家畜日本血吸虫检验技术规程
1 范围
本标准规定了家畜日本血吸虫病检验的粪样采集、血样采集、检验程序及结果判定等方面的要求。 本标准适用于我省家畜日本血吸虫病的诊断、监测、检疫及流行病学调查。
2 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
2.1 日本血吸虫病（Schistosomoiasis japonicum）
由分体科分体属的日本血吸虫寄生牛、马、猪、羊、犬、猫等几十种哺乳动物和人的门静脉和肠系膜静脉小血管内的一种人畜共患寄生虫病。
３ 粪样采集
采粪季节适合于春、秋两季，其次是夏季，不适于冬季。采粪时间最好于清晨从家畜直肠中采取，或新排出的未污染的粪便。采粪量：牛、马粪200 g，猪粪100 g，羊和狗粪40 g。每份粪样需附上填好的送粪卡。送粪卡应填上村、组名、饲养员或畜主姓名、畜别、性别、年龄及采粪日期。 4 血样采集
4.1 采血方法
4.1.1 颈静脉采血（用于牛、羊、马等家畜）
a ）器材：针头12号至18号，牛、马宜用16号针头最好，羊用12号针头为好，小试管（容量5ml ，10ml ）。均需按常规消毒。
b ）方法：将动物保定好，采血点选在颈静脉沟上三分之一处，剪毛消毒后，用左手拇指在采血点下方压紧，其余四指在右侧相应部位抵住，使上部颈静脉怒张，如怒张不明显，可用绳系住颈基部使静脉怒张，右手拇、食、中指拿着针头，对准颈静脉刺入，用试管接取2ml ～5ml 血即可。
4.1.2 耳静脉采血（用于猪、牛）
a ）器材：针头12号至16号，小试管（容量5ml~10ml），2ml ～5ml 注射器。均需消毒。
b ）方法：采猪血时，先用绳在耳根捆扎，也可由助手紧握耳根，使耳静脉充分怒张，用酒精棉消毒后，将针头刺入血管，流血后即用左手拇指按着针头，食、中二指托于耳的腹面，然后放松耳根按压处，用右手接上注射器，抽出血液2ml ，移入试管中。
采牛血时可由助手压住耳静脉根部，如上方法采血。
4.2 血清的分离与保存
血液进入小试管后应及时密闭管口，在20℃～37℃条件下放置1h 左右，然后置入0℃～10℃冰箱中10h 至3d ，血清便会自动渗出。如不急需进行检验，需将血清分离到另一灭菌试管或瓶中，置于冰箱中备用，在0℃～10℃冰箱中一般可保持14d ，在－20℃冰箱中，可保存3个月，保存时间越长，抗体效价越低。
亦可在20℃～37℃条件下放置1h 后，用（1500～2000）r ／分离心（5～10）min ，吸取上清液到另一灭菌试管或瓶中，置于冰箱中备用。
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5 粪便毛蚴孵化检查
5.1 材料准备
5.1.1 水
PH 值6.8～7.2，无水虫和化学物质污染（包括氯气）的澄清水，分别作如下处理：
a ）有氯气的自来水应在盛具中存放20h 以上；
b ）河水、池水、井水、雨水等混有水虫的水加温至60℃，冷后再用。或在每5万ml 水中加含30%有效氯漂白粉0.35g ，搅匀，存放20h ，待氯气逸尽；也可在放漂白粉后加入硫代硫酸钠0.2g ～0.4g 脱氯，30min 后用；
c ）浑浊水，每5万ml 水中加明矾3g ～5g ，充分搅拌待水澄清后用；
d ）高温季节用水处理，水温高时，毛蚴孵出速度较快，为防止在洗粪、换水过程中将毛蚴倒掉，必须准备1.0％～1.2％的食盐水，代替洗粪用水以抑制毛蚴过早孵出被倒掉。
5.1.2 器材、试剂
竹筷、40目铜筛滤杯、260目尼龙筛兜、500ml 沉淀器、1000ml 塑料粪杯、放大镜、显微镜、炉、水温计、盆、水缸、水桶、剪刀、闹钟、250ml ～300ml 长颈平底烧瓶、脱脂棉、食盐。
5.2 操作方法
5.2.1 洗粪与集卵
将每头家畜粪便分为三份，每粪份量：牛50g~100g，猪20g ，羊、犬5g~10g。置于粪杯中，加10~20倍普通水调匀，然后用40目铜筛滤杯过滤，弃去粪渣；将滤液倒入260目尼龙筛兜内，加水洗净， 将尼龙兜内的沉淀物取下备用孵化。
5.2.2 孵化
将沉淀物放入平底长颈烧瓶中加满25℃左右清水，在有一定光线的条件下进行孵育。为便于观察毛蚴，在瓶颈下三分之一处加一块2cm ～3cm 厚的脱脂棉，再加满水。
6 间接血凝试验
6.1 材料准备
6.1.1 V 形微孔有机玻璃血凝板（孔底角90°），100ul 和25ul 定量移液器。
6.1.2 生理盐水、蒸馏水。
6.1.3 诊断液和阴、阳性血清（按说明书处理和保藏）。
6.2 操作方法
6.2.1 用100ul 定量移液器加生理盐水100ul 于血凝板左边第1孔内，用25ul 定量移液器加入被检血清25ul ，使血清成5倍稀释。
6.2.2 用25ul 定量移液器在板左边第2、3孔中各加生理盐水25ul 。
6.2.3 用移液器将第1孔中血清混匀，混匀方法是反复吸吹三次，然后吸25ul 已混匀液加入右边邻孔中，此孔血清成1:10稀释。
6.2.4 用移液器和6.2.3一样混匀第2孔血清，吸取25ul 加入第3孔中，此时该孔血清成1：20稀释。
6.2.5 用移液器和6.2.4一样混匀第3孔血清，吸取25ul 丢弃。
6.2.6 每份被检血清和阳、阴性血清按同样方法用3个孔，也可不用阴性血清而设生理盐水对照孔，此时另取2个孔各加25ul 生理盐水作空白对照。
6.2.7 用25ul 定量移液器加入1：10及1：20血清稀释孔及空白对照孔各一滴诊断液，振荡血凝板，使诊断液和血清混匀，置20℃~37℃条件下1h~2h，等空白或阴性血清对照孔中血球全部沉于孔底中央，呈一圆形红点，且阳性血清两孔中血球没有全部沉入孔底中央即无圆形红点或仅有很小的圆形红点即可判定结果。
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7.1 毛蚴孵化法结果判定
牛、羊、犬粪从孵育开始到1h 、3h 、5h 后各观察一次，猪粪从孵育开始到5h 、8h 后各观察一次，每个样品每次观察应在2min 以上。发现毛蚴即判为阳性。血吸虫毛蚴眼观为针尖大小，灰白色、梭形，折光强，和水中其它小虫不同处是近水面作水平或斜向直线运动。当用肉眼观察难与水中的其它小虫相区别时，可用滴管将虫吸出置显微镜下观察，显微镜下可见毛蚴前部宽，中
间有个顶突，两侧对称，后渐窄，周身有纤毛。在一个样品中有（1 ~5）个毛蚴为+，（6~10）个毛蚴为++，（11~20）个毛蚴为+++，21个毛蚴以上为++++。
7.2 间接血凝试验结果判定
a ）红血球全部下沉到孔底中央，形成紧密红色圆点，周缘整齐为阴性（－）；
b ）红血球少量沉于孔底中央，形成一较阴性小的红色圆点，周围有少量凝集红血球为弱阳性（+）； c ）红血球约半数沉于孔底中央，形成一更小红色圆噗，周围有一层淡红色凝集红血球为阳性（++）； d ）红血球均匀地分散于孔底，形成一淡红色薄层为强阳性（+++）。
以血清10倍和20倍稀释孔出现b ）、c ）、d ）凝集现象时，被检血清判为阳性。
如阴性或生理盐水对照孔2h 后红血球沉淀图象不标准，说明生理盐水质量不合标准或血凝板孔未洗净，需检查原因，重新操作。
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家畜日本血吸虫检验技术规程
1 范围
本标准规定了家畜日本血吸虫病检验的粪样采集、血样采集、检验程序及结果判定等方面的要求。 本标准适用于我省家畜日本血吸虫病的诊断、监测、检疫及流行病学调查。
2 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
2.1 日本血吸虫病（Schistosomoiasis japonicum）
由分体科分体属的日本血吸虫寄生牛、马、猪、羊、犬、猫等几十种哺乳动物和人的门静脉和肠系膜静脉小血管内的一种人畜共患寄生虫病。
３ 粪样采集
采粪季节适合于春、秋两季，其次是夏季，不适于冬季。采粪时间最好于清晨从家畜直肠中采取，或新排出的未污染的粪便。采粪量：牛、马粪200 g，猪粪100 g，羊和狗粪40 g。每份粪样需附上填好的送粪卡。送粪卡应填上村、组名、饲养员或畜主姓名、畜别、性别、年龄及采粪日期。 4 血样采集
4.1 采血方法
4.1.1 颈静脉采血（用于牛、羊、马等家畜）
a ）器材：针头12号至18号，牛、马宜用16号针头最好，羊用12号针头为好，小试管（容量5ml ，10ml ）。均需按常规消毒。
b ）方法：将动物保定好，采血点选在颈静脉沟上三分之一处，剪毛消毒后，用左手拇指在采血点下方压紧，其余四指在右侧相应部位抵住，使上部颈静脉怒张，如怒张不明显，可用绳系住颈基部使静脉怒张，右手拇、食、中指拿着针头，对准颈静脉刺入，用试管接取2ml ～5ml 血即可。
4.1.2 耳静脉采血（用于猪、牛）
a ）器材：针头12号至16号，小试管（容量5ml~10ml），2ml ～5ml 注射器。均需消毒。
b ）方法：采猪血时，先用绳在耳根捆扎，也可由助手紧握耳根，使耳静脉充分怒张，用酒精棉消毒后，将针头刺入血管，流血后即用左手拇指按着针头，食、中二指托于耳的腹面，然后放松耳根按压处，用右手接上注射器，抽出血液2ml ，移入试管中。
采牛血时可由助手压住耳静脉根部，如上方法采血。
4.2 血清的分离与保存
血液进入小试管后应及时密闭管口，在20℃～37℃条件下放置1h 左右，然后置入0℃～10℃冰箱中10h 至3d ，血清便会自动渗出。如不急需进行检验，需将血清分离到另一灭菌试管或瓶中，置于冰箱中备用，在0℃～10℃冰箱中一般可保持14d ，在－20℃冰箱中，可保存3个月，保存时间越长，抗体效价越低。
亦可在20℃～37℃条件下放置1h 后，用（1500～2000）r ／分离心（5～10）min ，吸取上清液到另一灭菌试管或瓶中，置于冰箱中备用。
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5 粪便毛蚴孵化检查
5.1 材料准备
5.1.1 水
PH 值6.8～7.2，无水虫和化学物质污染（包括氯气）的澄清水，分别作如下处理：
a ）有氯气的自来水应在盛具中存放20h 以上；
b ）河水、池水、井水、雨水等混有水虫的水加温至60℃，冷后再用。或在每5万ml 水中加含30%有效氯漂白粉0.35g ，搅匀，存放20h ，待氯气逸尽；也可在放漂白粉后加入硫代硫酸钠0.2g ～0.4g 脱氯，30min 后用；
c ）浑浊水，每5万ml 水中加明矾3g ～5g ，充分搅拌待水澄清后用；
d ）高温季节用水处理，水温高时，毛蚴孵出速度较快，为防止在洗粪、换水过程中将毛蚴倒掉，必须准备1.0％～1.2％的食盐水，代替洗粪用水以抑制毛蚴过早孵出被倒掉。
5.1.2 器材、试剂
竹筷、40目铜筛滤杯、260目尼龙筛兜、500ml 沉淀器、1000ml 塑料粪杯、放大镜、显微镜、炉、水温计、盆、水缸、水桶、剪刀、闹钟、250ml ～300ml 长颈平底烧瓶、脱脂棉、食盐。
5.2 操作方法
5.2.1 洗粪与集卵
将每头家畜粪便分为三份，每粪份量：牛50g~100g，猪20g ，羊、犬5g~10g。置于粪杯中，加10~20倍普通水调匀，然后用40目铜筛滤杯过滤，弃去粪渣；将滤液倒入260目尼龙筛兜内，加水洗净， 将尼龙兜内的沉淀物取下备用孵化。
5.2.2 孵化
将沉淀物放入平底长颈烧瓶中加满25℃左右清水，在有一定光线的条件下进行孵育。为便于观察毛蚴，在瓶颈下三分之一处加一块2cm ～3cm 厚的脱脂棉，再加满水。
6 间接血凝试验
6.1 材料准备
6.1.1 V 形微孔有机玻璃血凝板（孔底角90°），100ul 和25ul 定量移液器。
6.1.2 生理盐水、蒸馏水。
6.1.3 诊断液和阴、阳性血清（按说明书处理和保藏）。
6.2 操作方法
6.2.1 用100ul 定量移液器加生理盐水100ul 于血凝板左边第1孔内，用25ul 定量移液器加入被检血清25ul ，使血清成5倍稀释。
6.2.2 用25ul 定量移液器在板左边第2、3孔中各加生理盐水25ul 。
6.2.3 用移液器将第1孔中血清混匀，混匀方法是反复吸吹三次，然后吸25ul 已混匀液加入右边邻孔中，此孔血清成1:10稀释。
6.2.4 用移液器和6.2.3一样混匀第2孔血清，吸取25ul 加入第3孔中，此时该孔血清成1：20稀释。
6.2.5 用移液器和6.2.4一样混匀第3孔血清，吸取25ul 丢弃。
6.2.6 每份被检血清和阳、阴性血清按同样方法用3个孔，也可不用阴性血清而设生理盐水对照孔，此时另取2个孔各加25ul 生理盐水作空白对照。
6.2.7 用25ul 定量移液器加入1：10及1：20血清稀释孔及空白对照孔各一滴诊断液，振荡血凝板，使诊断液和血清混匀，置20℃~37℃条件下1h~2h，等空白或阴性血清对照孔中血球全部沉于孔底中央，呈一圆形红点，且阳性血清两孔中血球没有全部沉入孔底中央即无圆形红点或仅有很小的圆形红点即可判定结果。
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7.1 毛蚴孵化法结果判定
牛、羊、犬粪从孵育开始到1h 、3h 、5h 后各观察一次，猪粪从孵育开始到5h 、8h 后各观察一次，每个样品每次观察应在2min 以上。发现毛蚴即判为阳性。血吸虫毛蚴眼观为针尖大小，灰白色、梭形，折光强，和水中其它小虫不同处是近水面作水平或斜向直线运动。当用肉眼观察难与水中的其它小虫相区别时，可用滴管将虫吸出置显微镜下观察，显微镜下可见毛蚴前部宽，中
间有个顶突，两侧对称，后渐窄，周身有纤毛。在一个样品中有（1 ~5）个毛蚴为+，（6~10）个毛蚴为++，（11~20）个毛蚴为+++，21个毛蚴以上为++++。
7.2 间接血凝试验结果判定
a ）红血球全部下沉到孔底中央，形成紧密红色圆点，周缘整齐为阴性（－）；
b ）红血球少量沉于孔底中央，形成一较阴性小的红色圆点，周围有少量凝集红血球为弱阳性（+）； c ）红血球约半数沉于孔底中央，形成一更小红色圆噗，周围有一层淡红色凝集红血球为阳性（++）； d ）红血球均匀地分散于孔底，形成一淡红色薄层为强阳性（+++）。
以血清10倍和20倍稀释孔出现b ）、c ）、d ）凝集现象时，被检血清判为阳性。
如阴性或生理盐水对照孔2h 后红血球沉淀图象不标准，说明生理盐水质量不合标准或血凝板孔未洗净，需检查原因，重新操作。
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