第27卷第4期
食品与生物技术学报Vol.27 No.4 2008年7月Jul. 2008JournalofFoodScienceandBiotechnology
文章编号:167321689(2008)0420107205
谷氨酸脱羧酶发酵工艺的优化
杨帆, 李江华3, 徐岩, 房峻
(江南大学生物工程学院,江苏无锡214122)
摘 要:用大肠杆菌AS11505进行液态发酵生产谷氨酸脱羧酶并优化培养基,考察了碳源、氮源、
复合营养物质、起始pH及发酵时间对酶活的影响,确定最佳产酶培养基组成为:葡萄糖110g/dL,蛋白胨310g/dL,氯化钠013g/dL,磷酸氢二钾011g/dL,硫酸镁0102g/dL,L2谷氨酸0101g/dL,玉米浆115g/dL,生物素30μg/L,麸皮4g/dL;pH615。在此基础上,设计发酵条件的优化实验。实验结果表明为:250mL的三角瓶装液量25mL,37℃,起始pH615,培养18h达到产酶高峰,产酶活力可达1290U/mL。关键词:谷氨酸脱羧酶;优化;发酵中图分类号:Q93文献标识码:A
OptimizingofGFan, LIJiang2Hua3, XUYan, FANGJun
(SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)
Abstract:CompositionsofculturemediumandfermentationconditionswerestudiedtoimprovequantityofGlutamicaciddecarboxylase(GAD)productionbyAS11505liquidfermentation.Theoptimizedmediumandconditionswereasfollows:glucose110%,tryptone310%,NaCl013%,K2HPO43H2O011%,MgSO47H2O0102%,L2Glutamicacid0101%,cornsteepliquor115%,biotin20μg/L,bran4%,initialpH615,37℃,liquidvolume25mL/250mLbaffledflask,200r/min,for18hours.Undertheseconditions,theactivityofGADwasachievedat1290U/mL.Keywords:Glutamicaciddecarboxylase(GAD);Optimization;Fermentation
谷氨酸脱羧酶(GAD,EC41111115)是一种催
化L2谷氨酸脱掉一个羧基形成γ2氨基丁酸(GA2BA)的酶[1-2]。GAD广泛分布于从单细胞有机体到哺乳动物等生物中,在哺乳动物神经系统中起作用已为人们所了解,其机理研究仍在不断进展。
收稿日期:2007209221.
GAD在生物体中的其它可能作用目前也是科学家
的关注点[3],富含GABA的食品开发也受到重
视[4]。GAD则是生物技术富集生产GABA的关键酶。另外,GAD还有望作为诊断酶用于甄别和预测糖尿病,以及作为极具潜力的诊疗型酶制剂
。了解
基金项目:长江学者和创新团队发展计划资助项目(IRT0532).
作者简介:杨帆(19832),男,江苏无锡人,生物化工硕士研究生.
3通讯作者:李江华(19662),男,江西九江人,工学硕士,副教授,主要从事生物化工与发酵工程研究.Email:li2
108食 品 与 生 物 技 术 学
报 第27卷
塞试管中,加入1mL质量分数6%的苯酚和014
mL次氯酸钠(活性氯质量分数≥512%),充分混匀,沸水浴10min后冰水浴20min,再加入311mL蒸馏水,然后在630nm处测D值[8];制作γ2氨基丁酸含量与吸光度关系的标准曲线,根据标准曲线和所测D值,计算出酶活。酶活力单位定义:在反应液中,每分钟催化底物生成1μmolγ2氨基丁酸所需的酶量为1个活力单位(U)。
它的分布和特性对于它的应用具有指导意义[5]。
在微生物中,曲霉、酵母、乳酸菌、大肠杆菌、变形杆菌属(Proteusvulgaris,P.morganii),以及梭状芽胞杆菌属等都存在谷氨酸脱羧酶。大肠杆菌具有较高的谷氨酸脱羧酶活力,其中的谷氨酸脱羧酶相对分子质量为30万,具有2个分子的磷酸吡哆醛(PLP)。本质上反应是非可逆的,仅对L2谷氨酸有特异性,可被羟胺、氨基脲等(醛试剂)抑制[6]。至今为止,细菌GAD中研究最多最深入的就是E1coilGAD,获取比较方便,是所考查的GAD中最有代表性的酶。GAD可被培养基中的谷氨酸诱导生成,产量可达10ml/L,纯酶由6个相同的53000Da亚基组成,每个亚基有一分子磷酸吡哆醛共价结
2 结果与讨论
211 大肠杆菌生长曲线和产酶曲线
合到赖氨酸残基,酶在低温、低蛋白质浓度、高于
pH610时易发生离解,最适底物是L2谷氨酸,pH410～415之间酶活最高[7]。
作者通过对谷氨酸脱羧酶液态发酵培养基及发酵条件进行优化,使得大肠杆菌在摇瓶水平产出具有较高酶活力的谷氨酸脱羧酶。
对大肠杆菌进行摇瓶振荡培养,测定GAD酶活力和菌体湿重培养随时间的变化情况。结果如图1所示。由图1可以看出,大肠杆菌在0～4h为延滞期,4～16h为该菌对数生长期,生长到16h时菌体生长达到最高,而GAD酶活力在20h左右时最高,随着时间的延长,GAD,生,,胞质GAD酶部分
为培养最适宜时间。
1 材料与方法
111 材料
11111 505,购自中科院微
生物研究所。11112 培养基
1)斜面培养基:营养琼脂415g/dL,pH自然。2)发酵培养基:葡萄糖110g/dL,蛋白胨310g/dL,氯化钠013g/dL,磷酸氢二钾011g/dL,硫
酸镁0102g/dL,L2谷氨酸0101g/dL,玉米浆115g/dL,生物素20μg/L;pH615。112 培养方法
图1 大肠杆菌生长曲线和产酶曲线
Fig.1 EffectofculturetimeongrowthofE1coliand
GAD’sproduction
配制发酵培养基,分装25mL培养基于250mL的三角瓶中,121℃灭菌15min;将在斜面培养基中培养好的菌种接种到发酵培养液中,37℃恒温振荡,培养18h(200r/min)。113 分析方法
11311 生物量测定 将干燥的离心管称重并记
212 不同碳源对产酶的影响
碳是微生物的基本营养元素,是细胞内储藏物
和各种代谢产物(包括酶)的骨架,也是微生物生长的主要能量来源。不同的微生物种类能够利用的碳水化合物的差别很大。添加1g/dL的可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖作为碳源;培养基中其它组分为:蛋白胨310g/dL,氯化钠013g/dL,磷酸氢二钾011g/dL,硫酸镁0102g/dL,L2谷氨酸0101g/dL,玉米浆115g/dL,生物素20μg/L;pH615。发酵培养18h测酶活,结果如图2所示。 从图2可以看出,不同碳源对产酶影响很大,以葡萄糖为碳源产酶最高,发酵18h达产酶高峰1119U/mL,所以选择用葡萄糖作为培养基的碳源。
录,取10mL发酵液,4000r/min离心10min,去上清液,称重并记录,计算湿菌体重。11312 酶活测定 取015mL发酵液,4000r/min离心10min,去上清液,加012mol/L的谷氨酸溶液(pH416)10mL,37℃恒温水浴振荡10min(200r/min),立即沸水浴10min终止反应,4000r/min离心10min,收集上清液;量取1mL上清液于三角瓶中,加入39mL蒸馏水,混匀,吸取110mL于带
第4期杨
帆等:谷氨酸脱羧酶发酵工艺的优化109
达产酶高峰1050U/mL,所以选择用蛋白胨作为
培养基的氮源
。
图2 碳源对酶活的影响
Fig.2 Effectofdifferentcarbonsourcesontheenzyme
production
图4 氮源对酶活的影响
Fig.4 Effectofdifferentnitrogensourcesontheenzyme
production
213 葡萄糖质量浓度对酶活的影响
不同葡萄糖质量浓度对产酶的影响如图3所
示。在培养基中加入不同质量浓度的葡萄糖,分别为012g/dL、016g/dL、110g/dL、114g/dL、118g/dL,其它组分不变。由图3可知,当培养基中葡萄
215 蛋白胨质量浓度对酶活的影响
糖质量浓度为110g/dL时,谷氨酸脱羧酶活力最高,发酵18h达产酶高峰1119U/mL,所以选择110g/dL作为葡萄糖的添加量
。
配制蛋白胨不同质量浓度的培养基,分别为110g/dL、210g/dL、310g/dL、410g/dL、510g/dL,考察不同蛋白胨质量浓度对产酶的影响。其它组分为葡萄糖110g/dL、氯化钠3g/dL、磷酸氢11g/、L2谷氨酸010115g/L;pH615。
5。
图3 葡萄糖质量浓度对酶活的影响
Fig.3 Effectoftheconcentrationofglucoseontheen2
zymeproduction
图5 蛋白胨质量浓度对酶活的影响
Fig.5 Effectoftheconcentrationoftryptoneontheen2
zymeproduction
214 不同氮源对产酶的影响
发酵培养基的氮源可以用有机氮源、无机氮源或者两者混合使用。实验中各选取2g/dL硝酸钠、尿素、硫酸铵、酵母膏、蛋白胨为氮源,其它组分为:葡萄糖110g/dL,氯化钠013g/dL,磷酸氢二钾011g/dL,硫酸镁0102g/dL,L2谷氨酸0101g/dL,
由图5可知,蛋白胨质量浓度在2～4g/dL之间时,酶活相差不大。考虑到经济因素,确定培养
基中蛋白胨质量浓度为3g/dL。216 生物素质量浓度对酶活的影响
大肠杆菌虽然能合成自身生长所需的全部生长因子,在只含有碳素、氮素、矿质元素和微量元素的培养基上也能生长,但通过添加额外的生长因子往往能促进其生长。在培养基中添加不同量的生物素,分别为10、20、30、40、50、60μg/L,并以空白为对照,考察不同生物素质量浓度对产酶的影响,培养基其它组分为蛋白胨310g/dL、葡萄糖1g/dL、氯化钠013g/dL、磷酸氢二钾011g/dL、硫酸
玉米浆115g/dL,生物素20μg/L;pH615。考察不同氮源对产酶的影响,结果如图4所示。由图4可知,无机氮源不利于大肠杆菌产酶,有机氮源则能较好地促进大肠杆菌分泌谷氨酸脱羧酶,其中蛋白胨的效果又优于酵母膏。一方面可能因为无机盐对培养基pH的影响导致对产酶的抑制。一方面可能因为有机氮源中含有微生物正常生长繁殖的所必需的各种生长素,而这些生长素大多是辅酶或辅基的组分。以蛋白胨为氮源产酶最高,发酵18h
镁0102g/dL、L2谷氨酸0101g/dL、玉米浆115g/dL;pH615。结果如图6所示。
110食 品 与 生 物 技 术 学 报 第27卷
活造成影响,然而磷酸吡哆醛价格很高,添加磷酸
吡哆醛使得生产成本提高。实验发现,添加廉价的麸皮对于谷氨酸脱羧酶的酶活提高有明显帮助。麸皮含有多种氨基酸和维生素,氨基酸是酶蛋白的基本结构单元,对于酶蛋白活力也有影响。实验中考察了麸皮添加量分别为1g/dL、2g/dL、4g/dL、6g/dL、8g/dL对于酶活的影响。以空白为对照,
图6 生物素质量浓度对酶活的影响
Fig.6 Effectoftheconcentrationofbiotinontheen2
zymeproduction
图6显示,额外添加一定量的生物素可以促进大
肠杆菌分泌谷氨酸脱羧酶,当添加量在30μg/L发酵18h达产酶高峰,但生物素质量浓度过高时也会抑制
其它组分为蛋白胨3g/dL、葡萄糖1g/dL、氯化钠013g/dL、磷酸氢二钾011g/dL、硫酸镁0102g/dL、L2谷氨酸0101g/dL;pH615。配制培养基进行发酵实验,测酶活,结果见图8
。
酶活。所以选择30μg/L作为生物素的添加量。217 玉米浆质量浓度对酶活的影响
玉米浆是发酵中的一个重要因素。玉米浆中含有丰富的生物素和其它氨基酸和维生素。在工业生产中通过添加玉米浆可达到添加生长因子的目的。在发酵培养基中加入不同量的玉米浆,分别为015g/dL、1g/dL、115g/dL、2g/15g/3g/dL,dL、葡萄糖g/、011g/dL、02g/、L2谷氨酸0101g/dL、
ofbranontheenzyme
production
生物素30μg/L;pH615。考察不同玉米浆质量浓度对产酶的影响,所得结果如图7所示
。
由图8可知,麸皮可以代替玉米浆和生物素起到添加生长因子的作用。当添加量为4g/dL时,谷氨酸脱羧酶活性最高。219 培养基初始pH的确定
环境的酸碱度对细菌的生命活动有很大的影响,不同的细菌有不同的最适pH。调节培养基不同的初始pH值,进行发酵实验,测酶活,结果见图9。由图9可知,培养基初始pH值为515～715时适宜大肠杆菌生长,过酸和过碱都不利于大肠杆菌的生长和提高谷氨酸脱羧酶的活力
。
图7 玉米浆质量浓度对酶活的影响
Fig.7 Effectoftheconcentrationofcornsteepliquor
ontheenzymeproduction
图7显示,添加玉米浆可以提高酶活,当玉米浆质量浓度为115g/dL时发酵18h达产酶高峰,所以选择115g/dL作为玉米浆的添加量。218 麸皮添加量对酶活的影响
图9 培养基初始pH对酶活的影响
Fig.9 EffectofinitialpHontheenzymeproduction
在发酵工业中,生产成本是必须考虑的一个问题。谷氨酸脱羧酶的辅酶是磷酸吡哆醛,据文献报道,磷酸吡哆醛的添加量对于谷氨酸脱羧酶的酶活有着明显的影响[9]。磷酸吡哆醛是谷氨酸脱羧酶的必需辅酶,它的添加势必会对谷氨酸脱羧酶的酶
2110 温度对酶活的影响
适宜的温度对控制酶催化反应是重要的。温
度的变化不仅影响酶的稳定性,改变酶对底物的亲和性而影响酶的活力,还可能影响副反应的发生及
第4期杨帆等:
谷氨酸脱羧酶发酵工艺的优化111
其反应速率。为了了解谷氨酸脱羧酶的最适催化温度,分别考察了在32、34、36、38、40℃时酶的相对活性,结果如图10所示
。
图11 培养基装液量对酶活的影响
Fig.11 Effectofliquidvolumeontheenzymeproduction
图10 温度对酶活的影响
Fig.1 Effectoftemperatureontheenzymeproduction
3 结 语
综上所述,实验中通过谷氨酸脱羧酶液态发酵
条件的优化,大肠杆菌AS11505产GAD的最佳培养基组成为:葡萄糖110g/dL,蛋白胨310g/dL,氯化钠013g/dL,磷酸氢二钾011g/dL,硫酸镁0102g/dL,L2谷氨酸0101g/dL,115g/dL,生物素30μg/,麸皮4g/dL;。培养条件为:℃,起始pH6,18。,酶活达12902111 装液量对酶活的影响
在250mL的三角瓶中,分别加入15、20、25、30、35mL的培养基,接种后培养18h,测定酶活力和生长量,结果如图11所示。 随着装液量的增加,菌株的生长量相应减少。装液量对菌株产酶的影响可以分成两部分。当装液量相对高时减少装液量对菌株产酶的影响相当明显;而当装液量相对低时,,
谷氨酸脱羧酶的酶活。
参考文献):
[1]ZhangGuijin,AlanWBown.Therapiddeterminationofγ2Aminobutyricacid[J].Phytochemistry,1997,44:1007-1009.
[2]ParkKi2Bum,JiGeun2Eog,ParkMyeong2Soo,etal.ExpressionofriceglutamatedecarboxylaseinBifidobacteriumlon2
gumenhancesγ2aminobutyricacidproduction[J].BiotechnologyLetters,2005,27:1681-1684.[3]TaylorJohannaC,RapportLisa,LockwoodGBrian.Octacosanolinhumanhealth[J].Nutrition,2003,19(2):192-195.[4]顾振新,蒋振晖.食品原料中γ2氨基丁酸(GABA)形成机理及富集技术[J].食品与发酵工业,2002,28(10):65-69.
GUZhen2xin,JIANGZhen2hui.Formationmechanismandaccumulationtechniqueofγ2Aminobutyricacidoffoodrawmaterials[J].FoodandFermentationIndustries,2002,28(10):65-69.(inChinese)[5]袁仕善,周智广.谷氨酸脱羧酶若干研究进展[J].生理科学进展,2003,32(2):77-80.
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[6]许建军,江波.谷氨酸脱羧酶研究进展[J].食品工业科技,2004,32(7):131-133.
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[7]许建军,江波,许时婴.Lactococcuslactis谷氨酸脱羧酶的分离纯化及部分性质[J].无锡轻工大学学报(食品与生物技术),2004,
23(3):79-84.
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spectrometricmethod[J].AminoAcidsandBioticResources,2006,28(2):78-81.(inChinese)
[9]NorikoKomatsuzakia,JunShima.Productionofg2aminobutyricacid(GABA)bylactobacillusparacaseiisolatedfromtra2
ditionalfermentedfoods[J].FoodMicrobiology,2005,22(1):497-504.
(责任编辑:秦和平,李春丽)
第27卷第4期
食品与生物技术学报Vol.27 No.4 2008年7月Jul. 2008JournalofFoodScienceandBiotechnology
文章编号:167321689(2008)0420107205
谷氨酸脱羧酶发酵工艺的优化
杨帆, 李江华3, 徐岩, 房峻
(江南大学生物工程学院,江苏无锡214122)
摘 要:用大肠杆菌AS11505进行液态发酵生产谷氨酸脱羧酶并优化培养基,考察了碳源、氮源、
复合营养物质、起始pH及发酵时间对酶活的影响,确定最佳产酶培养基组成为:葡萄糖110g/dL,蛋白胨310g/dL,氯化钠013g/dL,磷酸氢二钾011g/dL,硫酸镁0102g/dL,L2谷氨酸0101g/dL,玉米浆115g/dL,生物素30μg/L,麸皮4g/dL;pH615。在此基础上,设计发酵条件的优化实验。实验结果表明为:250mL的三角瓶装液量25mL,37℃,起始pH615,培养18h达到产酶高峰,产酶活力可达1290U/mL。关键词:谷氨酸脱羧酶;优化;发酵中图分类号:Q93文献标识码:A
OptimizingofGFan, LIJiang2Hua3, XUYan, FANGJun
(SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)
Abstract:CompositionsofculturemediumandfermentationconditionswerestudiedtoimprovequantityofGlutamicaciddecarboxylase(GAD)productionbyAS11505liquidfermentation.Theoptimizedmediumandconditionswereasfollows:glucose110%,tryptone310%,NaCl013%,K2HPO43H2O011%,MgSO47H2O0102%,L2Glutamicacid0101%,cornsteepliquor115%,biotin20μg/L,bran4%,initialpH615,37℃,liquidvolume25mL/250mLbaffledflask,200r/min,for18hours.Undertheseconditions,theactivityofGADwasachievedat1290U/mL.Keywords:Glutamicaciddecarboxylase(GAD);Optimization;Fermentation
谷氨酸脱羧酶(GAD,EC41111115)是一种催
化L2谷氨酸脱掉一个羧基形成γ2氨基丁酸(GA2BA)的酶[1-2]。GAD广泛分布于从单细胞有机体到哺乳动物等生物中,在哺乳动物神经系统中起作用已为人们所了解,其机理研究仍在不断进展。
收稿日期:2007209221.
GAD在生物体中的其它可能作用目前也是科学家
的关注点[3],富含GABA的食品开发也受到重
视[4]。GAD则是生物技术富集生产GABA的关键酶。另外,GAD还有望作为诊断酶用于甄别和预测糖尿病,以及作为极具潜力的诊疗型酶制剂
。了解
基金项目:长江学者和创新团队发展计划资助项目(IRT0532).
作者简介:杨帆(19832),男,江苏无锡人,生物化工硕士研究生.
3通讯作者:李江华(19662),男,江西九江人,工学硕士,副教授,主要从事生物化工与发酵工程研究.Email:li2
108食 品 与 生 物 技 术 学
报 第27卷
塞试管中,加入1mL质量分数6%的苯酚和014
mL次氯酸钠(活性氯质量分数≥512%),充分混匀,沸水浴10min后冰水浴20min,再加入311mL蒸馏水,然后在630nm处测D值[8];制作γ2氨基丁酸含量与吸光度关系的标准曲线,根据标准曲线和所测D值,计算出酶活。酶活力单位定义:在反应液中,每分钟催化底物生成1μmolγ2氨基丁酸所需的酶量为1个活力单位(U)。
它的分布和特性对于它的应用具有指导意义[5]。
在微生物中,曲霉、酵母、乳酸菌、大肠杆菌、变形杆菌属(Proteusvulgaris,P.morganii),以及梭状芽胞杆菌属等都存在谷氨酸脱羧酶。大肠杆菌具有较高的谷氨酸脱羧酶活力,其中的谷氨酸脱羧酶相对分子质量为30万,具有2个分子的磷酸吡哆醛(PLP)。本质上反应是非可逆的,仅对L2谷氨酸有特异性,可被羟胺、氨基脲等(醛试剂)抑制[6]。至今为止,细菌GAD中研究最多最深入的就是E1coilGAD,获取比较方便,是所考查的GAD中最有代表性的酶。GAD可被培养基中的谷氨酸诱导生成,产量可达10ml/L,纯酶由6个相同的53000Da亚基组成,每个亚基有一分子磷酸吡哆醛共价结
2 结果与讨论
211 大肠杆菌生长曲线和产酶曲线
合到赖氨酸残基,酶在低温、低蛋白质浓度、高于
pH610时易发生离解,最适底物是L2谷氨酸,pH410～415之间酶活最高[7]。
作者通过对谷氨酸脱羧酶液态发酵培养基及发酵条件进行优化,使得大肠杆菌在摇瓶水平产出具有较高酶活力的谷氨酸脱羧酶。
对大肠杆菌进行摇瓶振荡培养,测定GAD酶活力和菌体湿重培养随时间的变化情况。结果如图1所示。由图1可以看出,大肠杆菌在0～4h为延滞期,4～16h为该菌对数生长期,生长到16h时菌体生长达到最高,而GAD酶活力在20h左右时最高,随着时间的延长,GAD,生,,胞质GAD酶部分
为培养最适宜时间。
1 材料与方法
111 材料
11111 505,购自中科院微
生物研究所。11112 培养基
1)斜面培养基:营养琼脂415g/dL,pH自然。2)发酵培养基:葡萄糖110g/dL,蛋白胨310g/dL,氯化钠013g/dL,磷酸氢二钾011g/dL,硫
酸镁0102g/dL,L2谷氨酸0101g/dL,玉米浆115g/dL,生物素20μg/L;pH615。112 培养方法
图1 大肠杆菌生长曲线和产酶曲线
Fig.1 EffectofculturetimeongrowthofE1coliand
GAD’sproduction
配制发酵培养基,分装25mL培养基于250mL的三角瓶中,121℃灭菌15min;将在斜面培养基中培养好的菌种接种到发酵培养液中,37℃恒温振荡,培养18h(200r/min)。113 分析方法
11311 生物量测定 将干燥的离心管称重并记
212 不同碳源对产酶的影响
碳是微生物的基本营养元素,是细胞内储藏物
和各种代谢产物(包括酶)的骨架,也是微生物生长的主要能量来源。不同的微生物种类能够利用的碳水化合物的差别很大。添加1g/dL的可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖作为碳源;培养基中其它组分为:蛋白胨310g/dL,氯化钠013g/dL,磷酸氢二钾011g/dL,硫酸镁0102g/dL,L2谷氨酸0101g/dL,玉米浆115g/dL,生物素20μg/L;pH615。发酵培养18h测酶活,结果如图2所示。 从图2可以看出,不同碳源对产酶影响很大,以葡萄糖为碳源产酶最高,发酵18h达产酶高峰1119U/mL,所以选择用葡萄糖作为培养基的碳源。
录,取10mL发酵液,4000r/min离心10min,去上清液,称重并记录,计算湿菌体重。11312 酶活测定 取015mL发酵液,4000r/min离心10min,去上清液,加012mol/L的谷氨酸溶液(pH416)10mL,37℃恒温水浴振荡10min(200r/min),立即沸水浴10min终止反应,4000r/min离心10min,收集上清液;量取1mL上清液于三角瓶中,加入39mL蒸馏水,混匀,吸取110mL于带
第4期杨
帆等:谷氨酸脱羧酶发酵工艺的优化109
达产酶高峰1050U/mL,所以选择用蛋白胨作为
培养基的氮源
。
图2 碳源对酶活的影响
Fig.2 Effectofdifferentcarbonsourcesontheenzyme
production
图4 氮源对酶活的影响
Fig.4 Effectofdifferentnitrogensourcesontheenzyme
production
213 葡萄糖质量浓度对酶活的影响
不同葡萄糖质量浓度对产酶的影响如图3所
示。在培养基中加入不同质量浓度的葡萄糖,分别为012g/dL、016g/dL、110g/dL、114g/dL、118g/dL,其它组分不变。由图3可知,当培养基中葡萄
215 蛋白胨质量浓度对酶活的影响
糖质量浓度为110g/dL时,谷氨酸脱羧酶活力最高,发酵18h达产酶高峰1119U/mL,所以选择110g/dL作为葡萄糖的添加量
。
配制蛋白胨不同质量浓度的培养基,分别为110g/dL、210g/dL、310g/dL、410g/dL、510g/dL,考察不同蛋白胨质量浓度对产酶的影响。其它组分为葡萄糖110g/dL、氯化钠3g/dL、磷酸氢11g/、L2谷氨酸010115g/L;pH615。
5。
图3 葡萄糖质量浓度对酶活的影响
Fig.3 Effectoftheconcentrationofglucoseontheen2
zymeproduction
图5 蛋白胨质量浓度对酶活的影响
Fig.5 Effectoftheconcentrationoftryptoneontheen2
zymeproduction
214 不同氮源对产酶的影响
发酵培养基的氮源可以用有机氮源、无机氮源或者两者混合使用。实验中各选取2g/dL硝酸钠、尿素、硫酸铵、酵母膏、蛋白胨为氮源,其它组分为:葡萄糖110g/dL,氯化钠013g/dL,磷酸氢二钾011g/dL,硫酸镁0102g/dL,L2谷氨酸0101g/dL,
由图5可知,蛋白胨质量浓度在2～4g/dL之间时,酶活相差不大。考虑到经济因素,确定培养
基中蛋白胨质量浓度为3g/dL。216 生物素质量浓度对酶活的影响
大肠杆菌虽然能合成自身生长所需的全部生长因子,在只含有碳素、氮素、矿质元素和微量元素的培养基上也能生长,但通过添加额外的生长因子往往能促进其生长。在培养基中添加不同量的生物素,分别为10、20、30、40、50、60μg/L,并以空白为对照,考察不同生物素质量浓度对产酶的影响,培养基其它组分为蛋白胨310g/dL、葡萄糖1g/dL、氯化钠013g/dL、磷酸氢二钾011g/dL、硫酸
玉米浆115g/dL,生物素20μg/L;pH615。考察不同氮源对产酶的影响,结果如图4所示。由图4可知,无机氮源不利于大肠杆菌产酶,有机氮源则能较好地促进大肠杆菌分泌谷氨酸脱羧酶,其中蛋白胨的效果又优于酵母膏。一方面可能因为无机盐对培养基pH的影响导致对产酶的抑制。一方面可能因为有机氮源中含有微生物正常生长繁殖的所必需的各种生长素,而这些生长素大多是辅酶或辅基的组分。以蛋白胨为氮源产酶最高,发酵18h
镁0102g/dL、L2谷氨酸0101g/dL、玉米浆115g/dL;pH615。结果如图6所示。
110食 品 与 生 物 技 术 学 报 第27卷
活造成影响,然而磷酸吡哆醛价格很高,添加磷酸
吡哆醛使得生产成本提高。实验发现,添加廉价的麸皮对于谷氨酸脱羧酶的酶活提高有明显帮助。麸皮含有多种氨基酸和维生素,氨基酸是酶蛋白的基本结构单元,对于酶蛋白活力也有影响。实验中考察了麸皮添加量分别为1g/dL、2g/dL、4g/dL、6g/dL、8g/dL对于酶活的影响。以空白为对照,
图6 生物素质量浓度对酶活的影响
Fig.6 Effectoftheconcentrationofbiotinontheen2
zymeproduction
图6显示,额外添加一定量的生物素可以促进大
肠杆菌分泌谷氨酸脱羧酶,当添加量在30μg/L发酵18h达产酶高峰,但生物素质量浓度过高时也会抑制
其它组分为蛋白胨3g/dL、葡萄糖1g/dL、氯化钠013g/dL、磷酸氢二钾011g/dL、硫酸镁0102g/dL、L2谷氨酸0101g/dL;pH615。配制培养基进行发酵实验,测酶活,结果见图8
。
酶活。所以选择30μg/L作为生物素的添加量。217 玉米浆质量浓度对酶活的影响
玉米浆是发酵中的一个重要因素。玉米浆中含有丰富的生物素和其它氨基酸和维生素。在工业生产中通过添加玉米浆可达到添加生长因子的目的。在发酵培养基中加入不同量的玉米浆,分别为015g/dL、1g/dL、115g/dL、2g/15g/3g/dL,dL、葡萄糖g/、011g/dL、02g/、L2谷氨酸0101g/dL、
ofbranontheenzyme
production
生物素30μg/L;pH615。考察不同玉米浆质量浓度对产酶的影响,所得结果如图7所示
。
由图8可知,麸皮可以代替玉米浆和生物素起到添加生长因子的作用。当添加量为4g/dL时,谷氨酸脱羧酶活性最高。219 培养基初始pH的确定
环境的酸碱度对细菌的生命活动有很大的影响,不同的细菌有不同的最适pH。调节培养基不同的初始pH值,进行发酵实验,测酶活,结果见图9。由图9可知,培养基初始pH值为515～715时适宜大肠杆菌生长,过酸和过碱都不利于大肠杆菌的生长和提高谷氨酸脱羧酶的活力
。
图7 玉米浆质量浓度对酶活的影响
Fig.7 Effectoftheconcentrationofcornsteepliquor
ontheenzymeproduction
图7显示,添加玉米浆可以提高酶活,当玉米浆质量浓度为115g/dL时发酵18h达产酶高峰,所以选择115g/dL作为玉米浆的添加量。218 麸皮添加量对酶活的影响
图9 培养基初始pH对酶活的影响
Fig.9 EffectofinitialpHontheenzymeproduction
在发酵工业中,生产成本是必须考虑的一个问题。谷氨酸脱羧酶的辅酶是磷酸吡哆醛,据文献报道,磷酸吡哆醛的添加量对于谷氨酸脱羧酶的酶活有着明显的影响[9]。磷酸吡哆醛是谷氨酸脱羧酶的必需辅酶,它的添加势必会对谷氨酸脱羧酶的酶
2110 温度对酶活的影响
适宜的温度对控制酶催化反应是重要的。温
度的变化不仅影响酶的稳定性,改变酶对底物的亲和性而影响酶的活力,还可能影响副反应的发生及
第4期杨帆等:
谷氨酸脱羧酶发酵工艺的优化111
其反应速率。为了了解谷氨酸脱羧酶的最适催化温度,分别考察了在32、34、36、38、40℃时酶的相对活性,结果如图10所示
。
图11 培养基装液量对酶活的影响
Fig.11 Effectofliquidvolumeontheenzymeproduction
图10 温度对酶活的影响
Fig.1 Effectoftemperatureontheenzymeproduction
3 结 语
综上所述,实验中通过谷氨酸脱羧酶液态发酵
条件的优化,大肠杆菌AS11505产GAD的最佳培养基组成为:葡萄糖110g/dL,蛋白胨310g/dL,氯化钠013g/dL,磷酸氢二钾011g/dL,硫酸镁0102g/dL,L2谷氨酸0101g/dL,115g/dL,生物素30μg/,麸皮4g/dL;。培养条件为:℃,起始pH6,18。,酶活达12902111 装液量对酶活的影响
在250mL的三角瓶中,分别加入15、20、25、30、35mL的培养基,接种后培养18h,测定酶活力和生长量,结果如图11所示。 随着装液量的增加,菌株的生长量相应减少。装液量对菌株产酶的影响可以分成两部分。当装液量相对高时减少装液量对菌株产酶的影响相当明显;而当装液量相对低时,,
谷氨酸脱羧酶的酶活。
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(责任编辑:秦和平,李春丽)