DEAE-Dextran细胞转染试剂盒
简介:
外源基因导入真核细胞的方法有很多种,如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖(Dextran)
转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。DEAE-葡聚糖转染法的原理是带正电荷的DEAE-葡聚糖与带负电的核酸的磷酸骨架相互作用,形成复合物,该复合物通过细胞内吞噬作用使DNA转导进入细胞核。Leagene DEAE-Dextran细胞转染试剂盒(DEAE-Dextran Cell Transfection Kit)适用于瞬时转染(transient tranfection),不宜用于筛选稳定表达细胞株,这是因为DEAE-dextran在较高浓度作用较长时间会对细胞产生一定毒性。
组成:
操作步骤(仅供参考):
(一)常规转染:
1、 在转染前24h用胰蛋白酶消化培养细胞,取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中,
待细胞密度大50~70%满时即可进行转染。后续操作步骤均按6孔板计算,如果转染器皿不同,请按比例自行调节用量。
2、 弃培养液,用PBS清洗细胞2次,再用TBS-D buffer清洗1次,吸尽残液。 3、 配制转染液: 对于6孔板,按照下表依次加入DEAE-Dextran, DNA以及适量的
TBS-D,使其总体积为170μl,即为DEAE-Dextran-DNA-TBS-D转染液,用移液器
备注:对于六孔板中一个孔的细胞,DNA可以在1~3μg的范围内进行适当调节。最佳的转染条件,
因具体的细胞和培养条件而定,可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。对于其它培养板或培养器皿,试剂的用量可大致按照细胞培养面积按比例换算。
4、 转染:把170μl转染液滴加到细胞表面,轻轻晃动6孔板,使其与细胞表面充分接触
37℃孵育,观察细胞至皱缩变圆为止。
5、 参考上表,每孔缓慢加入1.7ml细胞培养液(约DEAE-Dextran-DNA-TBS-D转染液体
积的10倍)。
6、 可选步骤:参考上表,每孔加入Chloroquine solution,亦可和上一步骤中1.7ml细
胞培养液预先混合后一起加入。
7、 培养不超过2h或在出现明显的细胞毒性前,更换新鲜培养液继续培养,通常转染后
48~72小时可以检测转染效果。 (二)预处理转染:
1、 在转染前24h用胰蛋白酶消化培养细胞,取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中,
待细胞密度大50~70%满时即可进行转染。后续操作步骤均按6孔板计算,如果转染器皿不同,请按比例自行调节用量。
2、 弃培养液,用PBS清洗细胞2次,再用TBS-D buffer清洗1次,吸尽残液。 3、 配制转染液: 对于6孔板,按照下表依次加入DEAE-DextranPBS,使其总体积为1ml,
即为DEAE-Dextran工作液。
4、 预转染:对于6孔板,把1ml转染液滴加到细胞表面,轻轻晃动6孔板,使其与细胞
表面充分接触,37℃孵育10min。
5、 洗涤:弃液,用TBS-D buffer轻轻清洗1次,PBS轻轻清洗1次,注意防止细胞脱落。 6、 弃洗涤液,参考下表,每孔缓慢均匀加入162μDNA工作液。
7、 37℃孵育30min,参考下表,每孔缓慢加入1.7ml细胞培养液(约DNA工作液体积的
10倍)。
备注:对于六孔板中一个孔的细胞,DNA可以在1~3μg的范围内进行适当调节。最佳的转染条件,因具体的细胞和培养条件而定,可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。对于其它培养板或培养器皿,试
剂的用量可大致按照细胞培养面积按比例换算。
8、 可选步骤:参考上表,每孔加入17μl Chloroquine solution,亦可和上一步骤中1.7ml
细胞培养液预先混合后一起加入。
9、 培养不超过4h或在出现明显的细胞毒性前,更换新鲜培养液继续培养,通常转染后
48~72小时可以检测转染效果。
注意事项:
1、 注意无菌操作,尽量避免污染,同时DNA不应含有蛋白和酚。
2、 休克处理某些细胞系会使转染效率大大提高,但应注意甘油暴露过久易导致细胞死亡。 3、 转染12~24h后,可以加入终浓度为10mmol/L的丁酸钠溶液,可以提高病毒滴度。 4、 如果转染效率低下,有可能是过多细胞死亡所致,应考虑减少DEAE-Dextran的用量或作用时间,或者减少氯喹作用时间。 5、 支原体污染细胞,易导致转染不稳定。
DEAE-Dextran细胞转染试剂盒
简介:
外源基因导入真核细胞的方法有很多种,如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖(Dextran)
转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。DEAE-葡聚糖转染法的原理是带正电荷的DEAE-葡聚糖与带负电的核酸的磷酸骨架相互作用,形成复合物,该复合物通过细胞内吞噬作用使DNA转导进入细胞核。Leagene DEAE-Dextran细胞转染试剂盒(DEAE-Dextran Cell Transfection Kit)适用于瞬时转染(transient tranfection),不宜用于筛选稳定表达细胞株,这是因为DEAE-dextran在较高浓度作用较长时间会对细胞产生一定毒性。
组成:
操作步骤(仅供参考):
(一)常规转染:
1、 在转染前24h用胰蛋白酶消化培养细胞,取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中,
待细胞密度大50~70%满时即可进行转染。后续操作步骤均按6孔板计算,如果转染器皿不同,请按比例自行调节用量。
2、 弃培养液,用PBS清洗细胞2次,再用TBS-D buffer清洗1次,吸尽残液。 3、 配制转染液: 对于6孔板,按照下表依次加入DEAE-Dextran, DNA以及适量的
TBS-D,使其总体积为170μl,即为DEAE-Dextran-DNA-TBS-D转染液,用移液器
备注:对于六孔板中一个孔的细胞,DNA可以在1~3μg的范围内进行适当调节。最佳的转染条件,
因具体的细胞和培养条件而定,可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。对于其它培养板或培养器皿,试剂的用量可大致按照细胞培养面积按比例换算。
4、 转染:把170μl转染液滴加到细胞表面,轻轻晃动6孔板,使其与细胞表面充分接触
37℃孵育,观察细胞至皱缩变圆为止。
5、 参考上表,每孔缓慢加入1.7ml细胞培养液(约DEAE-Dextran-DNA-TBS-D转染液体
积的10倍)。
6、 可选步骤:参考上表,每孔加入Chloroquine solution,亦可和上一步骤中1.7ml细
胞培养液预先混合后一起加入。
7、 培养不超过2h或在出现明显的细胞毒性前,更换新鲜培养液继续培养,通常转染后
48~72小时可以检测转染效果。 (二)预处理转染:
1、 在转染前24h用胰蛋白酶消化培养细胞,取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中,
待细胞密度大50~70%满时即可进行转染。后续操作步骤均按6孔板计算,如果转染器皿不同,请按比例自行调节用量。
2、 弃培养液,用PBS清洗细胞2次,再用TBS-D buffer清洗1次,吸尽残液。 3、 配制转染液: 对于6孔板,按照下表依次加入DEAE-DextranPBS,使其总体积为1ml,
即为DEAE-Dextran工作液。
4、 预转染:对于6孔板,把1ml转染液滴加到细胞表面,轻轻晃动6孔板,使其与细胞
表面充分接触,37℃孵育10min。
5、 洗涤:弃液,用TBS-D buffer轻轻清洗1次,PBS轻轻清洗1次,注意防止细胞脱落。 6、 弃洗涤液,参考下表,每孔缓慢均匀加入162μDNA工作液。
7、 37℃孵育30min,参考下表,每孔缓慢加入1.7ml细胞培养液(约DNA工作液体积的
10倍)。
备注:对于六孔板中一个孔的细胞,DNA可以在1~3μg的范围内进行适当调节。最佳的转染条件,因具体的细胞和培养条件而定,可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。对于其它培养板或培养器皿,试
剂的用量可大致按照细胞培养面积按比例换算。
8、 可选步骤:参考上表,每孔加入17μl Chloroquine solution,亦可和上一步骤中1.7ml
细胞培养液预先混合后一起加入。
9、 培养不超过4h或在出现明显的细胞毒性前,更换新鲜培养液继续培养,通常转染后
48~72小时可以检测转染效果。
注意事项:
1、 注意无菌操作,尽量避免污染,同时DNA不应含有蛋白和酚。
2、 休克处理某些细胞系会使转染效率大大提高,但应注意甘油暴露过久易导致细胞死亡。 3、 转染12~24h后,可以加入终浓度为10mmol/L的丁酸钠溶液,可以提高病毒滴度。 4、 如果转染效率低下,有可能是过多细胞死亡所致,应考虑减少DEAE-Dextran的用量或作用时间,或者减少氯喹作用时间。 5、 支原体污染细胞,易导致转染不稳定。