第4期2013年8月
N o. 4 A u g. 2013现代科学仪器
Modern Scientific Instruments
55
氨基酸分析方法的研究进展
江海风1 马品一2 金 月2 冯旭东2 王兴华2
(1中国船舶重工集团公司第七一八研究所 邯郸 056027；2吉林大学化学学院 长春 130012)
摘 要 氨基酸分析是生命科学研究中最重要的技术之一。本文回顾了近年来国内外氨基 酸分析技术的研究进展（如化学分析法、光谱分析法、电化学分析法、毛细管电泳分析法、色谱分析法等），着重介绍了氨基酸柱前衍生化处理和反相高效液相色谱法测定技术的发展，讨论了不同的衍生化试剂的实验效果。通过对各种衍生化方法的综合分析，为氨基酸的色谱分析提供了一定的参考。
关键词 氨基酸；反相高效液相色谱；柱前衍生中图分类号 TH833
Review on Amino Acid Analysis Methods
Jiang Haifeng1,Ma Pinyi2,Jin Yue2,Feng Xudong2,Wang Xinghua2
(The 718th Research Institute of CSIC,Handan,056027;2College of Chemistry,Jilin University,Changchun,130012)
1
Abstract Amino acid analysis is one of most important technologies used in life science.In this study,the development of technique and methods for amino acid analysis were reviewed and summarized for reference to routine amino acid analysis,such as chemical analysis,spectrum analysis method and so on.The reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) with pre-column derivation was especially discussed in order to provide references for the resea r chers in this area.
Key words Amino acids;Reversed-phase high performance liquid chromatography;Pre-column derivation
氨基酸是重要的生命物质，是组成生物体中酶和蛋白质的基本单元。可参与蛋白质合成的氨基酸（亦称为基本氨基酸）有20多种，式存在于自然界中，液(如：血浆、尿液等)、食品(如：肉制品、饮料) 另一种是以结合态存在于肽和蛋白质中。氨基酸分析是蛋白质组学、生物化学、食品科学、临床医学、化工轻工、考古研究、地质推断、宇宙探秘等领域的重要研究手段，因此对氨基酸分析方法的研究与改进具有重要意义。
生物，使用碱标准溶液滴定该衍生物，采用酚酞指示剂确定滴定终点[1]。这种方法简单易行、费用低廉，但由于在实际操作中难以准确掌握滴定终点，该方法准确度较差。1.1.2 凯氏定氮法
凯氏定氮法通过测定样品中氮元素的总量，并根据特定样品的蛋白质和氨基酸的氮含量平均值计算样品中蛋白质与氨基酸的含量。此方法由Kiel-dahl 于1833年首先提出，经过长期改进，目前己演变出常量法、微量法、半微量法、自动定氮法及改良凯氏法等多种。该方法的测量结果准确度较高，但由于操作步骤复杂、测定周期长、无法识别氮元素来源等不利因素影响，其应用范围受到了较大限制。
1 氨基酸的分析方法
常规的分析化学手段均可用于氨基酸分析，目
前常 用氨基酸分析方法有化学分析法、光谱分析法、电化学分析法、毛细管电泳法和色谱分析法等。
1.2 光谱分析法
光谱分析法是一种发展较为成熟且操作简单的方法，常用的有紫外分光光度法和荧光分光光度法。1.2.1 紫外分光光度法
酪氨酸、精氨酸和苯丙氨酸在紫外区有明显的特征吸收，因为其R 基均含有苯环共轭双键系统，故利用紫外分光光度法可测定上述氨基酸含量。该方
1.1 化学分析法
化学分析法是一类比较传统的氨基酸分析方法，主要包括甲醛滴定法和凯氏定氮法。1.1.1 甲醛滴定法
甲醛滴定法的原理是向中性或碱性氨基酸溶液中加入甲醛，氨基酸的氨基和甲醛可形成羟甲基衍
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法简单易行，但线性范围稍小，仅有一个数量级。李津明等[2]用紫外分光光度法测定了林蛙油软胶囊中精氨酸的含量。1.2.2 荧光分光光度法
氨基酸分子中的氨基、羧基或其它活性基团可与衍生化试剂发生化学反应，采用荧光分光光度计可测定衍生化产物含量，进而可计算出原始样品中的氨基酸含量。该方法可能存在衍生化时间长、衍生化产物组分复杂和稳定性差等问题，通过对衍生化试剂的仔细挑选，可部分解决上述问题。陈悦娇等[3]利用邻苯二甲醛荧光法测定了市售白果中游离氨基酸的总量。
1.3 电化学分析法
电化学分析法通常采用不同种类的氨基酸选择性电极对各种氨基酸进行测定，由于其具有简单、灵敏、无放射、无污染等特点，越来越受到人们的关注。但在实际应用中，仍需解决具有直接电化学活性的氨基酸种类较少、电化学反应的可逆性较差、背景干扰较大、非化学活性的氨基酸仍需进行衍生化反应等问题，故选择合适的反应体系及反应条件便成为这类方法的研究关键。氨基酸的电化学分析法可分为直接 电化学分析法和间接电化学分析法。 1.3.1 直接电化学分析法
利用部分种类氨基酸在电极上发生氧化反应时所呈现出的电活性，可直接对上述氨基酸进行测定。
不经衍生化处理即可利用直接电化有研究报道[4,5]，
学分析法测定色氨酸、酪氨酸、胱氨酸、半胱氨酸和酩氨酸的含量。1.3.2 间接电化学分析
（1）衍生化反应间接测定
多数种类氨基酸在金属电极上是非电活性的，无法直接测定。但采用衍生化反应将上述氨基酸转化成电活性的物质后即可进行间接测定。如非电活性的赖氨酸与芳醛进行衍生化反应后，在约0.3mo1/L的磷酸盐缓冲溶液中(pH=11)，衍生化产物于峰电位1.12V 处在滴汞电极上产生灵敏吸附还原波，其导数波高与赖氨酸浓度有良好的线性关系，检测限为3×10-8mol/L[6]。
（2）氨基酸与金属离子配位反应间接测定氨基酸作为配体可与多种金属离子配位，形成的电活性配合物可提高氨基酸自身的检测灵敏度。Gilbert 等[7]使用Co 2+催化半胱氨酸产生氢波来测5×10-9mol/L。
（3）电致化学发光分析
电致化学发光分析的原理是具有电致化学发光活性的物质在一定的电位条件下，可与溶液中存在的敏化还原性物质作用，所生成的不稳定激发态回至基态时可产生化学发光，发光强度与被测物含量具有固定的比例关系。碱性条件下，氨基酸对次氯酸钠-鲁米诺化学发光体系的增敏作用显著，郎惠云等[8]基于此原理建立了反相流动注射-化学发光测定氨基酸的新方法。该方法不需对氨基酸进行衍生或转化，检出限为0.016μg/mL，采样频率为150次/h，对1μg/mL的组氨酸进行连续12次平行测定的RSD 为0.9%。
1.4 毛细管电泳法
毛细管电泳法是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分间淌度和分配行为上的差异实现组分分离的技术，具有分离效率高、无须梯度洗脱、分析速度快、溶剂消耗少等特点，尤其适用于氨基酸的手性分离。翟海云等[9]采用反向毛细管电泳模式，在缓冲液中加入表面活性剂使电渗流改向，在无需衍生的情况下，实现了对混合氨基酸的快速分离。
1.5 色谱分析法
1.5.1 高效阳离子交换色谱法
Spackman 等[10]采用强酸型阳离子交换树脂，利用氨基酸在酸性条件下形成阳离子的特性将其在阳离子交换柱中分离，分离后的氨基酸用相应的试剂(如茚三酮) 进行衍生，再用合适的检测手段(如紫外分光光度法) 进行检测。市售的自动氨基酸分析仪多采用高效阳离子交换色谱-柱后茚三酮衍生光度检测技术。这种方法准确可靠、重现性好，能测定大多数种类的氨基酸及其同系物，但灵敏度不高，仪器价格较贵。杨学猛等[11]采用氨基酸分析仪同时测定了氨基酸制剂“肝氨散”中L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的含量
1.5.2 高效阴离子交换色谱积分脉冲安培检测法氨基酸分子中的羧基在强碱性介质中可形成阴离子，而氨基酸分子中的氨基在强碱性介质中和一定的电位下可在贵金属(金、铂) 电极表面发生氧化反应，基于上述原理可实现对氨基酸的阴离子交换色谱分离和积分脉冲安培检测。该方法的优点是不需要对氨基酸进行衍生化处理，可直接进行分离
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和检测，且检出限较低。蔡亚歧等[12]将高效阴离子
交换色谱-积分脉冲安培检测法应用于鱼粉和玉米粉水解液中氨基酸组分的分析测定，使用Dionex AminoPacPA10阴离子交换柱为分析柱，控制柱温为35℃，以NaOH 和NaAc 强碱性溶液为淋洗液，在合适的梯度条件下，实现了对17种常见氨基酸的高效分离与高灵敏检测。1.5.3 气相色谱法
将氨基酸衍生化为易于汽化的物质后，采用气是分离时间短、缺点是衍生化反应容易产生干扰成分。Husek[13]采用气相色谱法同时分析血浆中的2030种非氨基有机酸，样品制备时间少于30min。1.5.4 高效液相色谱法
该方法包括柱前衍生和柱后衍生两大类。目前多用柱前衍生-反相高效液相色谱法，即首先将氨基酸转化为适于反相液相色谱分离并能被灵敏检测的衍生物，然后采用高效液相色谱法对上述衍生物进行分离和检测。该方法灵敏、快速、应用范围广、易于自动化。牟德海等[14]建立了邻苯二甲醛(OPA)手动柱前衍生-反相高效液相色谱法测定样品中氨基酸含量的方法，对牛血清白蛋白(BSA)的氨基酸组成和小鼠血清中的游离氨基酸进行了测定，取得满意的结果；苗虹等[15]采用柱前衍生-高效液相色
化学名称邻苯二甲醛异硫氰酸苯酯
简称OPA
谱法测定食物中天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸等16种氨基酸含量。
2 氨基酸的柱前衍生技术
自上世纪80年代以来，应用高效液相色谱法测定氨基酸的研究发展迅速，特别是对柱前衍生-反相高效液相色谱法（RP-HPLC）的研究取得了显著RP-HPLC 分析方法更进展[16]。相对于其它方法，
加灵敏（可测知
RP-HPLC 要求将氨基酸在柱前转化为适于反相色谱分离并能被灵敏检测的衍生物，其关键在于衍化生试剂的选择。选择衍生化试剂的标准包括：该试剂能与各氨基酸进行定量反应；每种氨基酸只生成一种化合物；目标产物有一定的稳定性，不产生或易于排除干扰物；便于实现自动化；产物能在不同型号的高效液相色谱仪上进行测定[17]。目前国内应用较为广泛的柱前衍生化试剂列于表1，最常用的柱前衍生试剂有邻苯二甲醛（OPA）、异硫氰酸苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）及二硝基氟苯（FDNB）等。
2.1 邻苯二甲醛（OPA）衍生法
邻苯二甲醛（OPA）衍生法由Jone B N 等[18]
结构式
表1 柱前衍生反相高效液相色谱法分析氨基酸的衍生试剂
检测方法荧光
紫外（350nm）紫外（254nm）
文献14、18-2021-25
PITC
N
S
O
氯甲酸芴甲酯FMOC-Cl
荧光26-29
丹磺酰氯Dansyl-Cl
SO 2Cl
荧光
紫外（250nm）紫外（360nm）
30-32
NO 2
二硝基氟苯FDNB
O 2N
F
F
33-35
1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺
FDNPAA
O 2N
H 2
2NH 2
紫外（340nm）36
磺酰氯二甲胺偶氮苯DABS-Cl
SO 2Cl
N 荧光
紫外（436nm）
O N
37-38
6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基
甲酸酯
2,4-二硝基氯苯
AQC
N
H 紫外（248nm）39-40
NO 2
CDNB
O 2N 紫外（360nm）41-42
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最早提出，具有衍生步骤简单、反应速度快、剩余试剂不干扰测定的特点，在柱前衍生试剂中应用最为广泛。其反应机理如图1所示。
SR' R
+H 2N
R +R'SH
N
间后分离效果迅速下降，通过调整流动相梯度很难改善[25]。
2.3 9-氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）衍生法
9-氯甲酸芴甲酯是多肽合成的氨基保护剂，在pH 值为7.7的条件下能与一、二级氨基酸生成稳定的衍生物，其荧光检测灵敏度可达fmo1水平[26]。FMOC-Cl 与氨基酸反应迅速，室温下约30s 即可完成，反应机理如图3所示。
O +
Cl H 2N
R COOH
O O N H R 图1 OPA与一级氨基酸反应
在还原剂β-巯基乙醇的作用下，OPA 与一级氨基酸迅速反应生成1-硫代-2-烷基异吲哚，衍生反应可在13min 内完成。衍生物经RP-HPLC 分离后即可进行荧光检测，灵敏度可达fmol 的水平[19]。由于β-巯基乙醇作还原剂时天冬氨酸/丝氨酸、缬氨酸/甲硫氨酸衍生物的色谱分辨率较差，现多用3-巯基丙酸（3-MPA）代替，通过引入一个α-羧基，使上述两对氨基酸衍生物的疏水性相对减弱，再用乙腈替代甲醇作为流动相，同时优化梯度程序使其得到完全分离[14]。
该柱前衍生化试剂本身仍存在一些不足。第一，OPA 试剂本身容易被空气中的氧气氧化而降解(由无色透明变成微黄色)，试剂保存困难。将OPA 与β-巯基乙醇结合作为衍生化试剂可部分解决该问题，上述试剂在40℃黑暗条件下可稳定存放1周。第二，OPA 与氨基酸的衍生产物也不稳定，衍生后需立即进样分析。为解决此问题，在实际操作中采取的方法是加入硼酸盐缓冲液和减少并固定从衍生化操作到完成手工进样的时间[20]。
图3 FMOC-Cl与氨基酸反应
该方法反应产物稳定，4℃下避光储存13d 不
影响测定结果；色谱分离有很好的分辨率和很高的分离速度。该方法最大优点是衍生产物发射波长固
FMOC-Cl 在哌啶和定，没有内源性干扰[27]。另外，
DMF 存在下，很容易从氨基上脱落并得到原来的氨基酸，有利于氨基酸的进一步分析[28]。
此法的缺点是：FMOC-Cl 及其水解产物FMOC-OH 均有和FMOC-Cl 氨基酸衍生物类似的荧光现象。虽然用戊烷抽提可除去干扰，但抽提效率每步仅约为70%，只能部分解决该问题[29]。
2.4 丹磺酰氯（Dansyl-Cl）衍生法
Dansyl-Cl 衍生法（图4）操作比较简单，只需将Dansyl-Cl 加入事先溶有氨基酸的碳酸氢钾缓冲溶液（pH=9.5）中，室温下蔽光反应35～50min 即可完成衍生[30]。
R
+SO 2Cl
H 2N
COOH
H N SO 2
R 2.2 异硫氰酸苯酯（PITC）衍生法
PITC 可与一、二级氨基酸反应生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTC）。该反应（图2）只需在室温下进行20min，然后经两步快速蒸发即可完成
S +H 2N
R [21]
。
S COOH
图4 Dansyl-C1与氨基酸反应
图2 PITC与氨基酸反应
该反应的衍生物单一、稳定[22]，经RP-HPLC 分离后，用紫外检测器在254nm 处检测，最小检出量大约为1pmol。目前此方法已拓展应用到含磷氨基酸[23]和含硫氨基酸[24]等修饰氨基酸的分析过程。
但该方法也存在以下缺点：氨基酸衍生时需真空干燥以除去过量的衍生试剂，使得PITC 法很难实现操作全部自动化；PITC 毒性大，且需专门的衍生装置在无水状态下进行；PITC 会降低分析柱的使用该反应衍生物的产率依赖于Dansyl-Cl 与氨基
酸的比例，Tapuhi 等[31]通过对衍生条件的考察和优化，确定了其最合适的比例为5∶1～10∶1（mol/mol）。
Dansyl-Cl 用作氨基酸衍生剂的优点是：Dan-syl-Cl 与包括亚氨基在内的所有氨基酸均能反应，衍生物比较稳定，一般可放置12～24h。该方法的缺点是：反应活性较差，反应速度慢；Dansyl-Cl 的
干扰测定；水解产物Dansyl-SO 3H 也可发射强荧光，
衍生产物对紫外光照比较敏感，反应要在避光条件
第4期2013年8月 江海风 等：氨基酸分析方法的研究进展59
和胱氨酸等反应均可生成二级衍生物，给分离测定带来一定麻烦。此外，如果反应温度高于45℃，衍生物的生成速度加快，但丹磺酰胺和其它副产物的生成量也会迅速增加，反而降低了衍生物的产率[32]。
物的烷基化修饰，反应原理如图7所示。
R
N
SO 2Cl N N
+H 2N
R COOH
N
HN COOH
2N
2.5 二硝基氟苯（FDNB）衍生法
FDNB 与氨基酸的衍生反应（图5）条件易于控制，而且其衍生产物2,4-硝基苯氨基酸有很好的稳定性，4℃下避光保存一个月后响应值无明显变化，这给定量测定带来了很大的方便[33]。
NO 2
O 2N
+H 2N
R COOH
O 2N
NO 2
NH
COOH R
图7 DABS-Cl与氨基酸反应
图5 FDNB与氨基酸的反应
该反应生成的衍生物由于硝基苯环的引入，可产生较强的紫外吸收，检测灵敏度可达pmol 水平；此外，该衍生物色谱分离时间较短，分析结果的准确性、重复性均较好[34]。由于FDNB 与氨基结合牢固，该衍生产物相当稳定，是进行氨基酸柱前衍生的理想试剂[35]。
该方法的主要缺点是衍生化反应副产物二硝基苯酚与主要衍生物的保留时间相近，会对分离过程造成干扰，解决办法为控制衍生试剂FDNB 的加入量和改善分离条件。
该方法的特点是DABS-Cl 氨基酸衍生物在可
与见光区430nm 处的检测灵敏度可达1×10-12mol，
可避免使用荧光检测法灵敏度0.5×10-12mol 相近，
紫外检测时流动相中微量UV 吸收杂质的干扰。此外，该衍生方法简单、快速，衍生物极其稳定，在碳酸钠溶液中室温下可保持一个月以上[37]。
早期的DABS-Cl 衍生法由于生成的衍生物种类过多而不能用于对未知样品的定量分析。后来，Chang 等[38]通过控制DABS-Cl 与氨基酸分子比为4∶1～8∶1（mol/mol），改进衍生条件使氨基酸只生成一种衍生物，较好地解决了这个问题，检测限量可达亚pmol 水平。
2.8 6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）衍生法
AQC 与一、二级氨基酸均起反应（图8），衍生迅速，衍生物稳定，紫外检测灵敏度高(检测极限低于亚pmol 水平)。
H N
O O N
+H 2N
R COOH
N
H N H N COOH
2.6 1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺（FDNPAA）衍生法
FDNPAA 是一种新型手性衍生试剂，用于DL-氨基酸的衍生、分离效果良好。该反应（图6）的衍生产物在5h 内稳定，包括脯氨酸、光氨酸在内的20种氨基酸可在110min 内得到良好分离，采用340nm 紫外检测器可检测的极限量达50×10mol。该方法在衍生过程中不发生消旋化，且反应速率一致，分离效果好，能与其他物质达到基线分离，因此回收率高，稳定性、精密度、重现性、通用性均较好；主要缺点是衍生化试剂较为昂贵，且衍生时间较长[36]。
NO 2
O 2N
H
H 2N
2
H 2N
+
R H 2N
H
2N
NO 2
NH
COOH 2
-12
图8 AQC与氨基酸反应
另外该法不仅具有能与离子交换色谱法相媲美
的精密度和准确度，而且还不受样品基质、大量电解质、维生素和微量元素的干扰，特别适于天然生物样品、食品及饲料中氨基酸的分析[39]。此法存在的主要问题是：AQC 水解后产生的6-氨基喹啉有很强的紫外吸收，在常规水解氨基酸衍生物的峰前形成一个大的试剂峰并伴有拖尾现象，从而干扰了对天门冬氨酸、丝氨酸等氨基酸的测定。不过，此问题可通过优化流动相的pH 值和梯度洗脱程序得到了一定解决[40]。
2.9 2,4-二硝基氯苯（CDNB）衍生法
CDNB 有与FDNB 类似的硝基苯基团，因此其
其反柱前衍生和色谱分析条件与FDNB 法类似[41]，
图6 FDNPAA与氨基酸反应
2.7 磺酰氯二甲胺偶氮苯（DABS-Cl）衍生法
60
NO 2
O 2N
Cl +H 2N
R O 2N
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NO 2
NH
COOH N o. 4 A u g. 2013
图9 CDNB与氨基酸反应
CDNB 法与FDNB 法相比，具有衍生试剂价廉易得、理化性质稳定、制备试样方便简单等特点。已
-醋酸盐缓冲体系梯度有报道[42]采用C 18柱和乙腈
洗脱方法，可将17种混合氨基酸及衍生剂水解物进行有效分离。
此方法衍生后的氨基酸一般在键合C 18柱上，根据液液分配原理进行分离。色谱流动相多以乙酸盐或磷酸盐缓冲液为主，以乙腈、甲醇或四氢呋喃为调节剂。由于该氨基酸衍生物仍保留着两性化合物的特点，故除改变调节剂之外，还可通过调节缓冲液pH 值、离子强度、柱温等使之达到理想的分离。当然，不同衍生物所选用的柱型、流动相以及氨基酸的洗脱时间和顺序不尽相同。该方法可用于分析蛋白质水解液、生理体液和食品等样品中的氨基酸。
3 总结
本文综合论述了氨基酸的一些分析方法（化学分析法、光谱分析法、电化学分析法、毛细管电泳分析法、色谱分析法），并且着重对氨基酸的柱前衍生-反相高效液相色谱法（RP-HPLC）的研究进展进行详细阐述，对不同的衍生化试剂的实验效果进行了讨论和比较，为日常的氨基酸分析提供了方法参考。
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第4期2013年8月 江海风 等：氨基酸分析方法的研究进展
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第4期2013年8月
N o. 4 A u g. 2013现代科学仪器
Modern Scientific Instruments
55
氨基酸分析方法的研究进展
江海风1 马品一2 金 月2 冯旭东2 王兴华2
(1中国船舶重工集团公司第七一八研究所 邯郸 056027；2吉林大学化学学院 长春 130012)
摘 要 氨基酸分析是生命科学研究中最重要的技术之一。本文回顾了近年来国内外氨基 酸分析技术的研究进展（如化学分析法、光谱分析法、电化学分析法、毛细管电泳分析法、色谱分析法等），着重介绍了氨基酸柱前衍生化处理和反相高效液相色谱法测定技术的发展，讨论了不同的衍生化试剂的实验效果。通过对各种衍生化方法的综合分析，为氨基酸的色谱分析提供了一定的参考。
关键词 氨基酸；反相高效液相色谱；柱前衍生中图分类号 TH833
Review on Amino Acid Analysis Methods
Jiang Haifeng1,Ma Pinyi2,Jin Yue2,Feng Xudong2,Wang Xinghua2
(The 718th Research Institute of CSIC,Handan,056027;2College of Chemistry,Jilin University,Changchun,130012)
1
Abstract Amino acid analysis is one of most important technologies used in life science.In this study,the development of technique and methods for amino acid analysis were reviewed and summarized for reference to routine amino acid analysis,such as chemical analysis,spectrum analysis method and so on.The reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) with pre-column derivation was especially discussed in order to provide references for the resea r chers in this area.
Key words Amino acids;Reversed-phase high performance liquid chromatography;Pre-column derivation
氨基酸是重要的生命物质，是组成生物体中酶和蛋白质的基本单元。可参与蛋白质合成的氨基酸（亦称为基本氨基酸）有20多种，式存在于自然界中，液(如：血浆、尿液等)、食品(如：肉制品、饮料) 另一种是以结合态存在于肽和蛋白质中。氨基酸分析是蛋白质组学、生物化学、食品科学、临床医学、化工轻工、考古研究、地质推断、宇宙探秘等领域的重要研究手段，因此对氨基酸分析方法的研究与改进具有重要意义。
生物，使用碱标准溶液滴定该衍生物，采用酚酞指示剂确定滴定终点[1]。这种方法简单易行、费用低廉，但由于在实际操作中难以准确掌握滴定终点，该方法准确度较差。1.1.2 凯氏定氮法
凯氏定氮法通过测定样品中氮元素的总量，并根据特定样品的蛋白质和氨基酸的氮含量平均值计算样品中蛋白质与氨基酸的含量。此方法由Kiel-dahl 于1833年首先提出，经过长期改进，目前己演变出常量法、微量法、半微量法、自动定氮法及改良凯氏法等多种。该方法的测量结果准确度较高，但由于操作步骤复杂、测定周期长、无法识别氮元素来源等不利因素影响，其应用范围受到了较大限制。
1 氨基酸的分析方法
常规的分析化学手段均可用于氨基酸分析，目
前常 用氨基酸分析方法有化学分析法、光谱分析法、电化学分析法、毛细管电泳法和色谱分析法等。
1.2 光谱分析法
光谱分析法是一种发展较为成熟且操作简单的方法，常用的有紫外分光光度法和荧光分光光度法。1.2.1 紫外分光光度法
酪氨酸、精氨酸和苯丙氨酸在紫外区有明显的特征吸收，因为其R 基均含有苯环共轭双键系统，故利用紫外分光光度法可测定上述氨基酸含量。该方
1.1 化学分析法
化学分析法是一类比较传统的氨基酸分析方法，主要包括甲醛滴定法和凯氏定氮法。1.1.1 甲醛滴定法
甲醛滴定法的原理是向中性或碱性氨基酸溶液中加入甲醛，氨基酸的氨基和甲醛可形成羟甲基衍
56Modern Scientific Instruments
N o. 4 A u g. 2013
法简单易行，但线性范围稍小，仅有一个数量级。李津明等[2]用紫外分光光度法测定了林蛙油软胶囊中精氨酸的含量。1.2.2 荧光分光光度法
氨基酸分子中的氨基、羧基或其它活性基团可与衍生化试剂发生化学反应，采用荧光分光光度计可测定衍生化产物含量，进而可计算出原始样品中的氨基酸含量。该方法可能存在衍生化时间长、衍生化产物组分复杂和稳定性差等问题，通过对衍生化试剂的仔细挑选，可部分解决上述问题。陈悦娇等[3]利用邻苯二甲醛荧光法测定了市售白果中游离氨基酸的总量。
1.3 电化学分析法
电化学分析法通常采用不同种类的氨基酸选择性电极对各种氨基酸进行测定，由于其具有简单、灵敏、无放射、无污染等特点，越来越受到人们的关注。但在实际应用中，仍需解决具有直接电化学活性的氨基酸种类较少、电化学反应的可逆性较差、背景干扰较大、非化学活性的氨基酸仍需进行衍生化反应等问题，故选择合适的反应体系及反应条件便成为这类方法的研究关键。氨基酸的电化学分析法可分为直接 电化学分析法和间接电化学分析法。 1.3.1 直接电化学分析法
利用部分种类氨基酸在电极上发生氧化反应时所呈现出的电活性，可直接对上述氨基酸进行测定。
不经衍生化处理即可利用直接电化有研究报道[4,5]，
学分析法测定色氨酸、酪氨酸、胱氨酸、半胱氨酸和酩氨酸的含量。1.3.2 间接电化学分析
（1）衍生化反应间接测定
多数种类氨基酸在金属电极上是非电活性的，无法直接测定。但采用衍生化反应将上述氨基酸转化成电活性的物质后即可进行间接测定。如非电活性的赖氨酸与芳醛进行衍生化反应后，在约0.3mo1/L的磷酸盐缓冲溶液中(pH=11)，衍生化产物于峰电位1.12V 处在滴汞电极上产生灵敏吸附还原波，其导数波高与赖氨酸浓度有良好的线性关系，检测限为3×10-8mol/L[6]。
（2）氨基酸与金属离子配位反应间接测定氨基酸作为配体可与多种金属离子配位，形成的电活性配合物可提高氨基酸自身的检测灵敏度。Gilbert 等[7]使用Co 2+催化半胱氨酸产生氢波来测5×10-9mol/L。
（3）电致化学发光分析
电致化学发光分析的原理是具有电致化学发光活性的物质在一定的电位条件下，可与溶液中存在的敏化还原性物质作用，所生成的不稳定激发态回至基态时可产生化学发光，发光强度与被测物含量具有固定的比例关系。碱性条件下，氨基酸对次氯酸钠-鲁米诺化学发光体系的增敏作用显著，郎惠云等[8]基于此原理建立了反相流动注射-化学发光测定氨基酸的新方法。该方法不需对氨基酸进行衍生或转化，检出限为0.016μg/mL，采样频率为150次/h，对1μg/mL的组氨酸进行连续12次平行测定的RSD 为0.9%。
1.4 毛细管电泳法
毛细管电泳法是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分间淌度和分配行为上的差异实现组分分离的技术，具有分离效率高、无须梯度洗脱、分析速度快、溶剂消耗少等特点，尤其适用于氨基酸的手性分离。翟海云等[9]采用反向毛细管电泳模式，在缓冲液中加入表面活性剂使电渗流改向，在无需衍生的情况下，实现了对混合氨基酸的快速分离。
1.5 色谱分析法
1.5.1 高效阳离子交换色谱法
Spackman 等[10]采用强酸型阳离子交换树脂，利用氨基酸在酸性条件下形成阳离子的特性将其在阳离子交换柱中分离，分离后的氨基酸用相应的试剂(如茚三酮) 进行衍生，再用合适的检测手段(如紫外分光光度法) 进行检测。市售的自动氨基酸分析仪多采用高效阳离子交换色谱-柱后茚三酮衍生光度检测技术。这种方法准确可靠、重现性好，能测定大多数种类的氨基酸及其同系物，但灵敏度不高，仪器价格较贵。杨学猛等[11]采用氨基酸分析仪同时测定了氨基酸制剂“肝氨散”中L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的含量
1.5.2 高效阴离子交换色谱积分脉冲安培检测法氨基酸分子中的羧基在强碱性介质中可形成阴离子，而氨基酸分子中的氨基在强碱性介质中和一定的电位下可在贵金属(金、铂) 电极表面发生氧化反应，基于上述原理可实现对氨基酸的阴离子交换色谱分离和积分脉冲安培检测。该方法的优点是不需要对氨基酸进行衍生化处理，可直接进行分离
第4期2013年8月 江海风 等：氨基酸分析方法的研究进展
57
和检测，且检出限较低。蔡亚歧等[12]将高效阴离子
交换色谱-积分脉冲安培检测法应用于鱼粉和玉米粉水解液中氨基酸组分的分析测定，使用Dionex AminoPacPA10阴离子交换柱为分析柱，控制柱温为35℃，以NaOH 和NaAc 强碱性溶液为淋洗液，在合适的梯度条件下，实现了对17种常见氨基酸的高效分离与高灵敏检测。1.5.3 气相色谱法
将氨基酸衍生化为易于汽化的物质后，采用气是分离时间短、缺点是衍生化反应容易产生干扰成分。Husek[13]采用气相色谱法同时分析血浆中的2030种非氨基有机酸，样品制备时间少于30min。1.5.4 高效液相色谱法
该方法包括柱前衍生和柱后衍生两大类。目前多用柱前衍生-反相高效液相色谱法，即首先将氨基酸转化为适于反相液相色谱分离并能被灵敏检测的衍生物，然后采用高效液相色谱法对上述衍生物进行分离和检测。该方法灵敏、快速、应用范围广、易于自动化。牟德海等[14]建立了邻苯二甲醛(OPA)手动柱前衍生-反相高效液相色谱法测定样品中氨基酸含量的方法，对牛血清白蛋白(BSA)的氨基酸组成和小鼠血清中的游离氨基酸进行了测定，取得满意的结果；苗虹等[15]采用柱前衍生-高效液相色
化学名称邻苯二甲醛异硫氰酸苯酯
简称OPA
谱法测定食物中天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸等16种氨基酸含量。
2 氨基酸的柱前衍生技术
自上世纪80年代以来，应用高效液相色谱法测定氨基酸的研究发展迅速，特别是对柱前衍生-反相高效液相色谱法（RP-HPLC）的研究取得了显著RP-HPLC 分析方法更进展[16]。相对于其它方法，
加灵敏（可测知
RP-HPLC 要求将氨基酸在柱前转化为适于反相色谱分离并能被灵敏检测的衍生物，其关键在于衍化生试剂的选择。选择衍生化试剂的标准包括：该试剂能与各氨基酸进行定量反应；每种氨基酸只生成一种化合物；目标产物有一定的稳定性，不产生或易于排除干扰物；便于实现自动化；产物能在不同型号的高效液相色谱仪上进行测定[17]。目前国内应用较为广泛的柱前衍生化试剂列于表1，最常用的柱前衍生试剂有邻苯二甲醛（OPA）、异硫氰酸苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）及二硝基氟苯（FDNB）等。
2.1 邻苯二甲醛（OPA）衍生法
邻苯二甲醛（OPA）衍生法由Jone B N 等[18]
结构式
表1 柱前衍生反相高效液相色谱法分析氨基酸的衍生试剂
检测方法荧光
紫外（350nm）紫外（254nm）
文献14、18-2021-25
PITC
N
S
O
氯甲酸芴甲酯FMOC-Cl
荧光26-29
丹磺酰氯Dansyl-Cl
SO 2Cl
荧光
紫外（250nm）紫外（360nm）
30-32
NO 2
二硝基氟苯FDNB
O 2N
F
F
33-35
1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺
FDNPAA
O 2N
H 2
2NH 2
紫外（340nm）36
磺酰氯二甲胺偶氮苯DABS-Cl
SO 2Cl
N 荧光
紫外（436nm）
O N
37-38
6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基
甲酸酯
2,4-二硝基氯苯
AQC
N
H 紫外（248nm）39-40
NO 2
CDNB
O 2N 紫外（360nm）41-42
58Modern Scientific Instruments
N o. 4 A u g. 2013
最早提出，具有衍生步骤简单、反应速度快、剩余试剂不干扰测定的特点，在柱前衍生试剂中应用最为广泛。其反应机理如图1所示。
SR' R
+H 2N
R +R'SH
N
间后分离效果迅速下降，通过调整流动相梯度很难改善[25]。
2.3 9-氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）衍生法
9-氯甲酸芴甲酯是多肽合成的氨基保护剂，在pH 值为7.7的条件下能与一、二级氨基酸生成稳定的衍生物，其荧光检测灵敏度可达fmo1水平[26]。FMOC-Cl 与氨基酸反应迅速，室温下约30s 即可完成，反应机理如图3所示。
O +
Cl H 2N
R COOH
O O N H R 图1 OPA与一级氨基酸反应
在还原剂β-巯基乙醇的作用下，OPA 与一级氨基酸迅速反应生成1-硫代-2-烷基异吲哚，衍生反应可在13min 内完成。衍生物经RP-HPLC 分离后即可进行荧光检测，灵敏度可达fmol 的水平[19]。由于β-巯基乙醇作还原剂时天冬氨酸/丝氨酸、缬氨酸/甲硫氨酸衍生物的色谱分辨率较差，现多用3-巯基丙酸（3-MPA）代替，通过引入一个α-羧基，使上述两对氨基酸衍生物的疏水性相对减弱，再用乙腈替代甲醇作为流动相，同时优化梯度程序使其得到完全分离[14]。
该柱前衍生化试剂本身仍存在一些不足。第一，OPA 试剂本身容易被空气中的氧气氧化而降解(由无色透明变成微黄色)，试剂保存困难。将OPA 与β-巯基乙醇结合作为衍生化试剂可部分解决该问题，上述试剂在40℃黑暗条件下可稳定存放1周。第二，OPA 与氨基酸的衍生产物也不稳定，衍生后需立即进样分析。为解决此问题，在实际操作中采取的方法是加入硼酸盐缓冲液和减少并固定从衍生化操作到完成手工进样的时间[20]。
图3 FMOC-Cl与氨基酸反应
该方法反应产物稳定，4℃下避光储存13d 不
影响测定结果；色谱分离有很好的分辨率和很高的分离速度。该方法最大优点是衍生产物发射波长固
FMOC-Cl 在哌啶和定，没有内源性干扰[27]。另外，
DMF 存在下，很容易从氨基上脱落并得到原来的氨基酸，有利于氨基酸的进一步分析[28]。
此法的缺点是：FMOC-Cl 及其水解产物FMOC-OH 均有和FMOC-Cl 氨基酸衍生物类似的荧光现象。虽然用戊烷抽提可除去干扰，但抽提效率每步仅约为70%，只能部分解决该问题[29]。
2.4 丹磺酰氯（Dansyl-Cl）衍生法
Dansyl-Cl 衍生法（图4）操作比较简单，只需将Dansyl-Cl 加入事先溶有氨基酸的碳酸氢钾缓冲溶液（pH=9.5）中，室温下蔽光反应35～50min 即可完成衍生[30]。
R
+SO 2Cl
H 2N
COOH
H N SO 2
R 2.2 异硫氰酸苯酯（PITC）衍生法
PITC 可与一、二级氨基酸反应生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTC）。该反应（图2）只需在室温下进行20min，然后经两步快速蒸发即可完成
S +H 2N
R [21]
。
S COOH
图4 Dansyl-C1与氨基酸反应
图2 PITC与氨基酸反应
该反应的衍生物单一、稳定[22]，经RP-HPLC 分离后，用紫外检测器在254nm 处检测，最小检出量大约为1pmol。目前此方法已拓展应用到含磷氨基酸[23]和含硫氨基酸[24]等修饰氨基酸的分析过程。
但该方法也存在以下缺点：氨基酸衍生时需真空干燥以除去过量的衍生试剂，使得PITC 法很难实现操作全部自动化；PITC 毒性大，且需专门的衍生装置在无水状态下进行；PITC 会降低分析柱的使用该反应衍生物的产率依赖于Dansyl-Cl 与氨基
酸的比例，Tapuhi 等[31]通过对衍生条件的考察和优化，确定了其最合适的比例为5∶1～10∶1（mol/mol）。
Dansyl-Cl 用作氨基酸衍生剂的优点是：Dan-syl-Cl 与包括亚氨基在内的所有氨基酸均能反应，衍生物比较稳定，一般可放置12～24h。该方法的缺点是：反应活性较差，反应速度慢；Dansyl-Cl 的
干扰测定；水解产物Dansyl-SO 3H 也可发射强荧光，
衍生产物对紫外光照比较敏感，反应要在避光条件
第4期2013年8月 江海风 等：氨基酸分析方法的研究进展59
和胱氨酸等反应均可生成二级衍生物，给分离测定带来一定麻烦。此外，如果反应温度高于45℃，衍生物的生成速度加快，但丹磺酰胺和其它副产物的生成量也会迅速增加，反而降低了衍生物的产率[32]。
物的烷基化修饰，反应原理如图7所示。
R
N
SO 2Cl N N
+H 2N
R COOH
N
HN COOH
2N
2.5 二硝基氟苯（FDNB）衍生法
FDNB 与氨基酸的衍生反应（图5）条件易于控制，而且其衍生产物2,4-硝基苯氨基酸有很好的稳定性，4℃下避光保存一个月后响应值无明显变化，这给定量测定带来了很大的方便[33]。
NO 2
O 2N
+H 2N
R COOH
O 2N
NO 2
NH
COOH R
图7 DABS-Cl与氨基酸反应
图5 FDNB与氨基酸的反应
该反应生成的衍生物由于硝基苯环的引入，可产生较强的紫外吸收，检测灵敏度可达pmol 水平；此外，该衍生物色谱分离时间较短，分析结果的准确性、重复性均较好[34]。由于FDNB 与氨基结合牢固，该衍生产物相当稳定，是进行氨基酸柱前衍生的理想试剂[35]。
该方法的主要缺点是衍生化反应副产物二硝基苯酚与主要衍生物的保留时间相近，会对分离过程造成干扰，解决办法为控制衍生试剂FDNB 的加入量和改善分离条件。
该方法的特点是DABS-Cl 氨基酸衍生物在可
与见光区430nm 处的检测灵敏度可达1×10-12mol，
可避免使用荧光检测法灵敏度0.5×10-12mol 相近，
紫外检测时流动相中微量UV 吸收杂质的干扰。此外，该衍生方法简单、快速，衍生物极其稳定，在碳酸钠溶液中室温下可保持一个月以上[37]。
早期的DABS-Cl 衍生法由于生成的衍生物种类过多而不能用于对未知样品的定量分析。后来，Chang 等[38]通过控制DABS-Cl 与氨基酸分子比为4∶1～8∶1（mol/mol），改进衍生条件使氨基酸只生成一种衍生物，较好地解决了这个问题，检测限量可达亚pmol 水平。
2.8 6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）衍生法
AQC 与一、二级氨基酸均起反应（图8），衍生迅速，衍生物稳定，紫外检测灵敏度高(检测极限低于亚pmol 水平)。
H N
O O N
+H 2N
R COOH
N
H N H N COOH
2.6 1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺（FDNPAA）衍生法
FDNPAA 是一种新型手性衍生试剂，用于DL-氨基酸的衍生、分离效果良好。该反应（图6）的衍生产物在5h 内稳定，包括脯氨酸、光氨酸在内的20种氨基酸可在110min 内得到良好分离，采用340nm 紫外检测器可检测的极限量达50×10mol。该方法在衍生过程中不发生消旋化，且反应速率一致，分离效果好，能与其他物质达到基线分离，因此回收率高，稳定性、精密度、重现性、通用性均较好；主要缺点是衍生化试剂较为昂贵，且衍生时间较长[36]。
NO 2
O 2N
H
H 2N
2
H 2N
+
R H 2N
H
2N
NO 2
NH
COOH 2
-12
图8 AQC与氨基酸反应
另外该法不仅具有能与离子交换色谱法相媲美
的精密度和准确度，而且还不受样品基质、大量电解质、维生素和微量元素的干扰，特别适于天然生物样品、食品及饲料中氨基酸的分析[39]。此法存在的主要问题是：AQC 水解后产生的6-氨基喹啉有很强的紫外吸收，在常规水解氨基酸衍生物的峰前形成一个大的试剂峰并伴有拖尾现象，从而干扰了对天门冬氨酸、丝氨酸等氨基酸的测定。不过，此问题可通过优化流动相的pH 值和梯度洗脱程序得到了一定解决[40]。
2.9 2,4-二硝基氯苯（CDNB）衍生法
CDNB 有与FDNB 类似的硝基苯基团，因此其
其反柱前衍生和色谱分析条件与FDNB 法类似[41]，
图6 FDNPAA与氨基酸反应
2.7 磺酰氯二甲胺偶氮苯（DABS-Cl）衍生法
60
NO 2
O 2N
Cl +H 2N
R O 2N
Modern Scientific Instruments
NO 2
NH
COOH N o. 4 A u g. 2013
图9 CDNB与氨基酸反应
CDNB 法与FDNB 法相比，具有衍生试剂价廉易得、理化性质稳定、制备试样方便简单等特点。已
-醋酸盐缓冲体系梯度有报道[42]采用C 18柱和乙腈
洗脱方法，可将17种混合氨基酸及衍生剂水解物进行有效分离。
此方法衍生后的氨基酸一般在键合C 18柱上，根据液液分配原理进行分离。色谱流动相多以乙酸盐或磷酸盐缓冲液为主，以乙腈、甲醇或四氢呋喃为调节剂。由于该氨基酸衍生物仍保留着两性化合物的特点，故除改变调节剂之外，还可通过调节缓冲液pH 值、离子强度、柱温等使之达到理想的分离。当然，不同衍生物所选用的柱型、流动相以及氨基酸的洗脱时间和顺序不尽相同。该方法可用于分析蛋白质水解液、生理体液和食品等样品中的氨基酸。
3 总结
本文综合论述了氨基酸的一些分析方法（化学分析法、光谱分析法、电化学分析法、毛细管电泳分析法、色谱分析法），并且着重对氨基酸的柱前衍生-反相高效液相色谱法（RP-HPLC）的研究进展进行详细阐述，对不同的衍生化试剂的实验效果进行了讨论和比较，为日常的氨基酸分析提供了方法参考。
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