式。系统软件自动和数据库对比，如果能找到合适的匹配，就可以得出一个鉴定结果。
二 所需器材和消耗品：
培养基、接种液、巯基乙酸钠、长棉签、接种棒、储液槽、八道移液器、移液器头、浊度仪、浊度标准品、控温培养箱和相应的鉴定板。其中接种液自行配制，接种棒、储液槽可选用国产品牌代替。
三 鉴定步骤：
第一步：
在用户自己的培养基上纯化菌株，如果菌株为冻干或冷冻样品，需要传代培养2-3代，让菌株恢复活力。
对纯化好的菌株做革兰氏染色，确定菌株是革兰氏阴性还是阳性。观察菌落外部形态或用显微镜观察菌株形态，确定是酵母还是丝状真菌，是球菌还是杆菌。
如果是革兰氏阴性菌，还需要最终确认是肠道菌、非肠道菌或苛生菌。方法是，氧化酶阳性或氧化酶阴性但三糖铁实验为K/K或K/Aw ，则该菌株为非肠道菌(GN-NENT)，氧化酶阴性以及三糖铁实验为A/A或K/A，则该菌株为肠道菌(GN-ENT)。如果菌株①需要在巧克力培养基上或需要6.5% CO2培养，②在BUG+B培养基上生长非
常差，形成针尖大小的菌落，那么可以认为这些菌是苛生菌(GN-FAS)。大多数苛生菌都是从哺乳动物的呼吸道里分离出来的，如Actinobacillus, Alysiella, Brucella, Capnocytophaga, CDC Group DF-3, CDC Group EF-4, Eikenella, Haemophilus, Kingella, Moraxella, Neisseria, Simonsiella, Suttonella,和Taylorella 。
如果是革兰氏阳性菌，用革兰氏染色可以很容易的区分球菌和杆菌，推荐再做一个过氧化氢酶实验，最终确定是球菌还是杆菌。通过革兰氏染色或观察菌落形态可以区分出芽孢杆菌。
微生物的扩大培养应该用Biolog 推荐的培养基和培养条件，以便使微生物达到最佳的代谢活性，进而准确的和数据库中的代谢模式匹配。
微生物应该是新鲜的，确保其处于指数增长期，因为一些菌株在达到稳定期时会失去生存能力或代谢活性，推荐的培养周期为4-24个小时。
如果扩大培养的量不足以配制相应的浊度，可以培养多个平板，培养时间可以延长到48个小时。 第二步：
首先确定浊度仪没开启电源的时候，指针应指在0%，如果没有，用螺丝刀调整。开启电源，取未开盖的装有接种液的试管，擦干净管壁，放入浊度仪，指针应指在100%，如果没有，旋动右方旋钮。然后用浊度标准管检验，读数在±2%都是正常的。要使用哪管接种液，就用相应的试管做100%校正，不要在浊度仪的光路中旋转试管。 在鉴定革兰氏阴性肠道菌和苛生菌的时候，在接种液里应该加准确三滴巯基乙酸钠。巯基乙酸钠的作用是抑制芽孢形成，并且可以部分或完全的抑制A-1或其它孔由于微生物利用自身分泌的聚多糖荚膜而出现的紫色。一些非肠道菌液需要添加巯基乙酸钠。
按照下列步骤制备均匀的菌悬液：用接种液将棉签稍微浸湿，用棉签在菌落上面轻轻的滚动可以将菌落取到接种液中，从而不会将培养基或其它营养物质带入接种液。先取单菌落，不够再取生长紧密的菌落。在试管内壁接种液液面的上方，旋转挤压棉签可以将菌落团分散。然后上下移动棉签，将分散的菌落和接种液充分混合形成均一，无菌团的菌悬液。如果菌悬液有菌团，可以让菌团沉到管底。 调整浊度直至达到允许的范围，增加接种液或添加菌落可以降低或升高菌悬液的密度。 将菌悬液接种到鉴定板上，不要超过20分钟。如果长时间部接种到鉴定板上，一些菌会失去代谢活性。 第三步： 将鉴定板编上相应的号码。把菌悬液倒入储液槽，不要全部倒入，因为试管底部可能有未分散的菌团。按照不同的鉴定板所需的加样量进行移液器的程序选择，将移液器头安放到移液器上，必要时可以用手加固，以免
造成上方漏气。吸取菌悬液，观察每个移液器头中的液面是否一致，如果不一致，放出菌悬液，加固移液器头。加完菌悬液后，盖上盖子。 第四步：
培养环境根据所鉴定的菌株种类而定。准备一个塑料容器，在底部铺上湿纸巾，把鉴定板放在纸巾上，可以防止鉴定板外缘孔水分的蒸发。对于革兰氏阴性阳性菌，鉴定板培养4-6个小时可以进行一次读数，过夜培养（16-24个小时）可再进行一次读数。厌氧菌在培养20-24个小时后进行一次读数即可。酵母和丝状真菌所需培养时间稍长，一般间隔24个小时读一次数。 第五步：
开启读数仪和电脑，打开Biolog 软件，并对读数仪进行初始化，设置好各项参数（培养时间、菌株名称、菌株编号、菌株类型），用纸巾擦干净培养好的鉴定板底部，放入读数仪，A-1孔位于左上方。即可点击“Read This”进行读数。鉴定结果自动显示在屏幕下方，将所得数据进行保存即可。
四 注意事项
为了得到准确和可重复性的结果，务必注意下列事项。
1. 所要进行鉴定的微生物必须是纯种，此系统不是为在混合菌群中鉴定单一菌种而设计的。
2. 在鉴定之前，选择合适的培养基和进行适量的传代培养是非常重要的。在接种之前，许多菌种会因为培养条件的不同而产生不同的代谢模式。
3. 在操作过程中必须使用无菌器材和进行无菌操作，杂菌的污染会干扰结果。
4. 大多数消耗品为一次使用，重复使用的如试管，移液器枪头必须把去污剂清洗干净。
5. 在将菌悬液接种到鉴定板之前，应把鉴定板拿出冰箱，让鉴定板恢复到常温。因为有些菌种（如Neisseria ）对温度的快速变化很敏感。
6. 仔细校正浊度计，接种菌悬液的浊度应在规定的范围内。
7. 鉴定板中包含多种对温度和光照敏感的物质，如果个别孔出现棕黑色，说明碳源已经被降解。有时候，在保质期内或超过保质期不长的时间里，个别孔会出现黄色或粉红色，这是正常的。 8. Biolog 是基于测试活菌的代谢特性。一些菌在很短的时间里会由于温度、pH 和渗透压的压力而丧失代谢活性。
所以为了获得良好的鉴定结果必须确保菌种为活菌，操作要小心。 9. 为了延长鉴定板的保质期限，应在2-8℃的条件下避光保存。
生态板（ECO ）
一 鉴定步骤
①土壤样品的采集，将土壤样品加入到灭菌水里接种。30 min后，用移液枪取1 mL污泥到1．5mL 离心管中。 ②在10 000 r／min 下离心20 min，弃去上清液，加1 mL生理盐水，在振荡器上振动5 min使之混匀；再于10 000 r ／min 下离心20 min，重复2次，除去其中的碳源；弃去上清液，加1 mL生理盐水，在振荡器上振动5 min使之混匀，于2 000 r／min 下离心1 min。
③ 取上清液倒人装有20 mL已灭菌生理盐水(NaC1，0．85％) 的试管中，并使其OD 590维持在0．13±0．02。 ④ 将上述稀释液加入Biolog ECO微平板中，(150 L／孔) ，然后在20℃下培养，每隔12 h用Biolog 细菌自动读数仪读取数据，连续测定10 d。
二 数据处理方法（采用SAS 统计软件进行多样性指数差异显著分析和主成分分析）
1采用Biolog 微平板培养120h 的数据进行数据统计，○采用Shannon 指数、Shannon 均匀度、Simpson 指数、Mclniosh 指数和Mclniosh 均匀度各种多样性指数来反映细菌群落代谢功能的多样性。
2Biolog ECO 平板反应一般采用每孔颜色平均变化率(AWCD)来描述。○计算公式为：{AWCD=[Σ(Ci—R)]／31}。其中，Ci 是除对照孔外各孔吸光度值，R 是对照孔吸光度值。
3通过主成分分析(PCA)将Biolog 生态板(ECO) 平板的31种碳源的测定结果形成的描述细菌群落代谢特征的多○
元向量变换为互不相关的主元向量（PC1和PC2是主元向量的分量），在降维后的主元向量空间中可以用点的位置直观地反映出不同细菌群落的代谢特征。
免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。它以酶作为标记物，与抗体或抗原联结，与相应的抗原或抗体作用后，通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量，亦可用于组织
中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术。
目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA ），它是使抗原或抗体吸附于固相载体，使随后进行的抗原抗体反应均在载体表面进行，从而简化了分离步骤，提高了灵敏度，即可检测抗原，也可检测抗体。实验方法包括间接法、夹心法及竞争法。
为了检测抗原可用夹心法。将特异性抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯制成的小管、小盘或小孔）上，然后加被测溶液，倘样品中有相应抗原，则与抗体在载体表面形成复合物。洗涤后加入酶标记的特异性抗体，后者通过抗原也结合到载体的表面。洗去过剩的标记抗体，加入酶的底物，在一定时间内经酶催化产生的有色产物的量与溶液中抗原含量成正比，可用肉眼观察或分光光度计测定。
为了检测抗体可用间接法。使抗原吸附于载体上，然后加入被测血清，如有抗体，则与抗原在载体上形成复合物。洗涤后加酶标记的抗球蛋白（抗抗体）与之反应。洗涤后加底物显色，有色产物的量与抗体的量成正比。
常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP ）和碱性磷酸酶（AP ），相应的底物分别是邻苯二胺（OPD ）和对硝基苯磷酸盐，前者呈色反应为棕黄色，后者为蓝色。可用目测定性，也可用酶标仪测定光密度（OD ）值以反映抗原含量。
即:酶联免疫吸附剂测定原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的
比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。