实验一 细菌的生理生化试验
一、实验目的：
1、了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理；
2、掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法。
二、实验原理：
各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异就表现的更加明显。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。
三、实验条件：
菌种
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种
培养基
葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）。
试剂
40％NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。
器具
超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。
四、实验步骤：
(一) 糖类发酵试验
1、目的：了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法。
2、原理：可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。
3、材料：
菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的斜面菌种
培养基：葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管
4、流程：
发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录
5、步骤：
5.1 试管标记：取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。
5.2 接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置放入试管中，置37℃恒温箱中培养，分别在培养24h、48h、和72h观察结果。
5.3 观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。
（二） 乙酰甲基甲醇试验(V．P试验)
1、目的：了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法。
2、原理：某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V．P（+）反应。
3、材料：
3.1 菌种: 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌
（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种
3.2 培养基: 葡萄糖蛋白胨培养液的试管
4、流程
培养液试管→标记→接种→培养→观察→记录
5、步骤
5.1 标记试管：取5支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。
5.2 接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24～48h。
5.3 观察记录：取出以上试管，振荡2min。另取5支空试管相应标记菌名，分别加入3～5ml以上对应管中的培养液，再加入40％NaOH溶液10～20滴，并用牙签挑入约0.5～1mg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min后，若培养液呈红色，记录为V．P试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V．P试验阴性反应（用“－”表示） 注意：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。
（三） 甲基红试验（M.R.试验）
1、目的：了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲基红试验原理，并掌握其操作方法
2、原理：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
3、材料
3.1 菌种： 同V．P试验
3.2 培养基：同V．P试验
4、流程
培养液→指示剂→观察→记录结果
5、步骤
于V.P.试验留下的培养液中，各加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示。
（四） 吲哚试验
1、目的：掌握吲哚试验(Ehrlich法)的原理和方法
2、原理：有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。
3、材料
3.1 菌种：测试菌株．
3.2培养基：蛋白胨水培养基
3.3试剂：二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。
4、流程
标记试管→接种→培养→观察→记录
5、步骤
5.1 试管标记：取装有蛋白胨水培养液的试管5支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。
5.2 接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，第5管作空白对照不接种，置37℃恒温箱中培养24～48h。
5.3 观察记录：在培养液中加入乙醚1～2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“＋”、阴性用“－”表示。
五、 结果：
记录生理生化反应测定的结果。
六、 思考题：
1、以上生理生化反应能用于鉴别细菌，其原理是什么？
2、细菌生理生化反应试验中为什么要设对照？
实验一 细菌的生理生化试验
一、实验目的：
1、了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理；
2、掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法。
二、实验原理：
各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异就表现的更加明显。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。
三、实验条件：
菌种
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种
培养基
葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）。
试剂
40％NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。
器具
超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。
四、实验步骤：
(一) 糖类发酵试验
1、目的：了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法。
2、原理：可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。
3、材料：
菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的斜面菌种
培养基：葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管
4、流程：
发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录
5、步骤：
5.1 试管标记：取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。
5.2 接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置放入试管中，置37℃恒温箱中培养，分别在培养24h、48h、和72h观察结果。
5.3 观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。
（二） 乙酰甲基甲醇试验(V．P试验)
1、目的：了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法。
2、原理：某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V．P（+）反应。
3、材料：
3.1 菌种: 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌
（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种
3.2 培养基: 葡萄糖蛋白胨培养液的试管
4、流程
培养液试管→标记→接种→培养→观察→记录
5、步骤
5.1 标记试管：取5支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。
5.2 接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24～48h。
5.3 观察记录：取出以上试管，振荡2min。另取5支空试管相应标记菌名，分别加入3～5ml以上对应管中的培养液，再加入40％NaOH溶液10～20滴，并用牙签挑入约0.5～1mg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min后，若培养液呈红色，记录为V．P试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V．P试验阴性反应（用“－”表示） 注意：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。
（三） 甲基红试验（M.R.试验）
1、目的：了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲基红试验原理，并掌握其操作方法
2、原理：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
3、材料
3.1 菌种： 同V．P试验
3.2 培养基：同V．P试验
4、流程
培养液→指示剂→观察→记录结果
5、步骤
于V.P.试验留下的培养液中，各加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示。
（四） 吲哚试验
1、目的：掌握吲哚试验(Ehrlich法)的原理和方法
2、原理：有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。
3、材料
3.1 菌种：测试菌株．
3.2培养基：蛋白胨水培养基
3.3试剂：二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。
4、流程
标记试管→接种→培养→观察→记录
5、步骤
5.1 试管标记：取装有蛋白胨水培养液的试管5支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。
5.2 接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，第5管作空白对照不接种，置37℃恒温箱中培养24～48h。
5.3 观察记录：在培养液中加入乙醚1～2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“＋”、阴性用“－”表示。
五、 结果：
记录生理生化反应测定的结果。
六、 思考题：
1、以上生理生化反应能用于鉴别细菌，其原理是什么？
2、细菌生理生化反应试验中为什么要设对照？