福建林学院学报 1999, 19(3) :270～272Journ al of Fujian College of Forestry
粉拟青霉的一种选择培养基
张文勤
(福建省尤溪县森防检疫站 365100)
摘要 300mg /L 硫酸铬铵铜、4mg /L 代森锌、1800mg /L 硫酸铜、1000mg /LKMnO 4、100mg /5000mg /L 氯霉素、L 结晶紫、pH 自然组成的化学抑制剂配方能够有效地抑制土壤杂菌的生长而高频地获得粉拟青霉, 获得率可达40%左右. Y =2. 17X +2的线性表明平皿的粉拟青霉孢子回收数(X ) 可较为客观地反映林地土壤该菌的种群数量(Y ) . 关键词 粉拟青霉; 选择培养基中图分类号 S154. 3
虫生真菌在土壤及其栖息生境中种群动态的了解, 是流行病监测, 预测预报以及有效地组织生物防治的重要前提. 近年, 昆虫种群动态的研究日益受到重视. Ig noffo 关于菜氏野村菌种群动态的研究成功地用于粉纹夜蛾的防治, 绿僵菌在土壤中数量的变化直接影响了地下害虫的控制效果方, 达到抑制土壤细菌及快速生长的腐生真菌, 如白僵菌, 绿僵菌的选择培养基
〔4. 5〕
〔1〕
〔2. 3〕
. 而这种种群
动态卓有成效的方法是化学选择培养基的应用. 欧美的研究工作通常是由复杂多样的杀菌物质组成配
.
粉拟青霉经初步实验测定:该菌生长的pH 2. 5, 低温生长的下限为5℃左右, 这些生态条件和土壤腐生真菌(如毛霉、曲霉、青霉、木霉等) 均较为一致, 选择效果不佳. 从营养组份考虑, 粉拟青霉具较强的腐生性, 营养要求不高且基本趋回于土壤腐生真菌.
1 材料与方法
1. 1 不同杀虫剂对粉拟青霉生长抑制的浓度下限
在PDA 培养基中, 分别加入2. 0%、4. 0%、6. 0%、8. 0%的硫酸铜; 0. 1%、0. 5%、1. 0%、1. 5%、2. 0%的硫酸铬铵铜; 0. 5%、1. 0%、1. 5%、2. 0%KM nO 4; 100mg /L 、150mg /L 、200mg /L 、250m g /L 、
300mg /L 的代森锌; 1. 0%、1. 5%、2. 0%、2. 5%的敌克松, pH 2. 0、pH 2. 5、pH 3. 0、pH 3. 5. 20℃恒温培养观察, 确定抑制生长的最低浓度. 1. 2 杀菌剂配比
选择培养基的组合及筛选, 依据各杀菌剂抑制粉拟青霉的最低浓度, 加入林地土壤菌悬液, 摇匀凝固, 于20℃恒温培养, 检查杂菌生长类群, 同时另设对照组. 根据杂菌生长状况, 对各杀菌剂在抑制粉拟青霉最低浓度下限范围进行不同杀菌的不同浓度配比组合, 同时加入100mg /L 结晶紫、5000m g/L 氯霉素以抑制细菌生长.
1. 3 配制方法
在121℃, 15m in 灭菌的PDA 培养基中, 加入不同配比的杀菌剂(分消8磅15min ) , 加入结晶紫和氯霉素. 在预加入1ml 混有不同浓度的粉拟青霉孢子和1g 土壤悬液的平皿中倒入待凝的选择培养基9ml , 凝固后20℃恒温培养, 10d 后检查分离结果. 同时另设一组PPA 基+土壤菌悬液(CK 混) ; PDA +粉拟青霉孢子液(CK 纯) 为对照.
2 结果和分析
2. 1 化学杀菌剂的初筛
初筛应该达到2个目的:即在一定浓度下(粉拟青霉生长抑制浓度下限) , 不抑制病原真菌的生长,
第3期 张文勤:粉拟青霉的一种选择培养基
271
同时对土壤腐生真菌的一种或多种有明显的抑制效果. 初筛的结果于表1.
土壤中马尾松林地快速生长的腐生真菌主要集中于曲霉、青霉、木霉、毛霉等属. 表1表明:所用的不同杀菌剂的不同浓度均可一定程度地抑制土壤真菌生长. 如硫酸铜类, 可抑制木霉、毛霉生长, 敌克松则可抑制青霉和曲霉生长. 考虑到各杀菌剂的交互作用及pH 调控, 我们匹配了如下4种组合(表2) , 用于粉拟青霉的筛选试验.
表1 杀菌剂对土壤真菌的选择作用
TABLE 1 T he effect s elected of ster ilization on soil fungu s
表2 各杀菌剂组合表 /mg ・L -1
TABLE 2 Th e compos ition of d ifferent ster ilization
粉拟青霉生长
土壤真菌生长类型的最低浓度
CuSO 4. 5H 2O 6%曲霉、青霉(少量) 硫酸铬铵铜1. 0%青霉、曲霉(少量) KM nO 42. 0%无孢菌群、木霉、青霉、根霉
-1
代森锌200mg ・L 曲霉、青霉敌克松2%毛霉、木霉CK 曲霉、青霉、毛霉、木霉无孢菌群杀菌剂
配合硫酸铬
序号铵铜代森锌硫酸铜KM NO 4敌克松pH A B C D
[1**********]0
8480
[1**********]0
10001000
0600
0自然0自然0自然500
2. 5
2. 2 选择培养结果
在以PDA 为基本培养常规121℃灭菌后, 分别加入分消的杀真剂和杀细菌剂(无菌水配制后直接加入) . 采集不同立地条件的马尾松林土壤, 混入纯培养的不同浓度孢子悬浮液1m l , 经平皿倾注分离, 结果于表3
实验证明:不同组合的选择培养基抑制杂菌效果相差很大. A 组配方浓度过高, 粉拟青霉和杂菌均不生长; C 、D 两组配方难以抑制多数土壤杂菌生长, 培养3d 后杂菌就大量生长, 从而抑制了粉
序 号A B C D CK 纯CK 混
0100*0*201*
出现菌落数50个/ml 091*2*
090*0*140*
0205*0*532*
表3 不同组合的选择培养基选择结果
T ABLE 3 T he effect selected of different com bination of s elective culture m edium T ab le
出现菌落数100个/ml 0181*3*
0230*0*290*
0260*10*721*
出现菌落数150个/ml 0306*0*
0331*4*682*
05216*2*1400*
出现菌落数200个/ml 0602*18*
0736*5*1305*
(a ) 血球计数板测得结果 (b ) *表示杂菌很多
(c ) C K 纯:添加粉拟青霉纯培养液(d ) Ck 混:添加土壤菌悬液和粉拟青霉孢子液
拟青霉的生长, 故选择效果不理想, B 组合是较为理想的选择培养基, 能够有效地抑制杂菌生长且拟青霉
有较高的分离频率. 该组合平皿通常5d 后才明显地长出菌落, 虽也有少量青霉和曲霉长出, 但菌落较小, 而粉拟青霉的菌落整齐, 明显可见. Dobeyski 曾在设计白僵菌的选择培养基中加入结晶紫, 除了抑制细菌外, 还赋于白僵菌菌落背面暗紫颜色从而达到快速鉴别作用, 在我们的粉拟青霉选择培养基中, 这种特点并不十分明显. 但利用菌落特征结合镜检, 仍可快速地检查出. 2. 3 选择培养基分离效果的稳定性 为检验B 组选择培养基的稳定性, 在3种不同立地的马尾松再次采样实验, 结果显示该选择培养基分离效果具有一定的稳定性见表4.
2. 4 林地孢子数量预测的数学模型
B B 选择基 8CK
17
平皿菌落数50个/ml 918
621
2041
表4 B 选择培养基选择分离效果检验
T ABLE 4 Th e test of separating effect for selective cultur e medium (B ) 序 号
平皿菌落数100个/ml 2035
平皿菌落数150个/ml
平皿菌落数200个/ml
17 35 24 28 71 70 5738
70
65
74
150
122
166
*:表中数字为3次重复平均值
272
福 建 林 学 院 学 报 第19卷
霉数量. 由表4可见, 随着CK 组分离的实际孢子数量增加, 在林地20～200个/m l 孢子的范围内, 可以通过简单的线性方程回归, 从而依据选择培养分离到的频率推测林间土壤的实际孢子数. 用表3～4的数据进行回归, 得Y =2. 17X +2(Y:林地孢子数; X:平皿所测孢子数) , 经方差分析〔Fa1(1, 6) =3. 78, F=4. 1〕, 表明该方程在实际应用中基本可靠.
3 小结
研究所获得B 组选择培养基有较高的选择性和粉拟青霉的分离频率. 在林地土壤中, 每毫升土壤菌悬液粉拟青霉数0～200个范围内, 获得率可达40%, 效果较为理想. 美国爱荷达大学Heck 设计的分离
6〕
白僵菌选择培养基, 据报道获得白僵菌可达50%〔以上. 由于粉拟青霉种群庞大(Sam son 系统(1974年) 中记载31种) , 同时有相当部分腐生于土壤中, 评价粉拟青霉在实际土壤原种群的监测价值, 还得进一步验证.
白僵菌、绿僵菌的选择培养基筛选国内外已有较为成功的报道, 实践表明, 从化学杀菌剂的配组进行的选择培养基的筛选, 对于粉拟青霉的分离是较为可行的有效方法, 将有助于林间流行病研究的深入.
本研究得到厦门大学黄耀坚副教授指导及审阅文稿, 特此致谢.
参 考 文 献
1 I gnoffo , CM. J. I nv ert. P athol. 1977, 29:147～1522 R ath , A C . J . Inv er t , Patho l , 1985, 45:81～93
3 St or ey CK , v fh , Iccp , Adelaride Collog uium 1990. 326～3304 V een, K H. j. Inv ert. Pat ho l, 1966, 8:268～269
5 D oberski, JM , T rans. Br. M y co l, So c, 1980, 74:95～1006 L ing g , A L , J , Inver t , P athol , 1988, 38:191～200
A Selective Culture Medium of Paecilom yles Farinosus
Zhang Wenqin
(The Forest Dis ease &Ins ect Pes t Control and Quar antine S tation of Youxi County, Fujian 365100)
ABSTRCT A select ive cultur e medium could hig h-fr equently ret rieve P . Far inosus , and effectiv ely contr ol the gr ow th of soil fung us . T he o btaining r ate o f P . Farinosus had amo unt ed t o 40%.T he linear equatio n (y =2. 17x +2) also indicated that t he amo unt of spo r es r et rieved o f P . Far inosus in cult ur e dish (x ) could objectively r epr esent the po pulatio n density of the fung us in the for est soil (y ) .
KEY WORDS P . Far inosus , selectiv e culture medium
福建林学院学报 1999, 19(3) :270～272Journ al of Fujian College of Forestry
粉拟青霉的一种选择培养基
张文勤
(福建省尤溪县森防检疫站 365100)
摘要 300mg /L 硫酸铬铵铜、4mg /L 代森锌、1800mg /L 硫酸铜、1000mg /LKMnO 4、100mg /5000mg /L 氯霉素、L 结晶紫、pH 自然组成的化学抑制剂配方能够有效地抑制土壤杂菌的生长而高频地获得粉拟青霉, 获得率可达40%左右. Y =2. 17X +2的线性表明平皿的粉拟青霉孢子回收数(X ) 可较为客观地反映林地土壤该菌的种群数量(Y ) . 关键词 粉拟青霉; 选择培养基中图分类号 S154. 3
虫生真菌在土壤及其栖息生境中种群动态的了解, 是流行病监测, 预测预报以及有效地组织生物防治的重要前提. 近年, 昆虫种群动态的研究日益受到重视. Ig noffo 关于菜氏野村菌种群动态的研究成功地用于粉纹夜蛾的防治, 绿僵菌在土壤中数量的变化直接影响了地下害虫的控制效果方, 达到抑制土壤细菌及快速生长的腐生真菌, 如白僵菌, 绿僵菌的选择培养基
〔4. 5〕
〔1〕
〔2. 3〕
. 而这种种群
动态卓有成效的方法是化学选择培养基的应用. 欧美的研究工作通常是由复杂多样的杀菌物质组成配
.
粉拟青霉经初步实验测定:该菌生长的pH 2. 5, 低温生长的下限为5℃左右, 这些生态条件和土壤腐生真菌(如毛霉、曲霉、青霉、木霉等) 均较为一致, 选择效果不佳. 从营养组份考虑, 粉拟青霉具较强的腐生性, 营养要求不高且基本趋回于土壤腐生真菌.
1 材料与方法
1. 1 不同杀虫剂对粉拟青霉生长抑制的浓度下限
在PDA 培养基中, 分别加入2. 0%、4. 0%、6. 0%、8. 0%的硫酸铜; 0. 1%、0. 5%、1. 0%、1. 5%、2. 0%的硫酸铬铵铜; 0. 5%、1. 0%、1. 5%、2. 0%KM nO 4; 100mg /L 、150mg /L 、200mg /L 、250m g /L 、
300mg /L 的代森锌; 1. 0%、1. 5%、2. 0%、2. 5%的敌克松, pH 2. 0、pH 2. 5、pH 3. 0、pH 3. 5. 20℃恒温培养观察, 确定抑制生长的最低浓度. 1. 2 杀菌剂配比
选择培养基的组合及筛选, 依据各杀菌剂抑制粉拟青霉的最低浓度, 加入林地土壤菌悬液, 摇匀凝固, 于20℃恒温培养, 检查杂菌生长类群, 同时另设对照组. 根据杂菌生长状况, 对各杀菌剂在抑制粉拟青霉最低浓度下限范围进行不同杀菌的不同浓度配比组合, 同时加入100mg /L 结晶紫、5000m g/L 氯霉素以抑制细菌生长.
1. 3 配制方法
在121℃, 15m in 灭菌的PDA 培养基中, 加入不同配比的杀菌剂(分消8磅15min ) , 加入结晶紫和氯霉素. 在预加入1ml 混有不同浓度的粉拟青霉孢子和1g 土壤悬液的平皿中倒入待凝的选择培养基9ml , 凝固后20℃恒温培养, 10d 后检查分离结果. 同时另设一组PPA 基+土壤菌悬液(CK 混) ; PDA +粉拟青霉孢子液(CK 纯) 为对照.
2 结果和分析
2. 1 化学杀菌剂的初筛
初筛应该达到2个目的:即在一定浓度下(粉拟青霉生长抑制浓度下限) , 不抑制病原真菌的生长,
第3期 张文勤:粉拟青霉的一种选择培养基
271
同时对土壤腐生真菌的一种或多种有明显的抑制效果. 初筛的结果于表1.
土壤中马尾松林地快速生长的腐生真菌主要集中于曲霉、青霉、木霉、毛霉等属. 表1表明:所用的不同杀菌剂的不同浓度均可一定程度地抑制土壤真菌生长. 如硫酸铜类, 可抑制木霉、毛霉生长, 敌克松则可抑制青霉和曲霉生长. 考虑到各杀菌剂的交互作用及pH 调控, 我们匹配了如下4种组合(表2) , 用于粉拟青霉的筛选试验.
表1 杀菌剂对土壤真菌的选择作用
TABLE 1 T he effect s elected of ster ilization on soil fungu s
表2 各杀菌剂组合表 /mg ・L -1
TABLE 2 Th e compos ition of d ifferent ster ilization
粉拟青霉生长
土壤真菌生长类型的最低浓度
CuSO 4. 5H 2O 6%曲霉、青霉(少量) 硫酸铬铵铜1. 0%青霉、曲霉(少量) KM nO 42. 0%无孢菌群、木霉、青霉、根霉
-1
代森锌200mg ・L 曲霉、青霉敌克松2%毛霉、木霉CK 曲霉、青霉、毛霉、木霉无孢菌群杀菌剂
配合硫酸铬
序号铵铜代森锌硫酸铜KM NO 4敌克松pH A B C D
[1**********]0
8480
[1**********]0
10001000
0600
0自然0自然0自然500
2. 5
2. 2 选择培养结果
在以PDA 为基本培养常规121℃灭菌后, 分别加入分消的杀真剂和杀细菌剂(无菌水配制后直接加入) . 采集不同立地条件的马尾松林土壤, 混入纯培养的不同浓度孢子悬浮液1m l , 经平皿倾注分离, 结果于表3
实验证明:不同组合的选择培养基抑制杂菌效果相差很大. A 组配方浓度过高, 粉拟青霉和杂菌均不生长; C 、D 两组配方难以抑制多数土壤杂菌生长, 培养3d 后杂菌就大量生长, 从而抑制了粉
序 号A B C D CK 纯CK 混
0100*0*201*
出现菌落数50个/ml 091*2*
090*0*140*
0205*0*532*
表3 不同组合的选择培养基选择结果
T ABLE 3 T he effect selected of different com bination of s elective culture m edium T ab le
出现菌落数100个/ml 0181*3*
0230*0*290*
0260*10*721*
出现菌落数150个/ml 0306*0*
0331*4*682*
05216*2*1400*
出现菌落数200个/ml 0602*18*
0736*5*1305*
(a ) 血球计数板测得结果 (b ) *表示杂菌很多
(c ) C K 纯:添加粉拟青霉纯培养液(d ) Ck 混:添加土壤菌悬液和粉拟青霉孢子液
拟青霉的生长, 故选择效果不理想, B 组合是较为理想的选择培养基, 能够有效地抑制杂菌生长且拟青霉
有较高的分离频率. 该组合平皿通常5d 后才明显地长出菌落, 虽也有少量青霉和曲霉长出, 但菌落较小, 而粉拟青霉的菌落整齐, 明显可见. Dobeyski 曾在设计白僵菌的选择培养基中加入结晶紫, 除了抑制细菌外, 还赋于白僵菌菌落背面暗紫颜色从而达到快速鉴别作用, 在我们的粉拟青霉选择培养基中, 这种特点并不十分明显. 但利用菌落特征结合镜检, 仍可快速地检查出. 2. 3 选择培养基分离效果的稳定性 为检验B 组选择培养基的稳定性, 在3种不同立地的马尾松再次采样实验, 结果显示该选择培养基分离效果具有一定的稳定性见表4.
2. 4 林地孢子数量预测的数学模型
B B 选择基 8CK
17
平皿菌落数50个/ml 918
621
2041
表4 B 选择培养基选择分离效果检验
T ABLE 4 Th e test of separating effect for selective cultur e medium (B ) 序 号
平皿菌落数100个/ml 2035
平皿菌落数150个/ml
平皿菌落数200个/ml
17 35 24 28 71 70 5738
70
65
74
150
122
166
*:表中数字为3次重复平均值
272
福 建 林 学 院 学 报 第19卷
霉数量. 由表4可见, 随着CK 组分离的实际孢子数量增加, 在林地20～200个/m l 孢子的范围内, 可以通过简单的线性方程回归, 从而依据选择培养分离到的频率推测林间土壤的实际孢子数. 用表3～4的数据进行回归, 得Y =2. 17X +2(Y:林地孢子数; X:平皿所测孢子数) , 经方差分析〔Fa1(1, 6) =3. 78, F=4. 1〕, 表明该方程在实际应用中基本可靠.
3 小结
研究所获得B 组选择培养基有较高的选择性和粉拟青霉的分离频率. 在林地土壤中, 每毫升土壤菌悬液粉拟青霉数0～200个范围内, 获得率可达40%, 效果较为理想. 美国爱荷达大学Heck 设计的分离
6〕
白僵菌选择培养基, 据报道获得白僵菌可达50%〔以上. 由于粉拟青霉种群庞大(Sam son 系统(1974年) 中记载31种) , 同时有相当部分腐生于土壤中, 评价粉拟青霉在实际土壤原种群的监测价值, 还得进一步验证.
白僵菌、绿僵菌的选择培养基筛选国内外已有较为成功的报道, 实践表明, 从化学杀菌剂的配组进行的选择培养基的筛选, 对于粉拟青霉的分离是较为可行的有效方法, 将有助于林间流行病研究的深入.
本研究得到厦门大学黄耀坚副教授指导及审阅文稿, 特此致谢.
参 考 文 献
1 I gnoffo , CM. J. I nv ert. P athol. 1977, 29:147～1522 R ath , A C . J . Inv er t , Patho l , 1985, 45:81～93
3 St or ey CK , v fh , Iccp , Adelaride Collog uium 1990. 326～3304 V een, K H. j. Inv ert. Pat ho l, 1966, 8:268～269
5 D oberski, JM , T rans. Br. M y co l, So c, 1980, 74:95～1006 L ing g , A L , J , Inver t , P athol , 1988, 38:191～200
A Selective Culture Medium of Paecilom yles Farinosus
Zhang Wenqin
(The Forest Dis ease &Ins ect Pes t Control and Quar antine S tation of Youxi County, Fujian 365100)
ABSTRCT A select ive cultur e medium could hig h-fr equently ret rieve P . Far inosus , and effectiv ely contr ol the gr ow th of soil fung us . T he o btaining r ate o f P . Farinosus had amo unt ed t o 40%.T he linear equatio n (y =2. 17x +2) also indicated that t he amo unt of spo r es r et rieved o f P . Far inosus in cult ur e dish (x ) could objectively r epr esent the po pulatio n density of the fung us in the for est soil (y ) .
KEY WORDS P . Far inosus , selectiv e culture medium