1. 目的
检验蜂蜜中的菌落总数。 2. 适用范围
本标准适用于对蜂蜜中菌落总数的检验。 3设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：36℃士1℃，30~Cil℃。 3.2冰箱：2℃～5℃。 3.3恒温水浴箱：46℃士l ℃。 3.4天平：感量为0．1 g。 3.5均质器。 3.6振荡器。
3.7无菌吸管：1 mL(具0．01 mL刻度) 、10 mL(具0．1 mL刻度) 或微量移液器及吸头。 3. 8无菌锥形瓶：容量250mL 、500mL 。 3.9无菌培养皿：直径90 mm。
3.10 pH计或pH 比色管或精密pH 试纸。 3.1 1 放大镜或／和菌落计数器。 4培养基和试剂
4．1平板计数琼脂培养基：见附录A 中A ．1。 4．2磷酸盐缓冲液：见附录A 中A-2。 4．3无菌生理盐水：见附录A 中A ．3。 5操作步骤 5．1样品的稀释
5.1.1蜂蜜样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 (瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠) 中，充分混匀，制成l ：10的样品匀液。
5.1.2用l mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的 无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面) ，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混 合均匀，制成1：100的样品匀液。
5.1.3按5.1.2操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1 mL无菌吸管 或吸头。
5.1.4．根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液) ， 在进行lO 倍递增稀释时，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸
取1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
5.1.5及时将15 mL～20 mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基(可放置于46℃士1℃恒温水浴箱中 保温) 倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 5.2培养
5．2．1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36~Cil℃培养48 hi2 h。水产品30℃土1℃培养72 h土3 h。 5．2．2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层
琼脂培养基(约4 mL)，凝固后翻转平板，按6．2．1条件进行培养。 5．3菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落
形成单位(colony-forming units，CFU) 表示。
5．3．1 选取菌落数在30 CFU～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的 均数。
5．3．2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
5．3．3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 6结果与报告
6．1 菌落总数的计算方法
6．1．1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平
均值乘以相应稀释倍数，作为每g(mL)样品中菌落总数结果。
6．1．2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式(1)计算： „„„„„„„„(1) 式中：
N ——样品中菌落数；
∑C ——平板(含适宜范围菌落数的平板) 菌落数之和； ；71——第一稀释度(低稀释倍数) 平板个数； ／72——第二稀释度(高稀释倍数) 平板个数； d ——稀释因子(第一稀释度) 。
6．1．3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可
记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算：
6．1．4若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计 算。
6．1．5若所有稀释度(包括液体样品原液) 平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。 6．1．6若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU或大于300
CFU 时，则以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 6．2菌落总数的报告
6．2．1 菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
6．2．2菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后
面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。 6．2．3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 6. 2．4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
6．2．5称重取样以CFU ／g 为单位报告，体积取样以CFU ／mL 为单位报告。
1. 目的
检验蜂蜜中的菌落总数。 2. 适用范围
本标准适用于对蜂蜜中菌落总数的检验。 3设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：36℃士1℃，30~Cil℃。 3.2冰箱：2℃～5℃。 3.3恒温水浴箱：46℃士l ℃。 3.4天平：感量为0．1 g。 3.5均质器。 3.6振荡器。
3.7无菌吸管：1 mL(具0．01 mL刻度) 、10 mL(具0．1 mL刻度) 或微量移液器及吸头。 3. 8无菌锥形瓶：容量250mL 、500mL 。 3.9无菌培养皿：直径90 mm。
3.10 pH计或pH 比色管或精密pH 试纸。 3.1 1 放大镜或／和菌落计数器。 4培养基和试剂
4．1平板计数琼脂培养基：见附录A 中A ．1。 4．2磷酸盐缓冲液：见附录A 中A-2。 4．3无菌生理盐水：见附录A 中A ．3。 5操作步骤 5．1样品的稀释
5.1.1蜂蜜样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 (瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠) 中，充分混匀，制成l ：10的样品匀液。
5.1.2用l mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的 无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面) ，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混 合均匀，制成1：100的样品匀液。
5.1.3按5.1.2操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1 mL无菌吸管 或吸头。
5.1.4．根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液) ， 在进行lO 倍递增稀释时，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸
取1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
5.1.5及时将15 mL～20 mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基(可放置于46℃士1℃恒温水浴箱中 保温) 倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 5.2培养
5．2．1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36~Cil℃培养48 hi2 h。水产品30℃土1℃培养72 h土3 h。 5．2．2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层
琼脂培养基(约4 mL)，凝固后翻转平板，按6．2．1条件进行培养。 5．3菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落
形成单位(colony-forming units，CFU) 表示。
5．3．1 选取菌落数在30 CFU～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的 均数。
5．3．2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
5．3．3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 6结果与报告
6．1 菌落总数的计算方法
6．1．1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平
均值乘以相应稀释倍数，作为每g(mL)样品中菌落总数结果。
6．1．2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式(1)计算： „„„„„„„„(1) 式中：
N ——样品中菌落数；
∑C ——平板(含适宜范围菌落数的平板) 菌落数之和； ；71——第一稀释度(低稀释倍数) 平板个数； ／72——第二稀释度(高稀释倍数) 平板个数； d ——稀释因子(第一稀释度) 。
6．1．3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可
记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算：
6．1．4若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计 算。
6．1．5若所有稀释度(包括液体样品原液) 平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。 6．1．6若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU或大于300
CFU 时，则以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 6．2菌落总数的报告
6．2．1 菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
6．2．2菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后
面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。 6．2．3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 6. 2．4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
6．2．5称重取样以CFU ／g 为单位报告，体积取样以CFU ／mL 为单位报告。