草乌炮制前后化学成分、毒性比较
吕岩
（南京中医药大学中药学 江苏 南京 210046 ）
摘 要 通过实验比较炮制前后草乌的化学成分、药效作用、毒性的变化。 关 键 词 草乌 炮制 化学成分 毒性
前 言 中药草乌为毛莨科乌头属植物北乌头(Alkusnezoffii)的块根。味辛、苦；性热；有大毒。具有祛风除湿、温经止痛的功效。现代药理学研究表明，乌头的提取物具有镇痛、消炎、麻醉、降压及对心脏产生刺激等作用, 其有效成分为生物碱。这类生物碱有很强的毒性，人口服乌头碱0.2mg 即可引起中毒，乌头碱的致死量为3~4mg；常见的中毒症状主要以神经系统、循环系统和消化系统的表现为主[1]。为了降低乌头药材的毒性, 历代医家分别采用了不同的炮制方法
[2]，如草乌：唐代有姜汁煮、醋煮、山矾灰汁浸等的炮制方法，宋代有炒焦、炒黑存性等。现通过实验比较炮制前后草乌化学成分、药效作用、毒性的变化。
1、草乌药材的炮制
1.1草乌炮制的目的
草乌炮制的目的是为了降低药材中所含的毒性物质，以减少在用药过程中的风险，达到安全用药的目的
1.2草乌炮制降毒原理
草乌中含有双酯型生物碱（乌头碱、中乌头碱、次乌头碱等），具有强毒性，但该类双酯型生物碱性质不稳定，遇水、加热易被水解，使极毒的双酯型乌头碱C8 位上的酯基水解，生成单酯型生物碱：苯甲酰乌头胺（乌头次碱Benzoylaconine ）、苯甲酰中乌头胺（Benzoylmesaconine ）、苯甲酰次乌头胺
（Benzoylhypaconine ），其毒性为双酯型乌头碱的1/50~1/500。再进一步水解，使C14位上的酯基水解，生成醇胺型乌头原碱类：乌头胺（乌头原碱Aconine ） 、中乌头胺（Mesaconine ）、次乌头胺（Hypaconine ），其毒性仅为双酯型乌头碱的1/2000~1/4000。另一原因可能是炮制过程中脂肪酰基取代了C8位上的乙酰基，生成脂碱，从而降低毒性。
1.3草乌炮制方法
制草乌 按《中国药典》制草乌“制法”项下方法炮制：取草乌，大小分档，用水浸泡至内无干心，取出，加水煮沸，至取大个及实心者切开内无白心，口尝微有麻舌感时，取出，晾至六成干，切厚片 , 干燥。
生草乌 草乌晾干, 切厚片, 干燥。
分别取上述炮制品各30g ，用适量水煮2次，约四十分钟，共制得100ml ，即为30%的草乌煎液（每ml 煎液相当于生药0.3g ）分别即为生品水煎液A 、煮品水煎液B 。---用于药理实验
分别取上述生草乌和煮草乌20g ，粉碎，过三号筛，备用。---用于含量测定
2、酯型生物碱的含量测定[3]
2.1色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 流动相[乙腈-四氢呋喃（25:15）](A)-[0.1mol/L乙酸铵（1000ml 加乙酸0.5ml ）（]B ）梯度洗脱（0~15min,16%~19%A；15~45min,19%~22%A；45~60min,22%~35%A,65~75min,35%A），流速0.8ml/min；柱温30℃；检测波长235nm 。
2.2对照品溶液的制备 分别精密称取新乌头碱2.37mg ，乌头碱2.04mg ，次乌头碱1.61mg ，苯甲酰新乌头原碱4.02mg ，苯甲酰乌头原碱 3.04mg ，苯甲酰次乌头原碱 3.19mg ，置于 10ml 量瓶中，加0.05%盐酸-甲醇溶液，稀释至刻
度，摇匀，即得混合对照品 溶液。
2.3标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液2,4,6,8,10,12,16,20μL ，分别注入液相色谱仪，峰面积为纵坐标，进样量(μl) 为横坐标，绘制标准曲线。
2.4供试品溶液的制备 分别称取草乌及其炮制品粉末( 过三号筛) 2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入氨试液 3ml 与异丙醇-乙酸乙酯( 1:1) 混合溶液 50ml ，摇匀，称定质量，放置16h ，连续超声 30min ，冷却，称定质量，用混合溶液补足减失质量，摇匀，滤过，精密移取续滤液 25ml ，于 40℃ 以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入 0.05%盐酸-甲醇溶液 5ml 溶解，摇匀0.45μm 滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.4样品含量测定 分别吸取供试品溶液生草乌和煮草乌各10μl 及对照品溶液10μl 注入液相色谱仪, 进行测定。每份样品重复测定3次, 取其平均值。通过标准曲线计算六种生物碱的含量。
3. 炮制对草乌药理作用影响的研究
草乌具有良好的镇痛、抗炎和免疫抑制作用, 但因其毒性大, 临床上常因用药不当而造成中毒甚至死亡。现代对草乌进行了比较广泛的研究。我们小组选择利用小鼠扭体反应，研究草乌炮制前后对镇痛效果的影响。
3.1药效试验—草乌炮制前后对镇痛效应的影响
3.1.1器材和药品 注射器、秒表 ；0.3g/ml炮制前后的草乌水煎液A 、B （炮制方法见前），0.6%醋酸水溶液，生理盐水， 0.4%哌替啶生理盐水溶液 ；实验动物为小白鼠（18-22g ）
3.1.2实验步骤 取体重18-22g 的健康小白鼠40只，随机分成四组，每组10只，第一组腹腔注射0.4%哌替啶溶液20mg/Kg,第二组腹腔注射生理盐水
0.1ml/10g, 第三组腹腔注射0.003g/ml(吸取1ml 水煎液A 至100ml 容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度) 生品草乌水煎液0.1ml/10g,剂量为0.03g/kg。第四组腹腔注射煮0.003g/ml（吸取1ml 水煎液B 至100ml 容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度）制草乌水煎液0.1ml/10g,剂量为0.03g/kg。药后半小时，每鼠均由腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2ml/只，观察扭体潜伏期以及0-15min,15-30min 的扭体次数。实验结束后计算镇痛百分率。
4. 炮制前后草乌的毒性比较
我们通过小鼠死亡率来评价炮制前后草乌的毒性变化
4.1毒性试验——草乌生品和炮制品的死亡率的变化
4.1.1器材和药品 注射器、烧杯、计时器；0.3g/ml炮制前后得到的草乌水煎液（炮制方法见前）；动物为小白鼠（18-22g ）。
4.1.2实验步骤 取小白鼠雌雄各半，随机分组。各剂量每组10只，分别灌胃生品和炮制品的药物，注射量为0.1ml/10g体重, 剂量为3g/kg，观察24小时内死亡率并记录。
总 结
炮制是降低草乌毒性的第一步，是系统研究草乌的起点。通过炮制草乌的毒性降低，是目前我们所能研究草乌的唯一契机。目前草乌炮制方法仍以水煮、蒸制法为主，较少应用高压蒸制或微波炮制等方法。虽然应用 2010 年版《中国药典》中方法炮制时，草乌中各含量的变化较稳定，但人力、物力、财力消耗大，且根据口尝的方法鉴定炮制终点的随意性比较大，所以对草乌的炮制进行全面的研究是当务之急。
参考文献
〔1〕侯家玉, 方泰惠主编. 中药药理学〔M 〕. 北京:中国中医药出版社,2007,3(10):1141
〔2〕龚千锋主编. 中药炮制学〔M 〕. 北京:中国中医药出版社,2007,91:293-2961 〔3〕吴皓，蔡宝昌 中药炮制学实验〔M 〕北京：中国中医药出版社，2010:70-72
草乌炮制前后化学成分、毒性比较
吕岩
（南京中医药大学中药学 江苏 南京 210046 ）
摘 要 通过实验比较炮制前后草乌的化学成分、药效作用、毒性的变化。 关 键 词 草乌 炮制 化学成分 毒性
前 言 中药草乌为毛莨科乌头属植物北乌头(Alkusnezoffii)的块根。味辛、苦；性热；有大毒。具有祛风除湿、温经止痛的功效。现代药理学研究表明，乌头的提取物具有镇痛、消炎、麻醉、降压及对心脏产生刺激等作用, 其有效成分为生物碱。这类生物碱有很强的毒性，人口服乌头碱0.2mg 即可引起中毒，乌头碱的致死量为3~4mg；常见的中毒症状主要以神经系统、循环系统和消化系统的表现为主[1]。为了降低乌头药材的毒性, 历代医家分别采用了不同的炮制方法
[2]，如草乌：唐代有姜汁煮、醋煮、山矾灰汁浸等的炮制方法，宋代有炒焦、炒黑存性等。现通过实验比较炮制前后草乌化学成分、药效作用、毒性的变化。
1、草乌药材的炮制
1.1草乌炮制的目的
草乌炮制的目的是为了降低药材中所含的毒性物质，以减少在用药过程中的风险，达到安全用药的目的
1.2草乌炮制降毒原理
草乌中含有双酯型生物碱（乌头碱、中乌头碱、次乌头碱等），具有强毒性，但该类双酯型生物碱性质不稳定，遇水、加热易被水解，使极毒的双酯型乌头碱C8 位上的酯基水解，生成单酯型生物碱：苯甲酰乌头胺（乌头次碱Benzoylaconine ）、苯甲酰中乌头胺（Benzoylmesaconine ）、苯甲酰次乌头胺
（Benzoylhypaconine ），其毒性为双酯型乌头碱的1/50~1/500。再进一步水解，使C14位上的酯基水解，生成醇胺型乌头原碱类：乌头胺（乌头原碱Aconine ） 、中乌头胺（Mesaconine ）、次乌头胺（Hypaconine ），其毒性仅为双酯型乌头碱的1/2000~1/4000。另一原因可能是炮制过程中脂肪酰基取代了C8位上的乙酰基，生成脂碱，从而降低毒性。
1.3草乌炮制方法
制草乌 按《中国药典》制草乌“制法”项下方法炮制：取草乌，大小分档，用水浸泡至内无干心，取出，加水煮沸，至取大个及实心者切开内无白心，口尝微有麻舌感时，取出，晾至六成干，切厚片 , 干燥。
生草乌 草乌晾干, 切厚片, 干燥。
分别取上述炮制品各30g ，用适量水煮2次，约四十分钟，共制得100ml ，即为30%的草乌煎液（每ml 煎液相当于生药0.3g ）分别即为生品水煎液A 、煮品水煎液B 。---用于药理实验
分别取上述生草乌和煮草乌20g ，粉碎，过三号筛，备用。---用于含量测定
2、酯型生物碱的含量测定[3]
2.1色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 流动相[乙腈-四氢呋喃（25:15）](A)-[0.1mol/L乙酸铵（1000ml 加乙酸0.5ml ）（]B ）梯度洗脱（0~15min,16%~19%A；15~45min,19%~22%A；45~60min,22%~35%A,65~75min,35%A），流速0.8ml/min；柱温30℃；检测波长235nm 。
2.2对照品溶液的制备 分别精密称取新乌头碱2.37mg ，乌头碱2.04mg ，次乌头碱1.61mg ，苯甲酰新乌头原碱4.02mg ，苯甲酰乌头原碱 3.04mg ，苯甲酰次乌头原碱 3.19mg ，置于 10ml 量瓶中，加0.05%盐酸-甲醇溶液，稀释至刻
度，摇匀，即得混合对照品 溶液。
2.3标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液2,4,6,8,10,12,16,20μL ，分别注入液相色谱仪，峰面积为纵坐标，进样量(μl) 为横坐标，绘制标准曲线。
2.4供试品溶液的制备 分别称取草乌及其炮制品粉末( 过三号筛) 2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入氨试液 3ml 与异丙醇-乙酸乙酯( 1:1) 混合溶液 50ml ，摇匀，称定质量，放置16h ，连续超声 30min ，冷却，称定质量，用混合溶液补足减失质量，摇匀，滤过，精密移取续滤液 25ml ，于 40℃ 以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入 0.05%盐酸-甲醇溶液 5ml 溶解，摇匀0.45μm 滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.4样品含量测定 分别吸取供试品溶液生草乌和煮草乌各10μl 及对照品溶液10μl 注入液相色谱仪, 进行测定。每份样品重复测定3次, 取其平均值。通过标准曲线计算六种生物碱的含量。
3. 炮制对草乌药理作用影响的研究
草乌具有良好的镇痛、抗炎和免疫抑制作用, 但因其毒性大, 临床上常因用药不当而造成中毒甚至死亡。现代对草乌进行了比较广泛的研究。我们小组选择利用小鼠扭体反应，研究草乌炮制前后对镇痛效果的影响。
3.1药效试验—草乌炮制前后对镇痛效应的影响
3.1.1器材和药品 注射器、秒表 ；0.3g/ml炮制前后的草乌水煎液A 、B （炮制方法见前），0.6%醋酸水溶液，生理盐水， 0.4%哌替啶生理盐水溶液 ；实验动物为小白鼠（18-22g ）
3.1.2实验步骤 取体重18-22g 的健康小白鼠40只，随机分成四组，每组10只，第一组腹腔注射0.4%哌替啶溶液20mg/Kg,第二组腹腔注射生理盐水
0.1ml/10g, 第三组腹腔注射0.003g/ml(吸取1ml 水煎液A 至100ml 容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度) 生品草乌水煎液0.1ml/10g,剂量为0.03g/kg。第四组腹腔注射煮0.003g/ml（吸取1ml 水煎液B 至100ml 容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度）制草乌水煎液0.1ml/10g,剂量为0.03g/kg。药后半小时，每鼠均由腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2ml/只，观察扭体潜伏期以及0-15min,15-30min 的扭体次数。实验结束后计算镇痛百分率。
4. 炮制前后草乌的毒性比较
我们通过小鼠死亡率来评价炮制前后草乌的毒性变化
4.1毒性试验——草乌生品和炮制品的死亡率的变化
4.1.1器材和药品 注射器、烧杯、计时器；0.3g/ml炮制前后得到的草乌水煎液（炮制方法见前）；动物为小白鼠（18-22g ）。
4.1.2实验步骤 取小白鼠雌雄各半，随机分组。各剂量每组10只，分别灌胃生品和炮制品的药物，注射量为0.1ml/10g体重, 剂量为3g/kg，观察24小时内死亡率并记录。
总 结
炮制是降低草乌毒性的第一步，是系统研究草乌的起点。通过炮制草乌的毒性降低，是目前我们所能研究草乌的唯一契机。目前草乌炮制方法仍以水煮、蒸制法为主，较少应用高压蒸制或微波炮制等方法。虽然应用 2010 年版《中国药典》中方法炮制时，草乌中各含量的变化较稳定，但人力、物力、财力消耗大，且根据口尝的方法鉴定炮制终点的随意性比较大，所以对草乌的炮制进行全面的研究是当务之急。
参考文献
〔1〕侯家玉, 方泰惠主编. 中药药理学〔M 〕. 北京:中国中医药出版社,2007,3(10):1141
〔2〕龚千锋主编. 中药炮制学〔M 〕. 北京:中国中医药出版社,2007,91:293-2961 〔3〕吴皓，蔡宝昌 中药炮制学实验〔M 〕北京：中国中医药出版社，2010:70-72