高效液相色谱-质谱联用法检测

第40卷2012年10月

分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告ChineseJournalofAnalyticalChemistry

第10期1573~1578

:/DOI10.3724SP.J.1096.2012.11135

高效液相色谱质谱联用法检测-免疫抑制剂及其合并用药

李鹏飞1 王燕2 张征1 童卫杭2 吴华1 马萍2 王静2 刘丽宏*

(北京朝阳医院药事部,北京100043)第二炮兵总医院药剂科,北京100088) (

摘要建立高效液相色谱质谱联用法同时测定人血浆中免疫抑制剂及合并用药12种药物浓度的方法。选用-,KromasilC18色谱柱(50mm×4.6mm×5mm)以甲醇乙腈1mmol/L乙酸铵溶液为流动相,采用梯度洗脱进行分---离,样本用甲醇沉淀蛋白后进样,流速:1.1mL/min;柱温:35℃;进样量:20mL。选用3200QTrap型液相色谱串联-准确度与精密度结果显示方法日间、日内RSD均小于15%;相对偏差-13%~9.33%,稳定性较好。本方法快速、灵敏,专属性强、重现性好,可用于人体血浆中免疫抑制剂及其常用合并用药共12种药物浓度的测定。关键词高效液相色谱质谱联用法;免疫抑制剂;联合用药-

质谱仪的多反应监测(MRM)扫描方式进行检测。12种药物的线性范围为0.2~1000mg/L;定量下限为0.2mg/L。

1 引言

免疫抑制剂是一类通过抑制细胞及体液免疫反应,而使组织损伤得以减轻的化学或生物物质。目

前广泛应用于器官移植抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。常用的免疫抑制剂主要有:糖皮质激素、类(氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松、可的松、强地松等)微生物代谢产物(环孢菌素环孢菌素A(CsA)与他克莫司(FK506)在临床应用中需要进行治疗药物监测已是大家的共识,其测定值作为临床评价疗效及毒性反应的指标。以CsA和FK506为代表的第二代免疫抑制剂,为细胞因子合成抑制剂,主要作用是阻断免疫活性细胞的白细胞介素2的效应环节,干扰细胞活化,绝大部分分布于红细胞,血浆药物浓度与全血药物浓度不相关,临床需监测全血样本,国内外文献[2~5]和本实验室[6~9]已有多篇相关全血浓度监测方法的报道。糖皮质激素、抗代谢物和霉酚酸酯作为临床常用免疫抑制方案的成分,其血浆药物浓度与疗效和毒性有相关性,且与常用免疫抑制剂CsA和FK506在体内有协同或拮抗作用,已有文献提出需进行血药浓度监测[1]。此外,在其它合并用药中尼卡地平、非洛地平、地尔硫卓和奥美拉唑等对CsA和FK506均有协同作用。因此,本研究建立了血浆中糖皮质激素、抗代谢物、霉酚酸酯等常见免疫抑制剂及常见合并用药LCMS/MS同时定量检测方法,不仅能为进一步验证免疫抑制-剂与常用合并用药的相互作用提供方法支持,也为进一步深入开展个体化使用免疫抑制剂提供技术方法,从而更好地服务于临床。

、、、A、他克莫司、西罗莫司(雷帕霉素)依维莫司等)抗代谢物(硫唑嘌呤、6巯基嘌呤等)霉酚酸酯等[1]。-

2 实验部分

2.1 仪器与试药

,3200QTrap型液相色谱串联质谱仪(美国AppliedBiosystems公司)配有电喷雾离子化源(ESI)以-,及Analyst1.4.2数据处理软件;Agilent1100高效液相色谱系统(美国Agilent公司)包括四元输液泵、自动进样器、柱温箱、切换阀。

、、硫唑嘌呤(纯度99%,批号[1**********]1)6巯基嘌呤(纯度89.4%,批号[1**********]2)泼尼松---(、、纯度99%,批号[1**********]1)泼尼松龙(纯度99%,批号[1**********]3)甲基泼尼松龙(纯度99%,--1009收稿;20120503接受 2011----本文系首都医学发展科研基金(No.20071016)资助-*Email:[email protected]

、、批号[1**********])氢化可的松(纯度99%,批号[1**********]6)地塞米松(纯度99.6%,批号100129---

1574

分析化学第40卷

、、、200804)奥美拉唑(纯度99%,批号[1**********]2)地尔硫卓(纯度99%,批号[1**********]3)尼卡地--、平(纯度99.4%,批号[1**********]1)非洛地平(纯度99%,批号[1**********]1)的对照品均购自中国药--批号M060601)内标购自广州清平制药有限公司;甲醇、乙腈为色谱纯,其它试剂均为分析纯,空白人血浆由第二炮兵总医院提供。

质谱条件2.2 色谱-;KromasilC18柱(50mm×4.6mm×5mm)流动相:甲醇乙腈1mmol/L乙酸铵溶液,梯度洗脱(梯度---;条件见表1)流速:1.1mL/min;柱温:35℃;进样量:20mL。

表1 梯度条件

Table1 Conditionsofgradientelution

时间Time(min)0.000.100.801.201.50

乙腈

Acetonitrile(%)

00103072

1mmol/L乙酸铵

Ammoniumacetate

(%)

909020108

甲醇

Methanol(%)1010706020

时间

Time(min)3.504.904.917.00

乙腈

Acetonitrile(%)

767600

1mmol/L乙酸铵

Ammoniumacetate

(%)

449090

甲醇

Methanol(%)20201010

品生物制品检定所;霉酚酸对照品(纯度98%,批号028K2572)购自Sigma公司;替米沙坦(纯度为99.8%,

正离子化模式;离子喷射电压:5.5kV;温度:570℃;源内气体1(GS1,N2)压力: 电喷雾离子化源,

;310kPa;气体2(GS2,N2)压力:331kPa;气帘气体(N2)压力:138kPa;扫描方式为多反应监测(MRM)碰;撞气(N2)压力:中等(Medium)各药物及内标替米沙坦的定量离子对及主要质谱参数见表2。

表2 质谱参数

Table2 MSparameters

编号No.[**************]13

化合物Compund

6巯基嘌呤6Mercaptopurine--硫唑嘌呤Azathioprine霉酚酸Mycophenolicacid奥美拉唑Omeprazol泼尼松Prednisone泼尼松龙Prednisolone氢化可的松Hydrocortisone甲泼尼龙Methylprednisolone

非洛地平Felodipine地塞米松Dexamethasone地尔硫卓Dilthiazem尼卡地平Nicardipine替米沙坦Telmisartan

153.2>92.0

离子对

Ionpair(/mz)碰撞能量

Collisionenergy

(eV)

43321518

锥孔电压

Conevoltage

(V)

[***********][***********][1**********]535

153.2>119.1*278.2>142.2

278.2>232.2321.3>207.2321.3>303.3346.4>136.3359.2>147.2359.2>313.2361.3>147.2363.3>121.1363.3>327.3375.3>161.2

[***********][***********]803250

346.4>198.2*

361.3>325.3*

375.3>339.4*384.2>338.2384.2>352.2*393.3>237.2393.3>355.2415.3>150.2415.3>178.2480.4>91.2480.4>315.2

。Quantificationionpair) *定量离子对(

515.1>276.1*

第10期

李鹏飞等:高效效液相色谱质谱联用法免疫抑制剂及其合并用药检测- 1575

2.3 血浆样本处理

移取血浆样本100mL于1.5mLEP管中,加入含内标的甲醇溶液300mL,涡旋30s、离心5min

3 结果与讨论

(,13200r/min)取上清液,进样20mL。

3.1 免疫抑制剂及常见合并用药选择

免疫抑制剂及常见合并用药主要是根据临床血药浓度监测需求确定的,合并用药主要针对常见并发症中合并用药对免疫抑制剂浓度有影响的药物。以CsA和FK506为代表的第二代免疫抑制剂需监测全血药物浓度,与其它免疫抑制剂及常见合并用药在前处理方法上不兼容,且有多篇报道,因而未再进行CsA和FK506方法探索。霉酚酸酯和可的松均属于前药,本研究针对临床有活性的霉酚酸和氢化可的松进行定量检测方法的开发。强的松在临床上已很少使用,生物制剂多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体(如抗淋巴细胞球蛋白和OKT3等)和烷化剂类(如环磷酰胺等)不适宜进行LCMS/MS测定。-3.2 质谱和色谱条件的优化

/用甲醇乙腈(1将各药物的储备液分别稀释成10mg/L的溶液,用蠕动泵模式进样,首先进-∶1,VV)行Q1全扫描(Fullscan)采集信号,得到一级质谱图;然后依次将母离子经过电子碰撞后击碎,对目标化合物的母离子进行子离子扫描,得出子离子质谱图,确定子离子,相应的二级全扫描质谱图见图1。实验过程中对每种药物均选用正、负两种离子模式进行实验,结果表明,只有霉酚酸负离子模式优于正离子模式,其它药物均为正离子模式优于负离子模式,综合12种药物最终选用正离子模式。在所有药物中,由于非洛地平含有两个氯原子,同位素峰特别明显。

对色谱柱、流动相、梯度、柱温、进样量进行了考察。分别选用长度为15和5cm的色谱柱进行实验,由于实验要同时检测12种药物,所用时间较长,为了节省时间,本研究选用5cm短柱。对于流动相,水相分别考察了乙酸铵、0.1%甲酸及二者的混合溶液,其中乙酸铵浓度分别考察了1,2和5mmol/L,水相最终选用1mmol/L乙酸铵;有机相分别考察了甲醇及乙腈,实验表明,前半部分出峰的药物在甲醇中出峰较好,后半部分在乙腈中出峰较好,最终确定了一个有机相先高甲醇后高乙腈的7min的梯度。柱温分别考察了20,25,3035,40,45和50℃,综合考虑12种药物公离效果,最终选用35℃。进样量最终确定为20mL。典型的离子流图见图2。

3.3 生物样本前处理方法的优化和内标的选择

实验过程中分别尝试了固相萃取法、液液萃取法、蛋白沉淀法3种前处理方法。由于硫唑嘌呤和-6巯基嘌呤的极性较大,在SPE柱上保留较差,故未采用固相萃取法。同时,由于在12种药物中,有些-药物极性较大,有些极性很小,极性相差太大,所以也不适宜用液液萃取进行生物样本前处理。本实验-选用蛋白沉淀法,此方法中药物不需要进行转移,过程简单、快速。对比甲醇、乙腈作为沉淀试剂的检测结果,选用甲醇作为沉淀剂。沉淀蛋白回收率不足100%,尤其是6巯基嘌呤、硫唑嘌呤和霉酚酸的回-收率较低,推测是在沉淀蛋白过程中与蛋白共沉淀造成的。但标准曲线和实际样本均采用平行处理,因而不会影响定量分析结果。实验中采用了梯度洗脱,所有化合物色谱峰均与溶剂前沿基线分离,没有明显的基质效应影响测定。选择替米沙坦作为内标,其在临床上极少与免疫抑制剂进行联合用药。精密度与准确度3.3 线性范围、

在空白血浆中加入7种浓度的混合标准溶液,配制标准曲线样本,进行样本前处理后,进行LCMS/-MS分析。每个浓度测定3个样本,连续3d,以血浆中待测物浓度(为横坐标,待测物与内标物的峰x)

面积比值(为纵坐标,用加权(最小二乘法进行回归运算,求得回归方程,即为标准曲线,回W=1/x)y)

归方程及线性范围结果见表3。制备低、中、高3个浓度的质量控制(QC)样本,每个浓度测定6个样本,连续测定3d。根据当日的标准曲线,计算QC样本的测得浓度,根据QC样本结果计算本法的准确度与精密度,结果显示,日间与日内的相对标准偏差均小于15.0%;相对偏差为-13.0%~9.3%,表明此方法的精密度和准确度均较高,重现性较好。

由于免标准曲线范围主要结合药代动力学研究文献报道和药品说明书中提供的相关信息确定的。

1576

分析化学第40卷

图1 6种药物的二级全扫描质谱图

Fig.1 Fullscanproductionspectrafor

drugs-

图2 LCMS/MS测定血浆中免疫抑制剂及合并用药的典型离子流图(编号见表2)-表3 线性回归结果和线性范围

Table3 Linearregressionresultsandlinearrange

编号No.[**************]

化合物Compound

6巯基嘌呤6Mercaptopurine--硫唑嘌呤Azathioprine奥美拉唑Omeprazol泼尼松Prednisone泼尼松龙Prednisolone氢化可的松Hydrocortisone甲泼尼龙Methylprednisolone非洛地平Felodipine地塞米松Dexamethasone地尔硫卓Dilthiazem尼卡地平Nicardipine霉酚酸Mycophenolicacid

Fig.2 Chromatogramsofimmunodepressantsandcombineddrugsinplasma(No.weresameasinTable2)

曲线方程

Linearequations

x+0.0000525y=0.000129

x-0.000687y=0.00111

x+0.00199y=0.00144

x+0.00689y=0.0137

x+0.00214y=0.00352

x+0.00183y=0.0014

x+0.1691y=0.87

x+0.00224y=0.00246

x+0.00283y=0.00204

x+0.00298y=0.00107x-0.0267y=0.102

x+0.0185y=0.0511

相关系数

Coefficientcorrelation(r)

0.99360.99580.99930.99750.99490.99550.99360.99790.99830.99790.99690.9994

线性范围

Linearrange(mg/L)

10~100010~100010~10001~1005~5000.2~205~5005~5005~500

2.5~2501~100

50~500

疫抑制剂临床上有效使用剂量差异较大,不同的适应症和不同个体剂量差异也较大。对于个别化合物,尽可能提高定量下限,如:霉酚酸酯、地塞米松等。对于临床大剂量使用时前处理前需进行10倍左右稀释处理即可,临床低剂量使用时也能监测到有效浓度。

3.4 提取回收率和基质效应

取空白血浆100mL,同标准曲线和质控样本操作,制备低、中、高3个浓度的质控样本,每个浓度测,定3个样本。同时另取空白血浆100mL,加入沉淀剂甲醇300mL,涡旋30s,离心5min(13200r/min)上

第10期

李鹏飞等:高效效液相色谱质谱联用法免疫抑制剂及其合并用药检测- 1577

清液以氮气吹干后,加入相应浓度的混合标准溶液和内标溶液,平行补加100mL重蒸水,涡流混匀后,进样20mL进行LCMS/MS分析,获得相应峰面积。以每一浓度两种处理方法的测得峰面积比值计算-提取回收率,结果表明,各药物高、中、低浓度的提取回收率结果一致。6巯基嘌呤、硫唑嘌呤和霉酚酸-的提取回收率平均为57.3%,52.0%和58.9%,其它化合物回收率平均值在70.4%~105.1%范围,回收率较为稳定。以水代替空白血浆,制备低、中、高浓度基质效应样本,每个浓度测定3个样本,用于考察各药物和内标的基质效应。结果表明,只有内源性氢化可的松存在基质效应。

3.5 稳定性考察

、分别进行了3种贮存条件(长期稳定性(冰冻放置20d)3次冻融和室温放置12h)下稳定性的考察。将稳定放置和冻融后的测定结果与理论浓度进行比较,结果表明,所有稳定性实验中测定值与添加值的相对偏差(RE)均小于15%;长期冰冻放置血浆样本,血浆样本反复冻融,以及分析测试过程中样本较为稳定,各种贮存条件不影响本方法对样本浓度进行准确测定。

3.6 方法学应用

用建立的检测方法对192个肾移植患者全血样进行检测,检出结果见表4,检出样本与实际服用药物样本基本相符,可知本方法准确度较高,可应用于临床。

表4 肾移植患者全血样本192例检测结果

Table4 Detectionresultofwholebloodsamplesforkidneytransplantpatients

编号No.3456781012

检出药物Detecteddrug

检出例数

Amountofdetection

[**************]4

霉酚酸Mycophenolicacid奥美拉唑Omeprazol泼尼松Prednisone泼尼松龙Prednisolone氢化可的松Hydrocortisone甲泼尼龙Methylprednisolone地塞米松Dexamethasone尼卡地平Nicardipine

样本总例数Amount

[***********]192192

检出率Detectionrate(%)

90.61.63.119.390.10.562.043.8

关于它的定量内标多采用同位素内标或鲁米那、地氢化可的松是人体内主要的内源性糖皮质激素,

塞米松、皮质酮、莫沙必利等。本研究选用的是稳定性较好且质谱响应较高的替米沙坦作为内标。由于氢化可的松是内源性物质,定量分析时采用先扣除空白血浆中氢化可的松的浓度(平行测量20份空白血浆取平均值)的方法,对实际样本进r=0.9936;行定量分析发现,多数样本浓度为零,即用药后患者体内浓度变化很小。为了排除内源性氢化可的松的影响,秦永平等[10]用牛血清代替人血清作标准曲线,但这样不能保证实验中基质的一致性,可能会造成检测误差。

cophenolicacid,MPA)的酯类前体药物,临床上广它免疫抑制剂药物联用。MMF在体内水解为活性代谢产物霉酚酸(MPA)而起作用。在对实际生

霉酚酸酯(MMF)是免疫抑制剂霉酚酸(My-Fig.3 Chromatogramsofmycophenolicacidinstandardsam-ple(a)andorganismsample(b)

图3 霉酚酸标准样本(a)与实际样本(b)色谱图泛用于预防和治疗器官移植的排斥反应,多与其

,物样本174例检测过程中发现,在霉酚酸正常出峰的前面有一个响应更高的峰(图3)可能为霉酚酸与葡萄糖醛酸的代谢物,推测霉酚酸葡糖苷酸在进行离子化的时候被打碎为霉酚酸。但由于其极性比霉酚酸大,故在色谱图上出现一前一后两个峰。

密度与准确性、标准曲线与线性范围、提取回收率及基质效应及稳定性实验的考察,结果符合进行体内药代实验的标准,可以应用于临床免疫抑制剂及其合并用药的血药浓度定量检测。

本研究建立了同时检测免疫抑制剂及其常用合并用药的LCMS/MS方法,并对其进行了专属性、精-

1578

分析化学第40卷

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DeterminationofImmunoderessantsandCombinedDrusbpgy

LiuidChromatorah-TandemMassSectrometrqgpypy

12121

,WAN,,LIPenFeiGYanZHANGZhenTONGWeiHanuagg,g,WUH--1

22*1

MAPinGJinLIULiHong,WANg,g-

(PharmaceartmentoheSecondArtillereneralHosital,Beiin00088,China)yDpftyGpjg1

(Pharmaceartmentoeiinhao-Yanosital,Beiin00043,China)yDpfBjgCgHpjg1

immunoderessantsandotherdrusinhumanplasma.Thedrusandtheinternalstandardwerepgg

,atreatedbethanolpreciitationtoremoveproteincomonentfromhumanplasmandthenympp//flowratewas1.1mLminand20mLaliuotofresidueswasinectedintotheLC-MSMSsstem.qjy

/Detectionwascarriedoutbultilereactionmonitorinna3200QTraC-MSMSsstem.TheympgopLyIntrandinterdarecisionswerebothlessthan15%.Therelativedeviationwasintheraneofypg-a-,,-13%-9.33%.Thestabilitiesofthemethodweregood.Itisaraidsensitiveselectiveandreliablephumanplasma.Theassaanbealiedforthedeterminationofthesedrusinhumanplasma.ycppg

;;Kewords LiuidchromatorahtandemmasssectrometrImmunoderessantsDruombinationqgpypypgcymethodforthedeterminationofthedruswhichcontainimmunoderessantsandotherdrusingpg//assaaslinearovertheraneof0.2-1000mgLwithalowerlimitofquantitationof0.2mgL.ywgsearatedonaKromasilColumn(5mm,50mm×4.6mm)withagradientelution.Themobilep18c-/haseconsistedofmethanolacetonitrile1mmolLammoniumacetatewasmaintainedat35℃.Thep--

/Abstract ThisstudimstodevelonLC-MSMSmethodforthedeterminationofdruscontainedyapag

()Received9October2011;acceted3Ma012py2

第40卷2012年10月

分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告ChineseJournalofAnalyticalChemistry

第10期1573~1578

:/DOI10.3724SP.J.1096.2012.11135

高效液相色谱质谱联用法检测-免疫抑制剂及其合并用药

李鹏飞1 王燕2 张征1 童卫杭2 吴华1 马萍2 王静2 刘丽宏*

(北京朝阳医院药事部,北京100043)第二炮兵总医院药剂科,北京100088) (

质谱仪的多反应监测(MRM)扫描方式进行检测。12种药物的线性范围为0.2~1000mg/L;定量下限为0.2mg/L。

1 引言

免疫抑制剂是一类通过抑制细胞及体液免疫反应,而使组织损伤得以减轻的化学或生物物质。目

、、、A、他克莫司、西罗莫司(雷帕霉素)依维莫司等)抗代谢物(硫唑嘌呤、6巯基嘌呤等)霉酚酸酯等[1]。-

2 实验部分

2.1 仪器与试药

、、批号[1**********])氢化可的松(纯度99%,批号[1**********]6)地塞米松(纯度99.6%,批号100129---

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分析化学第40卷

质谱条件2.2 色谱-;KromasilC18柱(50mm×4.6mm×5mm)流动相:甲醇乙腈1mmol/L乙酸铵溶液,梯度洗脱(梯度---;条件见表1)流速:1.1mL/min;柱温:35℃;进样量:20mL。

表1 梯度条件

Table1 Conditionsofgradientelution

时间Time(min)0.000.100.801.201.50

乙腈

Acetonitrile(%)

00103072

1mmol/L乙酸铵

Ammoniumacetate

(%)

909020108

甲醇

Methanol(%)1010706020

时间

Time(min)3.504.904.917.00

乙腈

Acetonitrile(%)

767600

1mmol/L乙酸铵

Ammoniumacetate

(%)

449090

甲醇

Methanol(%)20201010

品生物制品检定所;霉酚酸对照品(纯度98%,批号028K2572)购自Sigma公司;替米沙坦(纯度为99.8%,

正离子化模式;离子喷射电压:5.5kV;温度:570℃;源内气体1(GS1,N2)压力: 电喷雾离子化源,

表2 质谱参数

Table2 MSparameters

编号No.[**************]13

化合物Compund

非洛地平Felodipine地塞米松Dexamethasone地尔硫卓Dilthiazem尼卡地平Nicardipine替米沙坦Telmisartan

153.2>92.0

离子对

Ionpair(/mz)碰撞能量

Collisionenergy

(eV)

43321518

锥孔电压

Conevoltage

(V)

[***********][***********][1**********]535

153.2>119.1*278.2>142.2

278.2>232.2321.3>207.2321.3>303.3346.4>136.3359.2>147.2359.2>313.2361.3>147.2363.3>121.1363.3>327.3375.3>161.2

[***********][***********]803250

346.4>198.2*

361.3>325.3*

375.3>339.4*384.2>338.2384.2>352.2*393.3>237.2393.3>355.2415.3>150.2415.3>178.2480.4>91.2480.4>315.2

。Quantificationionpair) *定量离子对(

515.1>276.1*

第10期

李鹏飞等:高效效液相色谱质谱联用法免疫抑制剂及其合并用药检测- 1575

2.3 血浆样本处理

移取血浆样本100mL于1.5mLEP管中,加入含内标的甲醇溶液300mL,涡旋30s、离心5min

3 结果与讨论

(,13200r/min)取上清液,进样20mL。

3.1 免疫抑制剂及常见合并用药选择

3.3 生物样本前处理方法的优化和内标的选择

面积比值(为纵坐标,用加权(最小二乘法进行回归运算,求得回归方程,即为标准曲线,回W=1/x)y)

由于免标准曲线范围主要结合药代动力学研究文献报道和药品说明书中提供的相关信息确定的。

1576

分析化学第40卷

图1 6种药物的二级全扫描质谱图

Fig.1 Fullscanproductionspectrafor

drugs-

图2 LCMS/MS测定血浆中免疫抑制剂及合并用药的典型离子流图(编号见表2)-表3 线性回归结果和线性范围

Table3 Linearregressionresultsandlinearrange

编号No.[**************]

化合物Compound

Fig.2 Chromatogramsofimmunodepressantsandcombineddrugsinplasma(No.weresameasinTable2)

曲线方程

Linearequations

x+0.0000525y=0.000129

x-0.000687y=0.00111

x+0.00199y=0.00144

x+0.00689y=0.0137

x+0.00214y=0.00352

x+0.00183y=0.0014

x+0.1691y=0.87

x+0.00224y=0.00246

x+0.00283y=0.00204

x+0.00298y=0.00107x-0.0267y=0.102

x+0.0185y=0.0511

高效液相色谱-质谱联用法检测

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