（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）
概念：
1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？
pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？
各种SD培养基：
1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml) （？
“四缺”）
酵母氮源（YNB）：6.7g ;
-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;
葡萄糖 20g (即2%)
2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)
酵母氮源（YNB）：6.7g ;
-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）
葡萄糖 20g. (即2%)
3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）
酵母氮源（YNB）：6.7g ;
-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;
葡萄糖 20g (即2%)
4) SD/-leu (1000 ml)
酵母氮源（YNB）：6.7g ;
-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）
葡萄糖 20g (即2%)
5) SD/-trp (1000 ml)
酵母氮源（YNB）：6.7g ;
-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）
葡萄糖 20g (即2%)
注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。
实际配制的方法是：
1. 配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃
以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）
2. 酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大
约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。
3. 高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。
YPD培养基(1000 ml)
20 g/L 蛋白胨
10 g/L 酵母提取物
20 g/L 琼脂（只有制作平板才用）
20 g/L 葡萄糖 (即2%)
1x YPDA培养基(1000 ml)
20 g/L 蛋白胨
10 g/L 酵母提取物
0.03 g/L 腺嘌呤 （即终浓度为0.003％）腺嘌呤可以耐受高温
20 g/L 葡萄糖 (即2%)
实际配制的方法是：
1. 配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃
以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）
2. 配制0.2%的腺嘌呤溶液，过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将15ml
腺嘌呤溶液加入。（或将腺嘌呤直接加进去，为了方便我将直接加进去一起高压）
3. （蛋白胨 20g ；酵母提取物10g ；水大约925ml）混合后，调至PH至6.5，加水至935ml，
121℃高压15min。
注意：
◆ 高压的温度和时间不能太长与太高，121℃高压15min即可。
◆ 可以在YPDA中加入20 g/L的琼脂，以配成平板。
◆ 需要加kanamycin时，kan终浓度是10–15 mg/L。（kanamycin可以20℃贮存一个月，
加入到平板中去可以4℃贮存一个月。）
PEG/LiAc溶液（即配即用）
用下列贮存液来配制
50% PEG 3350：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。
10X TE buffer：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。
10X LiAc：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。
最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml为例）
终浓度 为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质
PEG 4000 40% 8 ml of 50% PEG
TE buffer 1X 1 ml of 10X TE
LiAc 1X 1 ml of 10X LiAc
无菌1x TE/LiAc溶液（用10x已灭菌的贮存液稀释）
10x TE buffer : 0.1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5(高压)
10x LiAc ： 1 M 用稀醋酸调节PH至7.5 高压
For β-galactosidase 滤膜实验
Z buffer溶液：
Na2HPO4• 7H2O 16.1 g/L （如换Na2HPO4• 14H2O 则 20.739 g/L） NaH2PO4• H2O 5.50 g/L （如换NaH2PO4• 2H2O 则 6. 21g/L） KCl 0.75 g/L
MgSO4 • 7H2O 0.246 g/L
最后调PH至7.0，高压，室温下可以贮存1年
X-gal 溶液：
X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至浓度为20 mg/ml.，–20°C避光保存
Z buffer/X-gal 溶液：
100 ml Z buffer
0.27 ml β-mercaptoethanol （β-巯基乙醇）
1.67 ml X-gal 贮存液
ONPG 溶液：（即配即用）
ONPG溶于Z buffer中，终浓度4 mg/ml，调PH至7.0.
注意：
1. ONPG需要1～2h才能溶解
2. 每次用之前新鲜制备。
带有β-巯基乙醇的Z buffer
将0.27 mlβ-巯基乙醇加入100 ml Z buffer中即可
为了转化成功的小提示：
1.用一个1～3周龄（直径2～3mm）的菌落去接种液体培养基。如果菌落直径＜2mm，就用多几个菌落去接种。（也要大力涡旋使细胞团分散开来。）
2.如果过夜或者3hr之后的培养基明显成块，那么在使用之前一定要充分涡旋使培养基。
3.当通过离心收集细胞的时候，使用一个离心管即可，可以更好、更充分地收集细胞。
4.为了提高转化效率，要在1小时内准备酵母感受态细胞。如果有必要，可以在11步之后在室温条件下储存酵母感受态细胞几个小时，而活性却只有一点降低。
5.当进行通同转化的时候，诱饵（BD）质粒的量必须过度，而AD质粒的量要不足。
一般BD是AD的两倍。（李博士：此要求一般是针对文库筛选而言）
6.为了使菌落更好地生长，在涂布转化复合物到琼脂平板上时要直到所有液体被吸收。可以选择直径5mm的无菌玻璃珠（每一个100mm的平板用5-7个玻璃珠，直径150mm的平板用7-9个玻璃珠）去促进转化复合物的扩散，摇动的时候shake the plate back and forth—not round and round. （科内似并无此操作，而仅仅以玻棒涂布耳）
一. 复苏酵母：将酵母细胞接种到YPD固体培养基中培养，培养1-3周。（接种的时候采取四区分区画线法）
二. 酵母感受态细胞置备和转化步骤：
1.取直径2～3mm的克隆接种到1ml的YPD或SD培养基中。
2.剧烈振荡或涡旋5min，使所有团块分散开来。
3.转移酵母液到50 mlYPD（？固体——也有液态的，未加入琼脂粉耳）或者SD培养基中。
4.置于30℃摇床中，以250 rpm的转速震荡培养基16～18h，直到OD600>1.5
5.转移部分过夜培养物（30ml）到300mlYPD培养基（？固体）中，使最终OD600 在0.2～0.3之间。
6.30℃摇床以230 rpm的转速震荡培养基3～4h直至OD为 0.4～0.6.
（If the OD600 is
7.转移酵母液至50ml离心管中，1000g室温（20～21°C）离心5min
8.弃去上清，加入25～50ml无菌水或无菌的1x TE重悬酵母。
9.在1000g室温（20～21°C）条件下离心5min
10.轻轻倒出（弃去）上清
11.将细胞重悬于1.5ml新鲜准备的，无菌的1xTE/1xLiAc（在实验开始之前置备） (至此酵母感受态细胞制备完毕)
12. 向无菌的1.5ml微量离心管中加入质粒DNA各0.1ug和0.1mg鲱鱼精载体DNA，之后轻轻混匀。
我做的实验应该如下：
13.再向每管中加入0.1 ml 酵母感受态细胞，并且震荡混匀。
14.向每一管加入600 ul无菌PEG/LiAc溶液，高速振荡混匀。
15.30℃摇床以200 rpm的转速振荡培养30 min
16.向每一管加入70 ul DMSO 轻轻颠倒混匀，不要震荡。
17.42℃水浴热激15 min
18.取出后在冰上冷却1-2 min
19.1000 rpm室温离心5 min，弃去上清。
20.用0.5 ml 无菌的1×TE重悬酵母。
21.取合适体积的菌液（一般是100 ul）涂在选择性的SD培养基的平板上，在30℃培养箱
中培养2-4天。（将克隆分成三份涂与不同平板上，1/3涂在SD/–His/–Leu/–Trp，1/3涂在SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp，最后1/3涂在SD/–Leu/–Trp上。） （科内仅涂布二缺与四缺板） （在21步之后涂一个二缺板和一个四缺板）因为在二缺板中AH109能生长，说明BD和AD已经转进去了。如果在四缺板中能生长，说明诱饵和文库肯定有作用，接着做一个α- gal实验。如果是将质粒转到Y187中的话，21步之后涂一个二缺板就行了。如果酵母能生长的话就接着做一个β- gal。所以有的人同时转化两种菌种。这样就完全可以确定两蛋白是否有作用了。
之后计算转化率，如果转化率达到10的6次方以上，那么就可以接着做后面的检验实验。
三. α和β-gal实验：（我就做β
1.试剂： -gal试验，要注意如果做β-gal的话，这时候菌种要换成Y187，而不是之前的AH109）（在protocol 的24～28页）
2.原理：
◆ ONPG为无色物质，在β-半乳糖苷酶的作用催化下生成黄色的onitrophenol(硝基苯
酚)，在420 nm (OD410)处有光吸收。
◆ Na2CO3可以提高PH值，使酶变性，从而终止反应。（Na2CO3在配制时，不需要高压）
3.实验方法
一. Colony-lift Filter Assay（滤膜分析或滤膜试验）（这是定性试验）
a) 将要测试的菌株（直径1-3mm）转接到新的选择性SD培养基中，30℃培养2-4天。 b) 准备Z buffer/X-gal 溶液。
c) 为每一个要测试的平板准备好一张无菌的Whatman 滤纸，置于100mm或150mm无菌
平板中用2.5-5ml Z buffer/X-gal 溶液浸泡。
d) 用无菌的镊子小心地将无菌Whatman 滤纸覆盖到平板表面，要使所有的待测菌株都有
部分沾到滤纸上。
e) 用注射器在滤纸上打3个或更多的不对称的孔，以标志方向。
f) 滤纸放入液氮中0.5～1min至结冰，之后再放置于室温融化，如此反复冻融3次。 g) 小心地将带有菌株的滤纸放到预浸泡的滤纸上，有菌株一面向上，注意两层滤纸中间不
要有气泡。
h) 平板放到30℃培养箱中，观察其是否变蓝。一般阳性克隆在0.5～8h内会变蓝，超过
8h容易产生假阳性结果。
二 . Liquid Culture Assay（以ONPG为底物的液体培养法）（这是定量试验）
1) 在合适的SD培养基中制备5 ml过度培养物。
注意：你所选用的SD培养基要适合你所用的系统和质粒。
2) 在进行实验当天，将ONPG以4 mg/ml 的浓度溶于Z buffer中，振荡1～2h确保完全
溶解。
3) 大力涡旋过夜培养基1min以分散细胞团块，立即转移2ml（0.5ml）过夜培养基物到8ml
(2ml)YPD培溶液中。（以25%的含量加）
4) 30℃培养3～5h（230-250 rpm）直至细胞进入对数生长期（1ml溶液的OD600应在0.5-0.8
之间）在收获细胞的同时记录OD600值。
注意：在检测OD值的时候，涡旋培养基0.5-1ml以分散细胞团块
5) 各吸取1.5 ml（0.5 ml）培养物到各3个1.5 ml离心管（每个管子就是1.5ml），离心14000
rpm/30sec。
6) 小心移去上清，加上1.5 ml（0.5 ml）Z buffer到每个管中，涡旋直到细胞重悬。
7) 再次离心并移去上清，加上300ul（100 ul）Z buffer到每个管中，涡旋直到细胞重悬。
这样，终浓度就是1.5/0.3 = 5倍。
注意：在这个清洗步骤之后，细胞收获物的差异可以通过再次读取OD600值来纠正。
8) 转移0.1ml细胞悬液至新的离心管中。
9) 将细胞置于液氮中（约0.5～1min）直至细胞冰冻。
10) 将离心管放于37℃水浴中0.5～1min使其融化。
11) 反复冻融3次（重复9和10步）确保细胞裂解。
12) 用100 ul Z buffer.来设置一个空白对照。
13) 加0.7 ml 的Z buffer 与β-巯基乙醇到反应管和空白管中
注意：在冰冻之前不要加Z buffer
14) 立即加160 ul ONPG（溶于Z buffer中）至各反应管和空白管中，开始计时。
15) 将各管放入30℃水浴中。
16) 待出现黄色后，加0.4 ml 的1 M Na2CO3至各反应管和空白管中，以分钟计算消退时间。 注意：
● 需要的时间可能会变化，（对于单个的β-gal阳性对照质粒约需3～15min，对于双
杂交阳性对照约30min，弱的反应可能需24h.）
● 黄色不稳定，并且随时间延长可能加剧。每一批需要做一个新的空白管。
17) 14,000 rpm离心10 min，以除去细胞碎片。
18) 仔细小心转移上清到清洁比色杯中。 注意：如果上清中若混有细胞碎片，将严重干扰本实验的精确性
19) 以空白管在A420校准分光光度计，并且测量在OD420值。OD420值终在0.02-1.0之间才
会处于线性范围内。
20) 计算β-半乳糖苷酶单位，1个单位的β-半乳糖苷酶被定义为每个细胞每分钟水解
1umol ONPG为邻硝基苯酚和D-半乳糖所需要的量。
β-半乳糖苷酶活性单位 = 1000×OD420（t × V ×OD600）
t = 孵育过程中黄色消退的时间（min）
V = 0.1ml×浓度因子
OD600值 = 1 ml培养基的OD600值
注意：这里的终浓度因子是5（第七步），然而可以试用几个不同的稀释度以确保分析位于线性范围内。
◆ 为了减少实验的变异性，需挑5个单独的克隆，每个克隆进行3次试验。
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）
概念：
1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？
pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？
各种SD培养基：
1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml) （？
“四缺”）
酵母氮源（YNB）：6.7g ;
-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;
葡萄糖 20g (即2%)
2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)
酵母氮源（YNB）：6.7g ;
-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）
葡萄糖 20g. (即2%)
3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）
酵母氮源（YNB）：6.7g ;
-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;
葡萄糖 20g (即2%)
4) SD/-leu (1000 ml)
酵母氮源（YNB）：6.7g ;
-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）
葡萄糖 20g (即2%)
5) SD/-trp (1000 ml)
酵母氮源（YNB）：6.7g ;
-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）
葡萄糖 20g (即2%)
注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。
实际配制的方法是：
1. 配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃
以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）
2. 酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大
约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。
3. 高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。
YPD培养基(1000 ml)
20 g/L 蛋白胨
10 g/L 酵母提取物
20 g/L 琼脂（只有制作平板才用）
20 g/L 葡萄糖 (即2%)
1x YPDA培养基(1000 ml)
20 g/L 蛋白胨
10 g/L 酵母提取物
0.03 g/L 腺嘌呤 （即终浓度为0.003％）腺嘌呤可以耐受高温
20 g/L 葡萄糖 (即2%)
实际配制的方法是：
1. 配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃
以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）
2. 配制0.2%的腺嘌呤溶液，过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将15ml
腺嘌呤溶液加入。（或将腺嘌呤直接加进去，为了方便我将直接加进去一起高压）
3. （蛋白胨 20g ；酵母提取物10g ；水大约925ml）混合后，调至PH至6.5，加水至935ml，
121℃高压15min。
注意：
◆ 高压的温度和时间不能太长与太高，121℃高压15min即可。
◆ 可以在YPDA中加入20 g/L的琼脂，以配成平板。
◆ 需要加kanamycin时，kan终浓度是10–15 mg/L。（kanamycin可以20℃贮存一个月，
加入到平板中去可以4℃贮存一个月。）
PEG/LiAc溶液（即配即用）
用下列贮存液来配制
50% PEG 3350：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。
10X TE buffer：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。
10X LiAc：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。
最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml为例）
终浓度 为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质
PEG 4000 40% 8 ml of 50% PEG
TE buffer 1X 1 ml of 10X TE
LiAc 1X 1 ml of 10X LiAc
无菌1x TE/LiAc溶液（用10x已灭菌的贮存液稀释）
10x TE buffer : 0.1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5(高压)
10x LiAc ： 1 M 用稀醋酸调节PH至7.5 高压
For β-galactosidase 滤膜实验
Z buffer溶液：
Na2HPO4• 7H2O 16.1 g/L （如换Na2HPO4• 14H2O 则 20.739 g/L） NaH2PO4• H2O 5.50 g/L （如换NaH2PO4• 2H2O 则 6. 21g/L） KCl 0.75 g/L
MgSO4 • 7H2O 0.246 g/L
最后调PH至7.0，高压，室温下可以贮存1年
X-gal 溶液：
X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至浓度为20 mg/ml.，–20°C避光保存
Z buffer/X-gal 溶液：
100 ml Z buffer
0.27 ml β-mercaptoethanol （β-巯基乙醇）
1.67 ml X-gal 贮存液
ONPG 溶液：（即配即用）
ONPG溶于Z buffer中，终浓度4 mg/ml，调PH至7.0.
注意：
1. ONPG需要1～2h才能溶解
2. 每次用之前新鲜制备。
带有β-巯基乙醇的Z buffer
将0.27 mlβ-巯基乙醇加入100 ml Z buffer中即可
为了转化成功的小提示：
1.用一个1～3周龄（直径2～3mm）的菌落去接种液体培养基。如果菌落直径＜2mm，就用多几个菌落去接种。（也要大力涡旋使细胞团分散开来。）
2.如果过夜或者3hr之后的培养基明显成块，那么在使用之前一定要充分涡旋使培养基。
3.当通过离心收集细胞的时候，使用一个离心管即可，可以更好、更充分地收集细胞。
4.为了提高转化效率，要在1小时内准备酵母感受态细胞。如果有必要，可以在11步之后在室温条件下储存酵母感受态细胞几个小时，而活性却只有一点降低。
5.当进行通同转化的时候，诱饵（BD）质粒的量必须过度，而AD质粒的量要不足。
一般BD是AD的两倍。（李博士：此要求一般是针对文库筛选而言）
6.为了使菌落更好地生长，在涂布转化复合物到琼脂平板上时要直到所有液体被吸收。可以选择直径5mm的无菌玻璃珠（每一个100mm的平板用5-7个玻璃珠，直径150mm的平板用7-9个玻璃珠）去促进转化复合物的扩散，摇动的时候shake the plate back and forth—not round and round. （科内似并无此操作，而仅仅以玻棒涂布耳）
一. 复苏酵母：将酵母细胞接种到YPD固体培养基中培养，培养1-3周。（接种的时候采取四区分区画线法）
二. 酵母感受态细胞置备和转化步骤：
1.取直径2～3mm的克隆接种到1ml的YPD或SD培养基中。
2.剧烈振荡或涡旋5min，使所有团块分散开来。
3.转移酵母液到50 mlYPD（？固体——也有液态的，未加入琼脂粉耳）或者SD培养基中。
4.置于30℃摇床中，以250 rpm的转速震荡培养基16～18h，直到OD600>1.5
5.转移部分过夜培养物（30ml）到300mlYPD培养基（？固体）中，使最终OD600 在0.2～0.3之间。
6.30℃摇床以230 rpm的转速震荡培养基3～4h直至OD为 0.4～0.6.
（If the OD600 is
7.转移酵母液至50ml离心管中，1000g室温（20～21°C）离心5min
8.弃去上清，加入25～50ml无菌水或无菌的1x TE重悬酵母。
9.在1000g室温（20～21°C）条件下离心5min
10.轻轻倒出（弃去）上清
11.将细胞重悬于1.5ml新鲜准备的，无菌的1xTE/1xLiAc（在实验开始之前置备） (至此酵母感受态细胞制备完毕)
12. 向无菌的1.5ml微量离心管中加入质粒DNA各0.1ug和0.1mg鲱鱼精载体DNA，之后轻轻混匀。
我做的实验应该如下：
13.再向每管中加入0.1 ml 酵母感受态细胞，并且震荡混匀。
14.向每一管加入600 ul无菌PEG/LiAc溶液，高速振荡混匀。
15.30℃摇床以200 rpm的转速振荡培养30 min
16.向每一管加入70 ul DMSO 轻轻颠倒混匀，不要震荡。
17.42℃水浴热激15 min
18.取出后在冰上冷却1-2 min
19.1000 rpm室温离心5 min，弃去上清。
20.用0.5 ml 无菌的1×TE重悬酵母。
21.取合适体积的菌液（一般是100 ul）涂在选择性的SD培养基的平板上，在30℃培养箱
中培养2-4天。（将克隆分成三份涂与不同平板上，1/3涂在SD/–His/–Leu/–Trp，1/3涂在SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp，最后1/3涂在SD/–Leu/–Trp上。） （科内仅涂布二缺与四缺板） （在21步之后涂一个二缺板和一个四缺板）因为在二缺板中AH109能生长，说明BD和AD已经转进去了。如果在四缺板中能生长，说明诱饵和文库肯定有作用，接着做一个α- gal实验。如果是将质粒转到Y187中的话，21步之后涂一个二缺板就行了。如果酵母能生长的话就接着做一个β- gal。所以有的人同时转化两种菌种。这样就完全可以确定两蛋白是否有作用了。
之后计算转化率，如果转化率达到10的6次方以上，那么就可以接着做后面的检验实验。
三. α和β-gal实验：（我就做β
1.试剂： -gal试验，要注意如果做β-gal的话，这时候菌种要换成Y187，而不是之前的AH109）（在protocol 的24～28页）
2.原理：
◆ ONPG为无色物质，在β-半乳糖苷酶的作用催化下生成黄色的onitrophenol(硝基苯
酚)，在420 nm (OD410)处有光吸收。
◆ Na2CO3可以提高PH值，使酶变性，从而终止反应。（Na2CO3在配制时，不需要高压）
3.实验方法
一. Colony-lift Filter Assay（滤膜分析或滤膜试验）（这是定性试验）
a) 将要测试的菌株（直径1-3mm）转接到新的选择性SD培养基中，30℃培养2-4天。 b) 准备Z buffer/X-gal 溶液。
c) 为每一个要测试的平板准备好一张无菌的Whatman 滤纸，置于100mm或150mm无菌
平板中用2.5-5ml Z buffer/X-gal 溶液浸泡。
d) 用无菌的镊子小心地将无菌Whatman 滤纸覆盖到平板表面，要使所有的待测菌株都有
部分沾到滤纸上。
e) 用注射器在滤纸上打3个或更多的不对称的孔，以标志方向。
f) 滤纸放入液氮中0.5～1min至结冰，之后再放置于室温融化，如此反复冻融3次。 g) 小心地将带有菌株的滤纸放到预浸泡的滤纸上，有菌株一面向上，注意两层滤纸中间不
要有气泡。
h) 平板放到30℃培养箱中，观察其是否变蓝。一般阳性克隆在0.5～8h内会变蓝，超过
8h容易产生假阳性结果。
二 . Liquid Culture Assay（以ONPG为底物的液体培养法）（这是定量试验）
1) 在合适的SD培养基中制备5 ml过度培养物。
注意：你所选用的SD培养基要适合你所用的系统和质粒。
2) 在进行实验当天，将ONPG以4 mg/ml 的浓度溶于Z buffer中，振荡1～2h确保完全
溶解。
3) 大力涡旋过夜培养基1min以分散细胞团块，立即转移2ml（0.5ml）过夜培养基物到8ml
(2ml)YPD培溶液中。（以25%的含量加）
4) 30℃培养3～5h（230-250 rpm）直至细胞进入对数生长期（1ml溶液的OD600应在0.5-0.8
之间）在收获细胞的同时记录OD600值。
注意：在检测OD值的时候，涡旋培养基0.5-1ml以分散细胞团块
5) 各吸取1.5 ml（0.5 ml）培养物到各3个1.5 ml离心管（每个管子就是1.5ml），离心14000
rpm/30sec。
6) 小心移去上清，加上1.5 ml（0.5 ml）Z buffer到每个管中，涡旋直到细胞重悬。
7) 再次离心并移去上清，加上300ul（100 ul）Z buffer到每个管中，涡旋直到细胞重悬。
这样，终浓度就是1.5/0.3 = 5倍。
注意：在这个清洗步骤之后，细胞收获物的差异可以通过再次读取OD600值来纠正。
8) 转移0.1ml细胞悬液至新的离心管中。
9) 将细胞置于液氮中（约0.5～1min）直至细胞冰冻。
10) 将离心管放于37℃水浴中0.5～1min使其融化。
11) 反复冻融3次（重复9和10步）确保细胞裂解。
12) 用100 ul Z buffer.来设置一个空白对照。
13) 加0.7 ml 的Z buffer 与β-巯基乙醇到反应管和空白管中
注意：在冰冻之前不要加Z buffer
14) 立即加160 ul ONPG（溶于Z buffer中）至各反应管和空白管中，开始计时。
15) 将各管放入30℃水浴中。
16) 待出现黄色后，加0.4 ml 的1 M Na2CO3至各反应管和空白管中，以分钟计算消退时间。 注意：
● 需要的时间可能会变化，（对于单个的β-gal阳性对照质粒约需3～15min，对于双
杂交阳性对照约30min，弱的反应可能需24h.）
● 黄色不稳定，并且随时间延长可能加剧。每一批需要做一个新的空白管。
17) 14,000 rpm离心10 min，以除去细胞碎片。
18) 仔细小心转移上清到清洁比色杯中。 注意：如果上清中若混有细胞碎片，将严重干扰本实验的精确性
19) 以空白管在A420校准分光光度计，并且测量在OD420值。OD420值终在0.02-1.0之间才
会处于线性范围内。
20) 计算β-半乳糖苷酶单位，1个单位的β-半乳糖苷酶被定义为每个细胞每分钟水解
1umol ONPG为邻硝基苯酚和D-半乳糖所需要的量。
β-半乳糖苷酶活性单位 = 1000×OD420（t × V ×OD600）
t = 孵育过程中黄色消退的时间（min）
V = 0.1ml×浓度因子
OD600值 = 1 ml培养基的OD600值
注意：这里的终浓度因子是5（第七步），然而可以试用几个不同的稀释度以确保分析位于线性范围内。
◆ 为了减少实验的变异性，需挑5个单独的克隆，每个克隆进行3次试验。