生物化学实验原理与技术
中国农业科学院研究生院 生物化学与分子生物学教研室
1999年 12月
目 录
蛋白质化学部分
SDS实验五 实验六 Western bloting
多酚氧化酶（PPO）的分离纯化„„„„4 多酚氧化酶（PPO）的活性测定„„„„8 考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度„10 聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量 及蛋白质的纯度鉴定„„„„„„„„12
等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点„„16 多酚氧化酶（PPO）的同功酶检测 „„19 免疫学部分
多酚氧化酶（PPO）抗体的制备„„„ 24 多酚氧化酶（PPO）扩散免疫电泳„„ 31 多酚氧化酶（PPO）火箭免疫电泳 „„33 技术„„„„„„„40 亲和层析法分离纯化胰蛋白酶„„„„44 核酸化学部分
实验一 实验二 实验三 实验四
实验七 实验八 实验九 实验十 实验十一
实验十二 植物染色体DNA的提取„„„„„„ 52 实验十三 质粒DNA的提取与纯化„„„„„„ 54 实验十四 DNA片断的酶切技术 „„„„„„„57 实验十五 DNA片断的连接技术 „„„„„„„59 实验十六 受体菌感受态细胞的制备„„„„„61 实验十七 重组DNA片断的转化、克隆及筛选„ 62
作 业
实验结束后按实验指导的格式写出实验报告，其中包括：实验目的与原理；材料与方法；实验结果与分析；实验结果讨论。实验结果照片、图表等要附在实验报告中。
蛋 白 质 化 学 部 分
实验一 多酚氧化酶（PPO）的分离、纯化
一、实验原理与目的
多酚氧化酶（儿茶酚酶），它是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，可参与植物生长、分化和种皮透性的调节。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶的活性与植物抗病有一定联系，植物免疫与动物免疫的机理不同，后者是抗体与抗原的关系，前者的免疫机理现在认为主要是产生对病源有害物质。已发现具有免疫作用的有害物质是多种多样的，概括为两种类型，其中的一种类型就是原有的有毒物质，植物本身含有的一些对病菌有抑制作用，使病菌无法在寄主中生长。很早就发现酚类化合物与抗病有明显的相关，例如原儿茶酸与儿茶酚对有色洋葱磷茎炭疽病菌的抑制作用。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用：
＋+醌2O
底物+酚2
但是PPO的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一，影响一些经济植物产品的质量。在制茶加工工业中这种酶有重要作用，在制茶时要立即杀青，防止多酚氧化酶的活性，避免醌类物质的产生，保持茶色清香。因此，许多学者对此进行研究，并从一些植物组织中分离纯化这种酶，研究酶的理化性质和生化特性。
本实验将采用马铃薯为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液；再经过阴离子交换柱DEAE
－纤维素DE－52柱层析、聚乙二醇反渗透浓缩、葡聚糖凝胶Sephadex G-200柱层析获得PPO的纯酶液；然后对其进行酶蛋白含量检测、酶活性测定、聚丙烯酰胺凝胶电泳和PPO同功酶的分析，以及通过免疫学的分析对多酚氧化酶（PPO）进行理化、生化特性进行鉴定。
通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离、纯化、鉴定的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离、纯化、鉴定的系统技术。
二、材料
（1）马铃薯（大约每小组100-200g） （2）试剂：
0.03M磷酸缓冲液pH6.0
（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯 吡咯烷酮）配制时配×10倍的浓缩液1000ml； 固体硫酸铵； 0.03M磷酸缓冲液pH6.0
（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）配制时配 ×10倍浓缩液100ml；
0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）配制时配×10 倍浓缩液1000ml； NaCl: 聚乙二醇：
DEAE－纤维素 DE52； 葡聚糖凝胶Sephadex G-200: （3）实验器械与仪器设备： 试管与试管架； 烧杯、玻璃搅棒； 移液管、滴管等； 试剂瓶；
透析袋： 过滤纱布； 层析柱；
植物组织匀浆器； pH计和pH试纸； 恒流泵； 梯度混合仪； 核酸蛋白检测议； GL－20C 高速冷冻离心机； DL－7A 大容量低速冷冻离心机：
三、方法与步骤 （1）粗酶提取：
水果肉组织按1:1（W/V）比例与0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆后4层纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。 （2）硫酸铵沉淀：
在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液再加入固体硫酸铵达到70％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清液，收集粗酶沉淀；沉淀用0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）溶解，装入透析袋中用0.02M KCl溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。
（3）DEAE－纤维素DE 52离子交换柱层析（DE 52的材料处理、装柱方法、层析方法和原理见实验讲义附）：
选用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）预先将DE－52柱进行平衡，然后将粗酶液上柱，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱杂蛋白，再换用含NaCl（0.2-0.6 M）的
0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA） 进行梯度洗脱；收集PPO
活性部分洗脱液，采用聚乙二醇反渗透法浓缩酶液2倍供羟基磷灰石柱层析用。
（4）葡聚糖凝胶Sephadex G-200凝胶柱层析（Sephadex G-200凝胶的材料处理、装柱方法、层析方法和原理见实验讲义的第5页）：
用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）预先平衡Sephadex G-200凝胶,然后将酶液上柱，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。
实验二 多酚氧化酶（PPO）活性测定
一、原理与方法
PPO催化各种酚与02氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在 0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液pH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。
其方法是，在含有4ml pH5.8的0.2M磷酸二氢钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml 0.05M邻苯二酚溶液,在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液，反应5分钟，在分光光度计410nm处读取吸光值。在上述条件下，以A410读数，以每分钟增加0.01 OD值定义为一个酶活单位（U）。 二、材料 （1）样品：
多酚氧化酶粗酶液 硫酸铵沉淀组份 DE－52洗脱组份 羟基磷灰石洗脱组份 Sephadex G-200的组份 （2）底物：
邻苯二酚：0.01M邻苯二酚溶液 （3）反应体系：
0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液pH5.8 （4）器皿与仪器： 试管、恒温水浴等 分光光度计
三、酶蛋白的比活性
比活性＝酶活单位（U）/mg 酶蛋白
四、记录实验结果
（1）结果列表
多酚氧化酶的提取、分离、纯化表
（2）根据实验结果绘制DE－52和G－200的柱层析洗脱曲线图。
实验三 考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度
一、实验原理与目的
生物化学实验中，经常需要测定蛋白质的含量，一般常用的蛋白质测定方法有紫外吸收法，双缩脲法和Lawry法等。另一种方法是蛋白质－染料结合法，即考马斯亮蓝G－250法。此方法试剂简单、经济。测定简便快速。具有与Lawry法相当的灵敏度，受溶液中其他物质的干扰很小，可采用对照来消除。
考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度的基本原理是：当考马斯亮蓝G－250染料与蛋白质结合时，其存在两种不同颜色（红色与蓝色），红色就转变为蓝色，使染料的最大吸收峰从465 nm移动到595 nm，染料与蛋白质的结合与595 nm的吸收值在一定蛋白质浓度下呈线性相关，其蛋白结合反应在2－3 min内即可完成，而反应生成的复合物在1 h内比较稳定地存在于溶液中，因此，用标准浓度的蛋白测得O.D595值绘制标准曲线，即可求得待测样品的蛋白质浓度。
二、材料与方法 1.材料：
经硫酸铵沉淀获得PPO粗酶液，DEAE－纤维素DE 52分离的酶液和Sephadex G－200分离纯化的酶液样品。 2.仪器与器皿：
分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管和试管等。 3.试剂：
（1）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂：
称取100 mg考马斯亮蓝G－250溶于50 ml 90％的乙醇中，加入85％（V/V）磷酸100 ml，最后加无离子水或蒸馏水定溶到1000 ml，此溶液可在常温下放置一个月。 （2）蛋白标准液：
称取牛血清蛋白100 mg定溶于100 ml的无离子水或蒸馏水中，制成1000 μg / ml贮备液。再配制成分别为20 μg/ml、40 μ g/ml、60 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml的蛋白标准液。
4.测定方法与操作步骤： （1）标准曲线的绘制：
0－100 μg/ml蛋白标准曲线：准确吸取0.5 ml含20、40、60、80、100 μg蛋白标准液，分别放入10 ml的试管中，加5.0 ml考马斯亮蓝G－250蛋白试剂，将溶液混匀，2 min后在分光光度计594 nm处测定其消光值，空白以无离子水或蒸馏水代替。以消光值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
100－1000 μg/ml的蛋白标准曲线的制作方法上述相同。
（2）样品中蛋白质浓度的测定：要求待测样品中的蛋白浓度范围为1－1000 μg/ml之间，若浓度过高时，需要对其进行适当的稀释，再用制作标准曲线的方法对样品进行测定，测定的O.D595值结果由标准曲线求出样品的蛋白质浓度。
实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质
分子量及蛋白质的纯度鉴定
一、实验目的与原理
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4 g的SDS，由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与所带电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量与电泳迁移率间的关系，可用下式表示： MW＝K（10 - K－为常数 b－为斜率 m－为迁移率
不同浓度的凝胶适用于不同蛋白质分子量范围，在5％的凝胶中分子量25000～200000的蛋白质；在10％的凝胶中，分子量10000～70000的蛋白质；在15％的凝胶中，分子量10000～50000的蛋白质，其分子量的对数与迁移率呈直线关系。因此，所测分子量范围要选择最适合的凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标志蛋白。
本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及其分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。
二、材料与方法
－b m
）
MW－为蛋白质分子量
1.材料：
硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品； DEAE－纤维素 DE 52 柱层析的样品；Sephadex G－100柱层析的样品。 2.试剂：
（1）丙烯酰胺（Acr）凝胶贮液： 30g Acr,668mg Bis,加水至100 ml。 （2）10％的SDS溶液 （3）10％的过硫酸铵溶液 （4）四甲基乙二胺（TEMED） （5）分离胶缓冲液：
将18.15 g Tris溶解后，加5 ml 6 N HCL溶液，定容至100 ml，pH 8.8。
（6）浓缩胶缓冲液：
6 g Tris溶解后，加10 ml 6 N HCL溶液定容至100 ml，pH 6.8。 （7）电极缓冲液：
6 g Tris,28.8 g甘氨酸和1 g SDS，加水溶解定容至1000 ml，pH 8.3。 （8）样品缓冲液：
1 g SDS，2 ml 巯基乙醇，5 ml甘油，1 ml 0.1％的溴酚蓝，1 ml 上层胶缓冲液，定容至50 ml。 （9）染色液：
0.25 g 考马斯亮蓝250，溶于含有45％的甲醇，10％的冰醋酸的水溶液中。
（10）脱色液：
7.5％的冰醋酸和10％的甲醇水溶液。 （11）已知分子量的标准蛋白。 3.仪器设备：
电泳仪，垂直电泳槽等。 4.实验方法与步骤： （1）凝胶制备：
用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（注意不能漏胶），垂直放置。将下表列出的的配方，配成分离胶溶液，立即倒入垂直槽，并慢慢加入无离子水，将凝胶液面压平，20 min后凝聚。倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒人按表配成的浓缩胶，再插入梳子。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制（10％）分离胶
浓缩胶
（2）点样：
分别取样品0.1 ml于离心管中，各加入0.1 ml样品缓冲液，在沸水浴中加热2 min，取出待用。将电泳槽接通电源，调节控制器电流达到5 mA。用微量注射器分别吸取0.1 ml不同浓度的标准蛋白样品和实验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流升到15 mA，当溴酚蓝进入分离胶将电源加到28～30 mA（2～3 mA/em）,保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1～2 cm时，即可停止电泳。
（3）染色：
电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温1 h。倒掉染色液，用脱色液，用脱色液脱掉剩余染料后，倒人脱色液第二天换一次脱色液，24 h后，即可看到清晰的蛋白质条带。 （4）蛋白质迁移率的计算，并与标准蛋白比较： 蛋白质迁移率Rm ＝d2 /d1 d1—溴酚蓝迁移率距离 d2—蛋白质迁移率
以标准蛋白迁移率为横坐标，以其分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，可得标准曲线，并估计未知样品蛋白的分子量。
实验五 等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点
一、实验目的与原理
蛋白质分子在电场中的迁移性质早就用来分离和鉴定蛋白质。但常规的电泳用于受介质成份，pH和离子强度的影响，其分辨率受到限制。而且用蛋白电泳时的迁移率来表征蛋白质的特征并非对所有蛋白质都合适。等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦实质是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。 在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。因此，这些分子总会是出于不断扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。 IEF技术的关键是得到一定范围的稳定的pH梯度，即找到合适的两性载体。根据氨基酸的两性电解质的特点，最初有人用组氨酰组氨酸溶液，但其pH范围很窄，应用受到限制。1969年，Vesterbery合成了一系列脂肪酸族聚氨基聚羧基的异构物，这些异构物具有不同的pK和pI。在pH 3－10的范围内构成了一个连续的系列。通过改变电性基团的成份与数量，可以得到各种pH范围的两性载体。其商品名为“Ampholine”，“Pharmalyte”等。 IEF目前已可区别等电点仅差0.01单位的成份，这样高的分辨率用一般电泳和离子交换层析技术是达不到的。因此，IEF是鉴定电荷不均一性的，通报是区别非常相似的分子的理想方法。另外，由于经过IEF的分离，能够使相同pI的分子都浓缩到一个区带，因而可用于蛋白质的制备。 IEF所使用的抗对流介质最早主要是用蔗糖梯度，这种系统耗时多，操作麻烦。因此，现在多采用聚丙烯酰胺或葡聚糖凝胶在抗对流介质，前者用于分析IEF和少量样品的制备，后者用于制备。应用凝胶等电点聚焦法不仅能测定两性电解质的等电点，而且能将具有不同等电点的混合物质进行分离鉴定。
通过实验了解等电点聚焦电泳的原理，学习和掌握蛋白质凝胶等电点聚焦电泳的方法技术，为学习掌握双向电泳技术打下良好的基础。
二、材料与方法 1.材料： 蛋白样品 2.试剂：
聚丙烯酰胺、甲叉聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP－40、 triton x-100、1M 磷酸、1M氢氧化钠、磺基水杨酸、 三氯乙酸、考马士亮兰 R－150、乙醇、冰乙酸 3.方法与操作步骤： （1）样品制备：
用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。
（2）制模具：
洗净两块IEF专用玻璃板，取一块IEF专用塑料垫板，确定好疏水和亲水面。在厚玻璃板放上塑料垫片，亲水面朝上，在垫板两边放上夹条，再在上面小心盖上簿玻璃板，玻璃板疏水面朝下。夹子夹好。 （2）配胶：
按配方混合胶溶液，抽气，加入TEMED。 （3）灌胶：
配好的胶迅速灌入模具。 （5）电泳：
等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面上任意位置放上小擦镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，恒功率25W电泳，约10分钟后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约30分钟，待电流达4mA以下，停止电泳。
（6）固定：取出塑料片，放入固定液中15分钟
（7）染色：取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至条带出现。 （8）干燥保存。
实验六、多酚氧化酶同功酶分析检测
一、实验原理
同功酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成及分子量却有所不同的一组酶。由于蛋白质分离技术的发展，特别是凝胶电泳的应用，使同功酶可以从细胞提取物中分离出来。这类酶由两个或两个以上的肽链聚合而成，它们的生理性质及理化性质，电泳的行为都是不同的。由于酶分子的大小、构象、所带电荷的不同，在一定条件下，在电场中泳动的方向速度各不相同，分离出不同的区带，因此通过凝胶电泳的图谱可对同功酶进行分析。本实验将提取的PPO进行电泳分析，并观察PPO同功酶电泳图谱。
二、材料： （1）样品：
硫酸铵沉淀的PPO粗酶样品和G－200纯化的样品 （2）PPO同功酶染色液：
1％邻苯二酚、0.05 M 磷酸缓冲液pH6.8、o.o6％对苯二胺溶液（用0.01 N 草酸配制）以3:1:1的混合液。
（3）电泳所需材料仪器设备参见实验讲义的凝胶电泳实验部分。
三、方法步骤
电泳方法与实验四的操作方法相同。
PPO同功酶的染色方法：将电泳完毕的凝胶放入染色液中1－2h，然后用乙醇:水:醋酸（10:15:15）溶液洗脱，至出现棕色谱带。其他凝胶电泳的制胶、上样、电泳等操作见实验讲义的凝胶电泳部分。
四、作业：画出PPO的的同功酶图谱。 附：
一、凝胶层析法 1.原理
凝胶层析法（gel chromatography）有几种名称，如凝胶过滤（gel filtration）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶透析层析（gel permeation chromatography）等。它的基本原理是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶本身是一种分子筛，它可把分子按大小不同进行分离，好象过筛一样，将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使其充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子进入到凝胶内部，流速较慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离纯化。
具有分子筛作用的凝胶主要有：葡聚糖（商品名为Sephadex G系列）、琼脂糖（商品名为Sepharose系列）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名Bio－gel）等。
2.柱材料的处理
称取一定量的Sephadex G－200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀24 h－36 h，去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止，凝胶材料就处理好了。 3.装柱方法
将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2 cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白检测议，待层析柱的平衡。 4.层析柱的平衡方法
在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的
溶液用层析过程中的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5－1 ml/ min，当下出口流出液的pH值与平衡缓冲液的pH值一致时，层析柱达到了平衡。
二、离子交换层析法 1.原理
离子交换作用一般是在固相和液相之间发生的可逆离子交换反应，利用这一反应可以分离各种可解离的物质。固相部分称为离子交换剂，其母体为不溶性高分子物质，如树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖或无机聚合物等，在其母体上连接了若干可解离的活性基团，分为强酸型、弱酸型、强碱型和弱碱型，因此它可吸附带正电荷的或带负电荷的被分离物，通过改变洗脱液的pH值或改变离子强度使被分离物得到分离纯化。
蛋白质分子也是两性物质，所以从机理上讲，离子交换层析法同样用于蛋白质组份的分离纯化。
2.DEAE－纤维素 DE 52阴离子交换剂材料的处理
本实验采用的是DEAE－纤维素 DE 52弱碱型阴离子交换剂，处理方法采用两步进行。第一步将DE 52阴离子交换剂干粉浸泡在0.5 N的HCL溶液中1－2 h，用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或pH 4以上，并将其在抽滤漏斗中抽干；第二步是将抽干的离子交换剂浸泡在0.5 N的NaOH溶液中1－2 h，再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性，这样离子交换剂材料就处理完毕，待装柱和层析柱的平衡。
DEAE－纤维素 DE 52阴离子交换剂的装柱方法和层析柱的平衡方法与Sephadex G－200材料的处理方法相同。
三、硫酸铵饱和度常用表
1.调整硫酸铵饱和度计算表（25℃）
硫酸铵终浓度（％饱和度）
2.调整硫酸铵溶液饱和度计算表（0℃）
在0℃硫酸铵终浓度（％饱和度）
免 疫 学 部 分
实验七 多酚氧化酶（PPO）抗血清的准备
一、实验原理
高等脊椎动物具有由大、小吞噬细胞，T，B，K淋巴细胞，抗体，补体等组成的体液免疫系统和细胞免疫系统。当外来的抗原物质进入机体后，即可产生细胞免疫和体液免疫，发生保护机体的特异性免疫反应。因此，制备抗血清一般都选用哺乳动物如兔、羊、鼠、马、驴、猴等做免疫动物，也可选用鸡、鸭等禽类或蛙等冷血动物做免疫动物。选择的动物与抗原来源的生物必须是异种的，种属相差愈远，抗原物质使机体产生的能力愈强，反之则弱。作为免疫用的动物其大小／性别／年龄要适合。年龄太小时免疫系统发育不全；年龄太大免疫系统机能衰退，这些都影响抗体的生成。个体尽可能大一些，个体太小不能获得足够的抗血清，因此，实验室一般选用年轻成熟、体重2.5-3kg、耳朵大、静脉粗、健康的雄性白兔做免疫动物。
抗原进入机体有多种途径。例如注入肌肉、皮下、皮内、淋巴结、静脉、腹腔和足掌等，经常采用的是肌肉或静脉注射。但病毒和加有多种化学物质的抗原不宜静脉注射。免疫途径一次不应超过两种。同一途径应采取多点注射，一般每个注射点的抗原剂量不应超过0.5ml。
抗原进入机体后不能马上引起产生抗体，而是要经过一段潜伏期（长短视抗原而异，如病毒抗原只需3-4天，蛋白抗原约一周左右），然后才有血液中出现抗体。开始产生的抗体滴度较低，维持时间短。必须给予第二次以至多次免疫才能产生持久的高滴度的抗体。在第二次注射抗原1-2天后，抗体水平显著提高，不久可达到比第一次高10-50倍的高峰，并可以在较长时间内维持在一个较高水平上，数月后才缓慢下降。采血后，如不再注射同样抗原，机体产生抗体的能力会日渐下降，但动物在休息一段时间，如2-3月后，再次注射同样的少量抗原，抗原含量又会很快上升，重新获得高价抗血清。这种现象称为免疫记忆或回忆。
抗原的注射量应该根据抗原的类型和动物的情况而定。一次注射剂量
过大，会产生免疫麻醉；太少则不能刺激机体发生免疫反应。多次低剂量注射也会免疫麻醉，其结果比一次大剂量造成的还要严重。因此，每次要注射合适剂量的抗原。一般蛋白质抗原以每千克动物体重0.5-2mg为宜。
在注射的抗原中，常常加入一些能增强其抗原性的物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂，其作用是延长抗原在体内存留的时间，同时刺激网状内皮系统，增强抗体的形成。佐剂分为福氏佐剂（Freund’s adjurant）和明矾佐剂。福氏佐剂较常用，其成分是灭菌的石蜡油和羊毛脂，二者的比例因情况而定，常用羊毛脂：石蜡油=1:4。佐剂又分为完全和非完全两种。佐剂中加入分枝杆菌如卡介苗、酐菌及结核菌。卡介苗的用量为3-4mg/ml佐剂）的称为完全佐剂，不加的称为非完全佐剂。
二、材料与器材 1、家兔：2.5-3kg
2、抗原：蛋白质（根据实验内容而定，本实验采用纯化的多分氧化酶） 3、羊毛脂（灭菌） 4、液体石蜡油（灭菌） 5、注射器、针头 6、乳体
三、操作方法 1、佐剂抗原制备：
取取羊毛脂1g，石蜡油5ml，混合。高压灭菌后，置4℃保存。使用前取所需数量置于乳体中研磨，待均匀后，边磨边滴加等体积抗原溶液（完全佐剂按3-4mg/ml加入卡介苗），继续研磨至成乳剂（滴于水内完全不扩散）为止。除上述乳化方法外，还可以用一支注射器装抗原溶液，另一支装佐剂，二管用塑料管连接，然后二者此推彼吸，反复两次，直至完全乳化为止。另外还可以用玻璃匀浆器乳化。 2、实验动物：
家兔，应预饲3-4天，令起适应环境，体检健康，才可开始免疫。 3、免疫：
吸取乳化好的抗原液进行皮内多次点注射，背部24个点，每点0.05m 四肢内侧8个点，每点0.15ml。共注射约2.0mg蛋白质抗原。1周后进行第二次加强免疫（剂量为0.5mg），采取背部和四肢内侧多点皮下注射。以后每两周再加强一次，共两次，剂量为1.0mg。
第一次注射为完全福氏佐剂，以后只注射不福氏佐剂。 4、抗血清准备：
在第四次加强免疫后可作为抗血清效价测定。从兔耳静脉采血，以试管沉淀法或双扩散法测定。双扩散法测定滴度（效价）为1:32时即可放血准备抗血清。将血液收集于灭菌试管中，作斜面，在室温放置1小时（或37℃水浴中30min）左右，以3000r/min离心10min，取其血清。根据实验需要按等级分成许多份装于小瓶内，于-20℃冰箱中保存。用时按需要取出。抗血清切忌反复冻融，以免降低其效价，也可将血清冷冻干燥成干粉，存放于4℃冰箱中。
三、抗血清效价及纯度测定 1、原理：
准备的免疫血清，必须进行效价（滴度）测定和纯度的鉴定，只有达到要求方能使用。免疫血清的效价是指它与一定量抗原作用时，出现肉眼可见沉淀反应的最大稀释度。它是免疫血清有效的量度。 测定抗血清效价的基本原理是：
抗原-抗体特异性结合所产生的沉淀反应。只要将可溶性抗原与相应抗血清混合，当两者比例合适，并有适合浓度电解质存在时，抗原-抗体既形成抗原抗体复合物，达到最大比例时，即形成肉眼可见的沉淀析出。解释沉淀形成的格子论学说（Lattice theory）认为，抗原是多价的，即可结合多个抗体分子；而抗体是双价的，只能结合俩个抗原分子。因此，抗原-抗体的结合可表现不同数量的关系。只有抗原、抗体两者的比例合适时，才会形成抗原抗体复合物而出现明显的沉淀。
抗原、抗体结合的过程可分为三种状态：
将比例最合适而出现沉淀的状态称为抗原-抗体等价区（Antigen-Antibody Equivalence Zone）。比例不合适，抗原或抗体过剩时，则有未结合的抗原或抗体游离于上清夜中，不能结合形成足量的抗原-抗体复合物，此时出现沉淀量少或不发生沉淀，这种状态，前者（抗原过剩）称为抗原过剩区，后者（抗体过剩）称为抗体过剩区。
抗原-抗体形成沉淀，除抗原、抗体的比例外，也受离子强度、pH和温度的影响。抗原、抗体反应介质的离子浓度在超过0.15mol/L时，随着盐浓度的增加沉淀形成量将逐步减少。介质的pH一般在6.5-8.6范围内时都能形成沉淀。一般说看透、抗原、抗体混合后条件合适时沉淀随即发生，但需在37℃放置30-60min才能看到沉淀，通常在冰箱贮存24小时后更能沉淀完全。
在免疫扩散法中，沉淀形成的快慢取决抗原、抗体的扩散速度，因此反应时间是由影响扩散的因素决定的。抗原-抗体的结合是相当稳定的，但也有可逆性质不变。当两者比例合适时，仍可以结合生成复合物。
抗血清中含有抗体，只与某一种抗原产生沉淀反应的抗血清称为单价血清。有些抗血清含有多种的抗体，能与多种抗原呈沉淀反应，称为多价抗血清，所发生的沉淀反应称为交叉反应。抗血清的纯度就是抗血清的单价性。
2、抗血清效价测定方法：
测定抗血清效价是应用一系列连续稀释的抗血清，与固定量的抗原进行反应，观察仍能出现沉淀的最大稀释度，此即为抗血清的效价（滴度）。沉淀反应可以用试管沉淀或免疫双扩散法检测。对于一种抗血清，测定效价的方法只能选用其中的一种，而不要交叉运用。 （1）试管沉淀法
在试管架中排放12-18支洗净、干燥的试管；
取准备好的抗血清0.5ml放入第一支试管中，加等量的生理盐水稀释，充分混匀。取出0.5ml放入第二支试管，加入等量的生理盐水稀释，充分混匀。取出0.5ml放入第三支试管，再加等量的生理盐水，如此不断稀释下去，
最后一管在充分混匀后，取出0.5ml弃去；
在每支稀释的抗血清试管中，加入0.5ml抗原溶液（1mg/ml），充分混匀；
将试管放入37℃水浴中，保温一定时间（约4-6小时）或置于冰箱中过夜。观察不再形成抗原-抗体沉淀反应的是哪一管，抗血清的效价（滴度）就由前一管的稀释度计算。例如，测定中是11管不再发生沉淀反应，那么此抗血清的效价则为1:210(1:1024)。 （2）免疫双扩散法：
免疫双扩散法是由Ouchterlong建立的，因此又称为Ouchterlong法。其主要原理是分子量在200000道尔顿以下的可溶性抗原和抗体能在琼脂或琼脂糖凝胶中，相向进行扩散时，当抗原和抗体相遇，其比例及反应条件合适，浓度大到又足形成肉眼可见的凝集复合物时，即在凝胶中呈现出沉淀线或弧。如果抗原和抗体无关时，就不会产生沉淀线。所以此法可用于以特异性抗体鉴定抗原或以已知抗原鉴定抗体。
抗原和抗体反应形成的沉淀线，具有免疫特异性屏障作用，能阻止该种抗原和抗体进一步扩散，但不妨碍其他抗原和抗体的扩散。这种选择性的渗透作用可以用来鉴定两种以上的抗原和抗体。因为每对成分相遇时都各自形成沉淀线而不相互干扰，所以从沉淀线的数目即可知这个系统中存在的抗原和抗体的最低数目。由图可以看出双扩散时不同抗原抗体形成的不同沉淀线。
图（1）是在双扩凝胶板上的一个凹孔中含有抗原A，另一个凹孔中含有相应抗体（Anti-A），经双扩反应后即可观察到沉淀线。图（2）是凝胶板上两个凹孔中含有相同的抗原A，下凹孔中含有相应的抗体（Anti-A），扩散反应后形成彼此重叠的沉淀线或抗原性相同图形。图（3）是在凝胶板上两凹孔中加入含有两种不同的抗原成分，其中一个抗原含有两个抗原的组分（A-xy和A-x），下凹孔中加入的抗血清含有抗上述两种抗原的特异性抗体（Anti-x和Anti-y），扩散反应后能形成部分融合的沉淀线。图（4）是在凝胶板上两凹孔中含有两种不同的抗原（抗原A和B），下凹孔中含有抗原A和B的两种特异性抗体，扩散反应后能形成了相互交叉的沉淀线或抗
原性相异图。图（5）是在凝胶板上两凹孔中含有不同的抗原混合液（A+B和B+C），下凹孔中含有各种抗原组分的特异性抗体（Anti-A，Anti-B，Anti-C），扩散反应后能形成多种的沉淀线和抗原性相同或抗原性相异的综合图形。
图1 图2 图3
图4 图5
对扩散中形成的不同沉淀线示意图
以上这些反应都是在各个凹孔中抗原抗体溶液浓度大致相同的情况下出现的，如果有差异则沉淀线会有所不同。沉淀位置的偏移主要与抗原抗体的比例有关，若抗原量相对多一些则偏向抗体孔，反之偏向抗原孔。
免疫扩散法，样品用量少，操作简单，反应灵敏。蛋白质样品含量很低，而且其它方法难以检测的都可以用此方法测定。 3、试剂与器材
（1）0.1mol/L，pH8.6（离子强度0.05mol/L）巴比妥-巴比妥钠缓冲液巴比妥钠10.3g，巴比妥1.84g溶解后，定溶至1000ml。 （2）琼脂或琼脂糖。 （3）0.9%（W/V）NaCl溶液。
（4）抗原、抗血清。
（5）载玻片7.5cm×2.5cm，洗净干燥。 （6）打孔器，直径3-4mm。
（7）染色液：称取氨基黑10B（Amido Black 10B）0.5g溶于冰醋酸：甲醇+1:9的混合液内（V/V）。
（8）洗脱液：冰醋酸：甲醇+1:9的混合液内（V/V）。 4、操作方法
（1）0.1%琼脂的准备：
称取1.32g琼脂或琼脂糖置于三角瓶中，加入蒸馏水60ml，沸水浴中热溶解（直火加热煮沸底部琼脂易变焦）。然后加入60ml0.1mol/L，pH8.6巴比妥缓冲液，混匀，在56℃水浴中保温备用。 （2）琼脂板准备：
取1片洗净干燥的载玻片，放置在水平台上。用吸管取3ml溶化好的琼脂液（56℃左右），控制六上流速放于载玻片的中央，让溶胶自然分布于整块载玻片上，冷却后即成凝胶板。用打孔器在凝固的胶板上按图打孔：孔的直径3-4mm，孔距为5mm。打完孔用针头将孔中琼脂挑去。 （3）稀释抗血清：按试管沉淀法操作。 （4）加样和扩散：
将稀释好的抗血清依次加入外围凹孔内，分别为1:21，1:22，1:23，1:24，1:25，1:26„„（记录顺序）。在中央凹孔中加入抗原（1mg/ml）。加入孔中的抗原、抗体量与凝胶表面平齐为宜。加样后将载玻片放置在一个培养皿内，其中放两层湿纱布以保持一定的湿度。大培养皿放置于37℃水浴或放入冰箱中扩散，几小时或过夜后，即可观察白色沉淀线。出现沉淀线的孔既为免疫扩散的抗血清效价。
双向扩散图
（5）染色及保存：
为了提高沉淀线的可见度和保存标本，可进行如下的染色处理。
漂洗琼脂板：在沉淀线形成后，将琼脂平板浸泡于0.9%NaCl溶液中， 持续48小时，每天换2-3次NaCl溶液，洗去未结合的抗原和抗体蛋白 质；
干燥：浸泡清洗后，用一定大小的滤纸经蒸馏水湿润后覆盖在琼脂平板上，并于℃恒温箱中干燥。然后用蒸馏水湿润，从干透了的琼脂板上剥去滤纸。
染色：将干琼脂板置于培养皿中，加入10%醋酸，浸泡10min。弃去醋酸液后，染色60min。再用脱色液脱色。脱色液每隔15min换一次，直至无染料洗下为止。
（4）抗血清纯度鉴定：
检测抗血清的纯度（单位性）常用的方法是交叉试验。即在双扩散实验中，改换抗原成分，这种抗原的性质很近似产生抗血清的抗原。当在双扩散试验中，这种抗原能于抗血清产生沉淀反应时，称为有交叉反应。说明抗血清部不纯，不是单价抗血清。若这种抗原与抗血清不产生沉淀反应，则称为无交叉反应，说明抗血清较纯。如双扩散法试验说明：兔抗猪生长激素的抗血清，与羊生长激素有交叉反应说明猪、羊生长激素具有同源性，且亲缘关系较近。抗血清的纯度还可以用免疫电泳法测定。
实验八 多酚氧化酶（PPO）扩散免疫电泳
一、实验原理
免疫电泳是将电泳与免疫双扩散法相结合的技术。其基本原理是先将蛋白质抗原在琼脂板上进行电泳使之分成许多组分，然后再用特异性免疫血清向蛋白质各组分进行扩散。当抗原、抗体相互扩散相遇且比例适合时，即可形成不同的沉淀线。
免疫电泳法是鉴定蛋白质的重要方法之一，其法简单易行，分辨率很高，如血清蛋白质分析中，只需要极少量的血清，经电泳后即可分离出近15-20种蛋白质组分。在电泳分离之后，需要鉴定其中的成分，如清蛋白，只要用特异性清蛋白的免疫血清进行免疫扩散反应，若样品中有清蛋白即可显示出沉淀线来。
二、实验试剂材料及器材
（1）1.5%琼脂：配制方法免疫双扩散法
（2）抗原、抗体
（3）0.1m0l/L，pH8.6巴比妥盐缓冲液，同免疫双扩散法。
（4）染色及脱色液：同免疫双扩散法。
（5）7.5cm×2.5cm载玻片
（6）打孔器，直径4mm
（7）挖槽刀，在厚1mm的硬纸片两边夹子固定两叶刀片。
（8）电泳仪
三、操作方法
（1）载玻片的准备：
所用载玻片应用硫酸洗液浸泡，以水冲洗至无酸为止，贮存于75%的乙醇内，用前擦干而不要留下布毛，做到洁净无油腻。
（2）琼脂板准备：
将洁净的载玻片放置在水平台上，用吸管吸取3ml准备好的1.5ml琼脂板（56℃），匀速放于载玻片的中央，使胶液覆盖于载玻片上，要均匀平整，不带气泡。待凝固后，放入有湿纱布的大培养皿内，贮存于冰箱备用，琼脂平板最好在使用前24小时内准备。使用时取出，用打孔器和挖槽刀打孔和挖槽。也可以将预制好的有机玻璃条放在载玻片的中央，再将琼脂胶
液放于载玻片上，待冷凝后，取出有机玻璃条，即形成一条槽，即扩散槽。
（3）加样：
用微量进样器取待测蛋白质溶液（血清样品大约10l左右），放入凹孔内。
（4）电泳：
将凝胶板（随同载玻片）放入电泳槽，两边电极槽中加入0.1mol/L pH8.6巴比妥盐缓冲液。用三、四层纱布或滤纸作桥，连接电极缓冲液和琼脂板。盖上电泳槽盖。接通电源，调节电压为6V/cm（共约45V左右），电泳40-60min。断电后取出琼脂板胶。
（5）免疫扩散：
取出琼脂胶板后，将扩散槽中的琼脂或预先放的有机玻璃条出去，用微量进样器取适当稀释的抗血清（预先经试验确定），加到扩散槽内（大约需50l）。然后将琼脂胶板放在湿润的大培养皿内，在室温或冰箱中扩散24小时，观察其沉淀线的生成。
（6）结果处理：
直接照相记录沉淀线或用染色法（见双扩散法）观察和保存。
实验九 多酚氧化酶（PPO）火箭免疫电泳
一、实验原理与要求
在适当的免疫条件下，给某种动物注射外源蛋白质，一定时间以后，在该动物（免疫动物）体内发生免疫反应，血液里就产生免疫球蛋白（Ig），外源蛋白质称为抗原。产生的免疫球蛋白称为抗体。这种抗体与诱导产生该抗体的抗原，有特异性结合的特征——特异性免疫沉淀。定量免疫电泳（又称火箭免疫电泳）就是基于抗原在含有抗体的凝胶中进行电泳移动，与相应的抗体在比例合适时形成特异性沉淀，不同的抗原-抗体形成各自的特异性沉淀，而沉淀一般以峰的形式出现。这种沉淀峰的面积，或峰高与抗原-抗体之比，在一定浓度范围内呈线性关系。
控制好一定条件，使大多数抗体分子在凝胶中不移动。而当具有不同迁移率的龛影分子移动时，一开始与之有特异结合的抗体也跟着抗原在凝胶移动。但随着时间的推移，在抗原上结合到的抗体分子越来越多。移动到某一距离达到合适的比例时，就产生特异性的免疫沉淀。这一点通常称为等价点（equivalence point）。一旦出现沉淀，即使再继续电泳，沉淀的位置将不再改变。但是，将会有更多的抗体与之结合，使沉淀变得清楚。
沉淀峰的面积与这个电泳体系中抗原和抗体的浓度有关，其关系如下：
沉淀峰面积+K×抗原的浓度/抗体的浓度
K：在标准量免疫电泳中测得的系数
因此，可以控制抗体浓度保持恒定。通过在标准量免疫电泳中得到的沉淀峰面积以参考溶液中蛋白质的面积作比较，然后得到一个特定蛋白质的免疫定量。
定量免疫电泳（又称火箭免疫电泳）的基本条件：
在电泳时，抗体不移动。这样，在整个电泳过程中移动抗原周围的抗体分布始终是恒定不变的。因此，要满足这样一种特定的环境，通常的电泳分离应在pH8.6的条件下进行。因为只要在这个pH条件下，几乎所有的蛋白质都带有负电荷，并向阳极移动。而作为抗体的-球蛋白虽带有少量负电荷，也要向阳极移动。但如果采用1%琼脂糖来代替琼脂，则其电渗作用能有效地抵消向阳极移动的力，最终达到使抗体在电场中不移动的目的。
一般来说，只有那些具有向阳极移动速度较快的蛋白质，才能用免疫电泳进行定量检测。但等电点pI接近8.0的一些蛋白质，就难以用定量免疫
电泳进行检测定量。原因是，在pH8.6的条件下，进行电泳，这些蛋白质的移动距离很小，无法准确定量。为解决这个问题，可以用价甲酰化、乙酰化或氨甲酰化进行处理，使这些蛋白质带有更多的静负电荷。这样就能在pH8.6的条件下，加快向阳极移动的速度，达到准确定量的目的。
酰化反应的常用条件是：
蛋白质样品溶液0.3%甲醛稀释到分析所要求的浓度后，置室温反应20-30min。其反应式为：
H H COOH H COOH
C=O + N-CH-R C=N-CH-R + H2O
H H H
这个反应抑制了蛋白质中氨基的解离。因此，这可增加蛋白质解离的静负电荷数。
二、常规定量免疫电泳（火箭免疫电泳）的方法
常规定量免疫电泳，又称火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis），因为样品是从一定大小的起始凹孔中朝一个方向移动，形成的抗原-抗体的沉淀峰形似火箭而得此名。在一定的浓度范围内，形成的沉淀峰高与所加的样品浓度呈正比。一般沉淀峰高在5-60mm之间时，定量比较正确，测定的精度一般超过95%。这个方法要求使用单价抗血清。如果达不到单价的要求，则测定的精度就会相应降低。
如果有特异的抗血清，大多数蛋白质均可以用这个方法进行检定。定量准确与否，依赖于抗血清的有效程度。只要在得到纯物质时，测定出的浓度才是真实可信的。
在pH8.6的环境中，带有负电荷的一些蛋白质可以很方便地用这个方法进行测定。但是，对于那些带有正电荷的，或静电荷为零的蛋白质，就不适于应用这个方法。例如：免疫球蛋白（Ig），在pH8.6时，静电荷几乎等于零。因此，如果要将免疫球蛋白（Ig）作为抗原来定量测定必须经过处理，使其增加静电荷后，才能用这个方法对其进行检定。经常使用的处理
方法是前面提到的乙酰化、甲酰化或氨甲酰化。
1、火箭免疫电泳所需的试剂
（1）电泳支持介质必须是琼脂糖：
一般配制成1.5%的浓度并分装成若干小瓶，每瓶约30ml。使用时将小瓶置于沸水中，使琼脂糖熔化，并保持在52℃水浴中备用。
（2）缓冲溶液：
常用的缓冲溶液为0.2mol/L，pH8.6的巴比妥缓冲液。配制方法是：206g巴比妥钠+40g巴比妥酸，用蒸馏水定溶到1000ml。如有必要，可加10g叠氮钠，或加10ml的5%麝香草酚的异丙醇溶液作防腐剂。这样配制的缓冲液为贮备液。
用于电泳：将上述贮备液稀释6倍成0.02mol/L，pH8.6 。
用于制板：将上述贮备液稀释3倍成0.04mol/L，pH8.6 。
（3）染色溶液和脱色溶液：
a.0.5%考马斯亮蓝
b.1%氨基黑10B
两者用甲醇：水：冰醋酸（45:445:10）混合液作溶剂配制。该溶剂也是脱色剂。
（4）抗体（抗血清）
家兔或羊的抗血清常可用于定量免疫电泳，如果要得到精确的结果，必须使用单价抗血清。
2、火箭免疫电泳操作方法
（1）电泳板的制备：
火箭电泳可以在大小不同的玻璃板上进行。但是使用的似乎是8×8cm和20×10cm两种尺寸。铺在玻璃板上的凝胶厚度一般在1-2mm之间，最适厚度为1.5mm，太厚或太薄均会影响定量的准确性。
对于8×8cm的板，需用5ml的1.5%(W/V)的琼脂糖与等体积含有一定量某种价抗血清的0.04mo0l/L巴比妥缓冲溶液混匀，趁热铺在玻璃板上，待冷却凝固后使用。抗血清的准确用量应该预备实验决定。即加入不同量的抗血清，用一定量的抗原进行火箭电泳，选出沉淀峰高在2-5cm之间的相应
的抗血清浓度，就是最适的抗血清用量。一般在50-100l之间。
如果实验室温度较低，制板时玻璃板需预热保持一定温度。在玻璃板上上倒凝胶溶液时，必须小心避免混入气泡。
琼脂糖凝胶大约15min后凝固。因此，在这一段时间内玻璃板必须始终保持水平位置。胶凝固后，在板的一端约1cm处用打孔器打孔，作为样品电泳时的起始位置。应按照事先画好起始孔位置以及孔间距离的样板进行打孔，借以保证起始孔位在同一直线上，并具有相同的孔间距离（一般为5mm）。
起始孔大小决定于样品用量。一般的关系是，直径1.7mm的孔可加样2l，2.5mm直径的孔可加样5l，直径4mm可加样10l。
对于20×10cm的板，凝胶和缓冲液的用量各增加3倍。即15ml凝胶溶液和15ml缓冲溶液混合。其余步骤同前。但为了制成均匀一致的凝胶板，铺凝胶前玻璃必须预热至50℃。
（2）电泳：
将制备好的凝胶电泳板放在合适的电泳槽中，板的两端用滤纸或吸水纸与电泳槽中的缓冲液相连，滤纸芯覆盖到凝胶面上至少5mm。连接要均匀、平整，变遍及整个电泳板的宽度。打有样品孔的一端接负极，接通电源，调节电压到1V/cm，然后，在通电的情况下用微量注射器将样品溶液旧土、加入到起始孔内。
精确的样品用量，根据样品的性质、测定的目的，通过预备试验来确定。通常是加2-5l/孔。
样品加完后，增加电压到8-10V/cm进行电泳。电泳时间的长短则随样品和所加电压的不同而异。例如：用上述条件，血清中的白蛋白分离需要约2小时，那么，电泳移动比白蛋白慢的一些球蛋白的分离，就需要更多的时间，有时可达5小时。
（3）检定：
完成电泳分离后，关闭电源，取出电泳板，并在其面上覆盖一层滤纸。滤纸与凝胶面的接触应紧密平整，无空隙或折叠。然后，在滤纸上上面再放吸水纸，其厚度不少于1cm。让其自行吸水15-20min。之后，取下吸水纸和滤纸。凝胶板用热吹风干燥。接着，将干燥的凝胶在上述染色液中浸泡
15min。取出后。用脱色液洗涤两次，时间为10-20min。最后，用甲醇淋洗至没有背景颜色为止。应注意淋洗时间不宜过长，一般为5min左右。否则染色的分离斑点也有被洗掉的危险。
定量测定是根据峰高—浓度曲线来计算。染色结束红，分离图谱进行照相放大，然后，再量峰高。
应该注意的是：被测样品和标准样品所用的电泳板大小/起始样品孔位置以及其他操作必须完全相同。
这个方法的灵敏度依赖于分析体系，抗原与抗体的相对浓度。降低抗体的浓度，可以提高灵敏度。但由于染色灵敏度的限制，一般蛋白质量低于0.3g/ml就难以检出。倘若抗体用同位素标记，检测的灵敏度可以显著提高，一般可以提高40-60倍。
三、 操作中应注意的问题
（1） 通常使用的琼脂糖浓度是1%，应煮沸分装备用。煮沸是为了溶解 澄清，但反复煮沸琼脂糖溶液易变黄。所以应分装备用以减少熔化次数。冬季制板时，底版（一般用玻璃板）需预热至60℃左右。将熔化的琼脂糖溶液铺满整个底版面,，时间越快越好。一般最好不超过10秒钟，倾倒琼脂糖溶液时，必须连续液流，不能间断。否则有可能造成气泡。
（2） 电泳后非沉淀蛋白的去除：
这常是一个必不可少的步骤。用压片比较方便。方法是：电泳后在胶面上覆盖一张滤纸，注意不应有气泡在胶面与滤纸之间。在其上再加5-8层滤纸，并用一块厚玻璃板压在其上，玻璃板上再加适当的重物。这样加压20min左右，就压成一薄层胶片。小心取下重物、玻璃板和几层滤纸，将凝胶片（连同底板）浸于0.1mol/L NaCl溶液中15-20min，水洗15-20min，重复盐浸和水洗一次，再用上述方法压片15-20min，最后使胶片在热气流中干燥10-20min，就成去除非沉淀蛋白的凝胶干片。
（3） 火箭免疫电泳的先决条件之一是：
让抗原在一个抗体不迁移的pH条件下发生电泳移动。抗原的氨基甲酰化可以增加其向阳极移动的速度。但是，抗体的氨基甲酰化作用不是使它
移动，而是降低它的pI，使它在更低的pH条件下移动。由于氨基甲酰化的程度不一样，可以做到在pH4.5-8.6的范围内，抗体都不会移动。因此，利用氨基甲酰化方法可以极大地定量免疫电泳的应用范围。例如：经氨基甲酰化的免疫球蛋白已可用于人体IgG的免疫电泳定量分析，其条件是pH5.0。氨基甲酰化的抗体应在4℃冰箱中保存。
（4） 在电泳过程中，整块凝胶板上的电场强度的均匀性是极为重要的 因为定量的依据是沉淀峰的高度，而沉淀峰的高度在其他条件下一致的情况下，与电场强度呈正比。因此，必须使整个凝胶面上的电场强度一致。这也要求连接凝胶板和电极缓冲液之间的导电芯必须和凝胶面的宽度完全一致。
（5） 在定量分析的情况下，如果一块凝胶板上需要点若干个样品，为 首尾之间各个样品的沉淀峰能作为分析比较，应在通电情况下（1-2V/cm）点样，并且在5min内完成全部点样。这样做才能基本避免 扩散的影响。
待样品和已知标准样品的定量比较，除比较沉淀峰高低外，还要比较沉淀峰面积，可能会更准确。
所用的标准样品溶液或参考溶液和样品中的蛋白质必须有相同的免疫学性质。如果只有部分相同就会引起定量误差。血清蛋白的定量应用混合血清。因为，有好多因素会影响沉淀峰的高度，所以每块凝胶板上都必须加参考溶液进行电泳比较。
（6） 未知待测样品和参考样品最适稀释度的选择也是应注意的问题。种 选择主要取决于需要包括浓度范围以及所容许的定量重复性。如果事先知道待测样品中蛋白质的浓度范围，就可以容易地作出待测样品的稀释标准。大多数的待测样品稀释浓度可以处在参考溶液的稀释范围内。
（7） 关于检测的敏感度和方法的重复性问题：
一般凝胶中 使用较少的抗血清，如：0.1%(V/V)的抗血清，可增加检测的敏感度。但若使用染色方法蛋白质浓度低于0.3mg/L，就不大可能检测出来。若利用同位素标记抗体的办法其检测的灵敏度至少增加60倍。方法的重复性与测定条件的一致性密切相关。常用求算的标准差（standard deviation，简称SD）来表示重复性的好坏。
（8） 如果使用电压太大，起始样品孔中的缓冲液有可能会由于电流太干。 这样，就会使样品蛋白质的移动发生变化，移动前沿在凝胶表面移动得更快。如果凝胶层太厚，会产生上下的温度梯度。如果凝胶因电流太大造成过热，接着又骤冷，会使大量水滴凝结在凝胶表面，这样就容易使沉淀峰改变位置，甚至会产生不规则的沉淀痕迹和拖尾。
（9） 峰形不规则和弯曲问题：
这主要原因是由于凝胶板与导电芯之间接触不良，或是凝胶板厚薄不匀。其结果是电流大小不一致，电场强度与样品的移动不呈线性。也可能是由于凝胶表面蒸发干燥而收缩，电阻降低，使电流变大造成的。
（10） 有时会发现电泳结束后没有沉淀峰出现。当然，最明显的原因凝 胶中不含抗体，或没有相应的特异性抗体，也有可能是抗原－抗体比例不合适，正负电极接反、pH变化太大、冷却不够、电场强度太大、凝胶表面凝结水滴、凝胶与底板剥离，或接线断开等。
如果抗血清中含有抗其它一些组分的抗体，或者某些蛋白质之间存在部分免疫化学一致性，就可能出现额外的沉淀峰（线）。通过导电芯进入凝胶板中的一些杂质，特别是一些蛋白质，也可产生沉淀线（峰），这可以在两者之间放一层半透膜来表面。有时候在电泳过程中，电泳突然中断一段时间，也可能会造成虚假的沉淀带。电泳时间不够，过早停止电泳，形成的抗原－抗体沉淀峰没有峰顶，或模糊不清的沉淀带，无法进行定性和定量分析。
实验十 Western bloting技术
一、目的与原理
Western bloting技术是用来检测蛋白表达的特定的、灵敏的方法。主要由蛋白质的SDS－PAGE、电转及杂交几部分组成。Western印迹法检测蛋白的敏感性约为1-5ng，0.75mm厚的SDS-PAGE板的一个孔可上总蛋白量约为100μg，所以只要被检蛋白不低于总蛋白量的万分之一，即可被检测出来。如果所分析的样品为未知时，应同时作阳性对照。 杂交技术主要有NC膜的封闭， 靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋白的一抗与二抗的反应，显色等几部分构成。该技术的原理及过程主要为转移到NC等膜上的蛋白带。用其它蛋白作为封闭液，将膜上余下的其它蛋白可结合点封闭。加入与待检测目标靶蛋白有特异性的第一抗体，经免疫反应，一抗将与目标蛋白结合，再经用洗膜液洗涤后，膜上仅在靶蛋白上结合有第一抗体。再加入与第一抗体有免疫特异性的二抗，使之与一抗反应，反应后，经洗膜液洗涤，二抗就仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体，所以通过酶标反应，在显色液中，膜上结合靶蛋白－一抗－二抗的位置即将呈现一定的颜色。
二、材料与方法
1.材料：
待检测蛋白
2.仪器：
电转移槽，电泳仪，塑料封口机，摇床
3.试剂：
转移缓冲液：
48 mM Tris, 39 mM 甘氨酸, 0.037% SDS 同时加20%甲醇。 封闭液：
1% (W/V) 脱脂奶粉,溶于TBST中。
TBST：
150 mM NaCl,
50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
0. 01% antiform A
0.02%叠氮钠
第二抗体稀释溶液：
1% (W/V) 脱脂奶粉,溶于TBST中
0. 5% Tween 20
辣根过氧化物酶显色液(可用Ⅰ或Ⅱ)
Ⅰ 取6mg diaminobenzidine tetrahydrochloride 溶于9ml 100mM
Tris-HCl(pH7.6)崐中，加入1ml 0.3%(w/v) 2‟的NiCl或2‟的CoCl，过滤
去除沉淀。取10μl 30%双氧水与上液充分混匀。注意，此液必须新鲜配制。
Ⅱ 取20mg,4-chlor-1-raphthol于20ml冷甲醇中，另取60μl30%双氧
水，混匀。
注意，此液必须新鲜配制。
三、方法与操作步骤：
（1）SDS－PAGE电泳见实验四
（2）电转
1 剪6块3mm滤纸和一块NC膜；
2 将剪好的3mm滤纸和NC膜在转移缓冲液中浸泡3-5分钟；
3 按下列过程安装转移装置,将塑料支架平放在含转移缓冲液的托盘
中,在塑料支架上放一块海绵
4 将3块3mm滤纸对齐放在海绵上,然后依次将NC膜、凝胶、及另3块
虑纸和海绵放上；
凝胶一面向负极；
6 接通电源电压40伏，电流0.17-0.2Ａ，转移1.5-6小时；
7 转移结束后，取出塑料支架,依次取掉各层,用铅笔在膜的上沿作 好标记，切下其中一个孔所对应膜的一半,用氨基黑或考马士亮兰
染色,检查转移效果；
8 将其于的NC膜放在一张干净的３MM滤纸上，室温干燥30-60分钟； 9 NC膜的封闭：
5 用塑料支架夹尽上述各层，放入电转移槽内，NC膜一侧向正极，
将经电转移并干燥的NC膜放于一平皿中，加入封闭液（液面需盖 过胶面）室温下轻轻遥荡2-3小时；
10 将第一抗体用封闭液稀释，稀释度由预实验确定，但可参考下列 数据：
多克隆抗体，1:100-1:5000
培养的杂交瘤细胞上情液，1:100
鼠腹水细胞1:1000-1:10000
11 将B中封闭好的NC膜，放入塑料袋中，加入一抗，加入量为0.1ml 一抗/cm2NC膜，赶尽塑料袋内所有气泡，封口机封口，4℃下轻轻 震荡2小时。
12 洗膜：
反应结束，将塑料袋剪开，弃去反应液，用PBS洗三次，每次10 分钟；
将膜从PBS溶液中转至150 mM NaCl,50 mM Tris-HCl(pH7.5)溶液 中室温下轻轻震荡10分钟；
13 将二抗用二抗稀释液稀释，稀释度一般为1:200-1:2000； 将膜放入一塑料袋中，加入二抗溶液，加入量一般为0,1ml二抗溶 液/cm2膜，封好塑料袋，在室温下轻轻震荡１小时；
14 剪开塑料袋，取出NC膜，在150 mM NaCl,50 mM Tris-HCl(pH7.5) 溶液中冲洗1-5次，每次10分钟。
15 将膜放入显色液中，室温下轻轻摇动；
16 待条带出现后（约显色1-3分钟），立刻用水洗膜，然后转入PBS 中， 然后拍照实验结果。
实验十一 亲和层析法分离纯化胰蛋白酶
一、实验目的与原理
生物大分子化合物的重要特征之一是具有与某些相对应的分子通过次级键或共价键专一结合的能力即亲和力。例如酶与抑制剂之间，抗原与抗体之间，结合的双方不仅是专一的，而且结合以后可以在不丧失生物活性的基础上用物理或化学的方法进行解离。根据这一特性，如果把具有亲和力的一对分子的某一方连接于水不溶的固相载体上作为固定相，那么另一方随着流动相流经该固定相时，双方便亲和结合为一个整体。然后只有改变某种物理条件或化学条件使结合的双方解离，即能得到与固定相有特异亲和力的某一特定物质。这种利用生物分子和相对应分子之间亲和结合和解离性质而建立起来的层析方法称之为亲和层析。
亲和层析作为一种新型的分离纯化技术，可以用来纯化各种酶、抗体、抗原、维生素结合、传递蛋白、激素和药物的受体、核酸以及其他生物大分子化合物。与一般的提纯生物大分子化合物的方法相比，亲和层析具有简单、快速、得率和纯化倍数高等显著特点，尤其适合实验室规模的微量生物大分子化合物的分离纯化。但是，亲和层析也有其局限性。由于某一种生物大分子化合物只与特定的配基之间具有亲和力，因此针对每一个分离对象不仅需要寻找和制备专一的固相配基，而且还需要选择特定的层析条件。几乎没有统一的方法可供任意配套。
用于生物活性分子固相化的材料首先要求能够功能化，即具有能活化或修饰的功能基团，以使配基与之结合，除此之外，固相化材料必须具有稳定的物理化学性质，优良的流通性，非专一性吸附小等特性。常用的固相载体有纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和交联琼脂糖等。
为了将配基偶联与固相载体上，需要使固相载体活化，即使载体具有与配基进行反应，生成共价偶联物的性质，其方法根据固相载体的性质而定。琼脂糖、葡聚糖或纤维素活化最常用的方法是溴化氰法，此外，也可以用均二氯三嗪或三氯三嗪、高碘酸盐、环氧乙烷等方法。活化了的固相载体与配基偶联，便可得到亲和吸附剂。
适合亲和层析法来分离纯化的物质和他们的配基有
本实验将胰蛋白酶抑制剂－鸡卵粘蛋白与Sepharose 4B偶联为亲和层析拄，用以提纯胰蛋白酶。通过实验学习和掌握蛋白质的亲和层析原理与技术。其实验内容为：
1.鸡卵蛋白的制备。
2.Sepharose 4B的活化和酶抑制剂的偶联。
3.胰蛋白酶粗制品的亲和层析。
二、材料与方法
1.材料与试剂：
（1）制备鸡卵粘蛋白
10％ TCA，用固体NaOH调pH至1.05～1.10，需要50 ml。
5 N HCL，5 N NaOH
冷丙酮
BAEE－0.05 M，pH 8.0 Tris－HCL缓冲液（每ml含0.34BAEE和2.22 mg CaCl2），50 ml。
胰蛋白酶液
新鲜鸡蛋2只
pH 8.0，0.1 M Tris－HCL缓冲液
（2）Sepharose 4B的活化和偶联
Sepharose 4B 7 ml
1.5 M Na2CO3 250 ml
0.1 M NaHCO3（含0.5 M NaCL）pH 8.5 1000 ml
0.1 M Hcl－Gly pH 2.8 100 ml
0.2 N 甲酸 250 ml
0.2 M Tris－HCl pH 7.5 500 ml
0.1 M Tris－HCl pH 7.5,（含0.5 M KCl,0.05 M CaCl2）500 ml 0.1 N 甲酸钾－0.5 N Kcl pH 2.5 500 ml
0.1 N Na2CO3－NaHCO3 pH 9.5 100 ml
（3）亲和层析
0.1 M Tris－HCl pH 7.5（含0.5 M KCl,0.05 M CaCl2）200 ml 粗胰蛋白酶液约50 ml
0.1 N 甲酸钾－0.5 M KCl pH 2.5 100 ml
2.仪器器材
抽滤瓶500－1000 ml
层析拄
紫外分光光度计
紫外蛋白监测仪
烧结漏斗
移液器
磁力搅拌器
3.方法与步骤
（1）鸡卵粘蛋白的制备
鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白是糖蛋白，分子量为28000，但糖成份上有差别。有四种不同组份，等电点的范围为pH 3.9－
4.5,280 nm的消光系数为：A＝4.13（1％,1 cm）。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定。 制备方法：
取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50 ml，置于烧杯中，外用温水浴25℃～30℃，在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积的三氯乙酸－丙酮（1:2V/V），立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终pH约3.5，再继续搅拌30 min，然后在4℃放置过夜。
次日用布氏漏斗抽滤，得黄绿色清液。
边搅拌边加入4℃预冷的丙酮200 ml沉淀蛋白，在4℃放置2 h之后将上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于4000 rpm离心5 min，收集沉淀。 将沉淀溶于10 ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4 h，换水两次，再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜，4000 rpm离心10 min，去除不溶物，取少量上清液，用水稀释适当倍数，测A280计算所得蛋白总量。
测定鸡卵粘蛋白抑制活力：
按附：测定胰蛋白酶活力方法，取BAEE溶液2.8 ml，加入o.15 ml 0.1 M Tris－HCL pH 8.0缓冲溶液，加入50 μl胰蛋白酶溶液，立即混匀，于25℃下用紫外分光光度计测定A253 0.5 min读数一次，测3 min。
加鸡卵粘蛋白后胰蛋白酶剩余活力的测定：将鸡卵粘蛋白和胰蛋白酶按一定比例混合，使二者充分结合后，测混合液的胰蛋白酶活力，测得抑制后的剩余活力，一般所用粘蛋白量抑制50％的胰蛋白酶活力为宜。此实验中，可按以下量操作：
取鸡卵粘蛋白液，用无离子水稀释成 0.2 mg 蛋白/ml,取70 ml稀释后的鸡卵粘蛋白液加入140 mlTris－HCl pH 8.0，0.01 M的缓冲液。再加入70 ml蛋白酶液，摇匀，于室温下放置10 min，取0.2 ml加入到2.8 ml BAEE溶液中，搅匀后测A253，0.5 min记录A253一次，共记录3 min，计算胰蛋白酶经抑制剂作用后的剩余活力。
计算抑制比活力：抑制一个胰蛋白酶活力单位（BAEE单位）所需的鸡卵粘蛋白量定为抑制剂的一个活力单位，抑制剂的比活力单位为每 mg 的抑制剂所能抑制胰蛋白酶的比活力单位数。在本实验中由下式计算；
抑制比活力＝（A253/min）/{ 0.001×鸡卵粘蛋白用量（mg）}
A253/min－不加抑制剂的每min A253变化值减去加抑制剂后的每min A253的变化值。
0.01 mg－鸡卵粘蛋白的用量。
若抑制活力>5000 BAEE单位/mg，则此粘蛋白经丙酮沉淀制成蛋白成品后可直接用于偶联反应。若抑制活力较小，则需进一步用DEAE－纤维素柱层析纯化。
丙酮沉淀鸡卵粘蛋白：将经过脱盐的鸡卵粘蛋白用HCl调至pH 4，测量体积后转入三角瓶中，加入2倍体积的冷丙酮，加盖置于冰箱中，次日，于4000 rpm离心20 min,收集沉淀，置于干燥器中抽去丙酮，加盖置于冰箱中保存。
附：胰蛋白酶的活力测定：
胰蛋白酶的催化专一性表现在对于由氨基酸所形成肽键、酰胺键和酯键，且对酯键的催化再用灵敏度强于另两种键，本法采用人工合成的N－苯甲酰－L精氨乙酯（BEAA）为底物，研究胰蛋白酶的特异催化活性。N－苯甲酰－L精氨乙酯在波长253 nm下的紫外吸收远远弱于N－苯甲酰－L精氨酸（BA）的紫外光吸收。在胰蛋白酶的催化下，随着酯键的水解，N－苯甲酰－L精氨酸逐渐增多，随之反应体系的紫外吸收相应增加，由此即可建立测定胰蛋白酶活力的特异方法。
胰蛋白酶的BAEE单位定义是：在规定的实验条件下，引起每min光密度值增加0.001的酶量定为1个BAEE单位。
实验肽键：
测定容积 3.0 ml
比色杯光程 1.0 cm
波长 253 nm
温度 25℃
底物溶液 2.8 ml
酶溶液 0.2 ml
溶液配制：
0.05 M Tris－HCl缓冲液，pH 8.0
50 ml 0.1 M Tris＋29.2 ml 0.1 N HCl＋水至100 ml
底物溶液：50 ml 0.05 M Tris－HCl缓冲液pH 8.0＋111 mg CaCl2＋17 mg BAEE。即每ml 0.05 M Tris－HCl缓冲液pH 8.0（含有0.34 mg BAEE和2.22 mgCaCl2）。
酶溶液：制备流程中的酶蛋白原液，稀释约200倍，现配现用。稀释倍数应以控制溶液的蛋白质含量为10－20 r /ml为宜，稀释液用0.001 N Hcl。
测定方法：选好两只石英比色杯，一只比色杯加2.5 ml底物溶液，0.2 ml 0.001 N Hcl，作为空白对照，另一只比色杯中加入2.8 ml底物溶液，此时应先将分光光度计调好零点，然后于第二只比色杯中加0.2 ml酶溶液（适当稀释），迅速混匀，计时测定。每隔30秒钟读数一次，待光密度值增加趋于平稳后，停止测定，计算出每min平均O.D.253增加值（只取直线部分）。根据下式计算样品液中的BAEE单位和比活力：
BAEE单位＝（A253 / min）/ （0.001×0.2）×D
比活力（BAEE/ mg）＝（BAEE单位 / ml）/ { 蛋白质含量（mg/ml）}
＝（A253/min×A1cm280）/（A280×0.001×0.2）×D2 / D1
D1：为测定蛋白质含量的稀释倍数。
D2：为测定酶活力的稀释倍数。
（2）Sepharose 4B的活化及偶联
在碱性条件下，琼脂糖凝胶用溴化氰（CNBr）活化可引入活泼的亚氨基碳酸盐，在弱碱条件下能直接与卵类粘蛋白的游离氨基偶联，生成氨基碳酸盐和异脲衍生物。
活化及偶联方法：取Sepharose 4B沉淀体积7 ml，在烧结漏斗中，用约10倍体积的无离子水抽洗。再用40 ml,1.5 M Na2CO3溶液抽洗2次，得半干滤饼，倒入25 ml的烧杯中，加入20 ml,1.5 M Na2CO3溶液。将此载体悬浮液置于冰箱中，迅速称取1 g CNBr溶于1 ml乙晴中，将CNBr溶液滴加入
冰浴的载体悬浮液中，并用磁力搅拌，反应8 min后，将活化的载体迅速转入烧结漏斗中，用预冷的0.1 M NaHCO3 pH 8.5溶液200 ml抽洗。将半干的活化了的Sepharose 4B加入40 ml,1 M NaHCO3 pH 8.5溶液，搅拌下立即加入用15 ml,0.1 M碳酸钠缓冲溶液 pH 9.5溶解的鸡卵粘蛋白溶液中，于冰浴上轻轻搅拌2～3 h，4℃放置过夜。
偶联量测定：将偶联反应进行了16～20 h的Sepharose 4B„卵粘蛋白从冰箱取出，用烧结漏斗抽滤偶联缓冲液，用o.1 N NaHCO3缓冲液 pH 8.5抽洗多次，用o.1 M HCl„Gly pH 2.8液分次抽洗，用0.2 N 甲酸抽洗至O.D.值小于0.01，并稳定为止。测定每次选出的蛋白量，计算未偶联的蛋白总量，根据参加偶联的蛋白总量计算出偶联上的蛋白质百分率。
（3）胰蛋白酶的亲和层析
卵类粘蛋白在pH 7～8的条件下能与胰蛋白酶专一地结合，而在pH 2～3时又能解离，因而掌握好上柱的pH条件和洗脱缓冲液条件，便可将胰蛋白酶从含杂蛋白的粗酶液中选择性地结合于柱上，待洗去不结合或非专一性结合的杂蛋白后，改变pH值便可将胰蛋白酶洗脱下来。从而达到纯化的目的。由于亲和层析结合的专一性，上柱体积可以比较大，得到浓缩的提纯产品。
亲和层析步骤：
胰蛋白酶粗制品的制备：将1.5 kg猪胰脏剥除脂肪和结缔组织并绞碎；加2倍冷乙酸酸化，在10℃下提取1～2 h，并不断搅拌；用四层纱布过滤，收集滤液，以500 ml酸化水再次将残渣提取1～2 h，汇编滤液；用5 N 硫酸调至pH 2.5－3.0，放置3～4 h，折叠滤纸过滤，收集滤液；加钙至0.1 M，用5 N NaOH溶液调至pH 8.0，加入约1 mg的结晶猪胰蛋白酶，室温搅拌4 h，待测定比活力后即可上柱。
将鸡卵粘蛋白„Sepharose 4B 装柱（1×10 cm）,用pH7.5, 0.1 M含0.5 M KCL，O.O5 M CaCL2的缓冲液平衡，平衡约2～3倍的柱体积。将粗胰酶液上样柱层析。用紫外蛋白监测仪280 nm处监测蛋白吸收峰，随着上柱和流出的杂蛋白量的平衡，吸收峰达到稳定，一旦上柱的胰蛋白酶量超过柱的负荷时，则胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此时应停止样品上样，改
生物化学实验原理与技术
中国农业科学院研究生院 生物化学与分子生物学教研室
1999年 12月
目 录
蛋白质化学部分
SDS实验五 实验六 Western bloting
多酚氧化酶（PPO）的分离纯化„„„„4 多酚氧化酶（PPO）的活性测定„„„„8 考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度„10 聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量 及蛋白质的纯度鉴定„„„„„„„„12
等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点„„16 多酚氧化酶（PPO）的同功酶检测 „„19 免疫学部分
多酚氧化酶（PPO）抗体的制备„„„ 24 多酚氧化酶（PPO）扩散免疫电泳„„ 31 多酚氧化酶（PPO）火箭免疫电泳 „„33 技术„„„„„„„40 亲和层析法分离纯化胰蛋白酶„„„„44 核酸化学部分
实验一 实验二 实验三 实验四
实验七 实验八 实验九 实验十 实验十一
实验十二 植物染色体DNA的提取„„„„„„ 52 实验十三 质粒DNA的提取与纯化„„„„„„ 54 实验十四 DNA片断的酶切技术 „„„„„„„57 实验十五 DNA片断的连接技术 „„„„„„„59 实验十六 受体菌感受态细胞的制备„„„„„61 实验十七 重组DNA片断的转化、克隆及筛选„ 62
作 业
实验结束后按实验指导的格式写出实验报告，其中包括：实验目的与原理；材料与方法；实验结果与分析；实验结果讨论。实验结果照片、图表等要附在实验报告中。
蛋 白 质 化 学 部 分
实验一 多酚氧化酶（PPO）的分离、纯化
一、实验原理与目的
多酚氧化酶（儿茶酚酶），它是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，可参与植物生长、分化和种皮透性的调节。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶的活性与植物抗病有一定联系，植物免疫与动物免疫的机理不同，后者是抗体与抗原的关系，前者的免疫机理现在认为主要是产生对病源有害物质。已发现具有免疫作用的有害物质是多种多样的，概括为两种类型，其中的一种类型就是原有的有毒物质，植物本身含有的一些对病菌有抑制作用，使病菌无法在寄主中生长。很早就发现酚类化合物与抗病有明显的相关，例如原儿茶酸与儿茶酚对有色洋葱磷茎炭疽病菌的抑制作用。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用：
＋+醌2O
底物+酚2
但是PPO的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一，影响一些经济植物产品的质量。在制茶加工工业中这种酶有重要作用，在制茶时要立即杀青，防止多酚氧化酶的活性，避免醌类物质的产生，保持茶色清香。因此，许多学者对此进行研究，并从一些植物组织中分离纯化这种酶，研究酶的理化性质和生化特性。
本实验将采用马铃薯为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液；再经过阴离子交换柱DEAE
－纤维素DE－52柱层析、聚乙二醇反渗透浓缩、葡聚糖凝胶Sephadex G-200柱层析获得PPO的纯酶液；然后对其进行酶蛋白含量检测、酶活性测定、聚丙烯酰胺凝胶电泳和PPO同功酶的分析，以及通过免疫学的分析对多酚氧化酶（PPO）进行理化、生化特性进行鉴定。
通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离、纯化、鉴定的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离、纯化、鉴定的系统技术。
二、材料
（1）马铃薯（大约每小组100-200g） （2）试剂：
0.03M磷酸缓冲液pH6.0
（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯 吡咯烷酮）配制时配×10倍的浓缩液1000ml； 固体硫酸铵； 0.03M磷酸缓冲液pH6.0
（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）配制时配 ×10倍浓缩液100ml；
0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）配制时配×10 倍浓缩液1000ml； NaCl: 聚乙二醇：
DEAE－纤维素 DE52； 葡聚糖凝胶Sephadex G-200: （3）实验器械与仪器设备： 试管与试管架； 烧杯、玻璃搅棒； 移液管、滴管等； 试剂瓶；
透析袋： 过滤纱布； 层析柱；
植物组织匀浆器； pH计和pH试纸； 恒流泵； 梯度混合仪； 核酸蛋白检测议； GL－20C 高速冷冻离心机； DL－7A 大容量低速冷冻离心机：
三、方法与步骤 （1）粗酶提取：
水果肉组织按1:1（W/V）比例与0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆后4层纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。 （2）硫酸铵沉淀：
在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液再加入固体硫酸铵达到70％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清液，收集粗酶沉淀；沉淀用0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）溶解，装入透析袋中用0.02M KCl溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。
（3）DEAE－纤维素DE 52离子交换柱层析（DE 52的材料处理、装柱方法、层析方法和原理见实验讲义附）：
选用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）预先将DE－52柱进行平衡，然后将粗酶液上柱，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱杂蛋白，再换用含NaCl（0.2-0.6 M）的
0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA） 进行梯度洗脱；收集PPO
活性部分洗脱液，采用聚乙二醇反渗透法浓缩酶液2倍供羟基磷灰石柱层析用。
（4）葡聚糖凝胶Sephadex G-200凝胶柱层析（Sephadex G-200凝胶的材料处理、装柱方法、层析方法和原理见实验讲义的第5页）：
用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）预先平衡Sephadex G-200凝胶,然后将酶液上柱，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。
实验二 多酚氧化酶（PPO）活性测定
一、原理与方法
PPO催化各种酚与02氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在 0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液pH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。
其方法是，在含有4ml pH5.8的0.2M磷酸二氢钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml 0.05M邻苯二酚溶液,在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液，反应5分钟，在分光光度计410nm处读取吸光值。在上述条件下，以A410读数，以每分钟增加0.01 OD值定义为一个酶活单位（U）。 二、材料 （1）样品：
多酚氧化酶粗酶液 硫酸铵沉淀组份 DE－52洗脱组份 羟基磷灰石洗脱组份 Sephadex G-200的组份 （2）底物：
邻苯二酚：0.01M邻苯二酚溶液 （3）反应体系：
0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液pH5.8 （4）器皿与仪器： 试管、恒温水浴等 分光光度计
三、酶蛋白的比活性
比活性＝酶活单位（U）/mg 酶蛋白
四、记录实验结果
（1）结果列表
多酚氧化酶的提取、分离、纯化表
（2）根据实验结果绘制DE－52和G－200的柱层析洗脱曲线图。
实验三 考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度
一、实验原理与目的
生物化学实验中，经常需要测定蛋白质的含量，一般常用的蛋白质测定方法有紫外吸收法，双缩脲法和Lawry法等。另一种方法是蛋白质－染料结合法，即考马斯亮蓝G－250法。此方法试剂简单、经济。测定简便快速。具有与Lawry法相当的灵敏度，受溶液中其他物质的干扰很小，可采用对照来消除。
考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度的基本原理是：当考马斯亮蓝G－250染料与蛋白质结合时，其存在两种不同颜色（红色与蓝色），红色就转变为蓝色，使染料的最大吸收峰从465 nm移动到595 nm，染料与蛋白质的结合与595 nm的吸收值在一定蛋白质浓度下呈线性相关，其蛋白结合反应在2－3 min内即可完成，而反应生成的复合物在1 h内比较稳定地存在于溶液中，因此，用标准浓度的蛋白测得O.D595值绘制标准曲线，即可求得待测样品的蛋白质浓度。
二、材料与方法 1.材料：
经硫酸铵沉淀获得PPO粗酶液，DEAE－纤维素DE 52分离的酶液和Sephadex G－200分离纯化的酶液样品。 2.仪器与器皿：
分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管和试管等。 3.试剂：
（1）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂：
称取100 mg考马斯亮蓝G－250溶于50 ml 90％的乙醇中，加入85％（V/V）磷酸100 ml，最后加无离子水或蒸馏水定溶到1000 ml，此溶液可在常温下放置一个月。 （2）蛋白标准液：
称取牛血清蛋白100 mg定溶于100 ml的无离子水或蒸馏水中，制成1000 μg / ml贮备液。再配制成分别为20 μg/ml、40 μ g/ml、60 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml的蛋白标准液。
4.测定方法与操作步骤： （1）标准曲线的绘制：
0－100 μg/ml蛋白标准曲线：准确吸取0.5 ml含20、40、60、80、100 μg蛋白标准液，分别放入10 ml的试管中，加5.0 ml考马斯亮蓝G－250蛋白试剂，将溶液混匀，2 min后在分光光度计594 nm处测定其消光值，空白以无离子水或蒸馏水代替。以消光值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
100－1000 μg/ml的蛋白标准曲线的制作方法上述相同。
（2）样品中蛋白质浓度的测定：要求待测样品中的蛋白浓度范围为1－1000 μg/ml之间，若浓度过高时，需要对其进行适当的稀释，再用制作标准曲线的方法对样品进行测定，测定的O.D595值结果由标准曲线求出样品的蛋白质浓度。
实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质
分子量及蛋白质的纯度鉴定
一、实验目的与原理
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4 g的SDS，由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与所带电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量与电泳迁移率间的关系，可用下式表示： MW＝K（10 - K－为常数 b－为斜率 m－为迁移率
不同浓度的凝胶适用于不同蛋白质分子量范围，在5％的凝胶中分子量25000～200000的蛋白质；在10％的凝胶中，分子量10000～70000的蛋白质；在15％的凝胶中，分子量10000～50000的蛋白质，其分子量的对数与迁移率呈直线关系。因此，所测分子量范围要选择最适合的凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标志蛋白。
本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及其分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。
二、材料与方法
－b m
）
MW－为蛋白质分子量
1.材料：
硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品； DEAE－纤维素 DE 52 柱层析的样品；Sephadex G－100柱层析的样品。 2.试剂：
（1）丙烯酰胺（Acr）凝胶贮液： 30g Acr,668mg Bis,加水至100 ml。 （2）10％的SDS溶液 （3）10％的过硫酸铵溶液 （4）四甲基乙二胺（TEMED） （5）分离胶缓冲液：
将18.15 g Tris溶解后，加5 ml 6 N HCL溶液，定容至100 ml，pH 8.8。
（6）浓缩胶缓冲液：
6 g Tris溶解后，加10 ml 6 N HCL溶液定容至100 ml，pH 6.8。 （7）电极缓冲液：
6 g Tris,28.8 g甘氨酸和1 g SDS，加水溶解定容至1000 ml，pH 8.3。 （8）样品缓冲液：
1 g SDS，2 ml 巯基乙醇，5 ml甘油，1 ml 0.1％的溴酚蓝，1 ml 上层胶缓冲液，定容至50 ml。 （9）染色液：
0.25 g 考马斯亮蓝250，溶于含有45％的甲醇，10％的冰醋酸的水溶液中。
（10）脱色液：
7.5％的冰醋酸和10％的甲醇水溶液。 （11）已知分子量的标准蛋白。 3.仪器设备：
电泳仪，垂直电泳槽等。 4.实验方法与步骤： （1）凝胶制备：
用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（注意不能漏胶），垂直放置。将下表列出的的配方，配成分离胶溶液，立即倒入垂直槽，并慢慢加入无离子水，将凝胶液面压平，20 min后凝聚。倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒人按表配成的浓缩胶，再插入梳子。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制（10％）分离胶
浓缩胶
（2）点样：
分别取样品0.1 ml于离心管中，各加入0.1 ml样品缓冲液，在沸水浴中加热2 min，取出待用。将电泳槽接通电源，调节控制器电流达到5 mA。用微量注射器分别吸取0.1 ml不同浓度的标准蛋白样品和实验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流升到15 mA，当溴酚蓝进入分离胶将电源加到28～30 mA（2～3 mA/em）,保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1～2 cm时，即可停止电泳。
（3）染色：
电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温1 h。倒掉染色液，用脱色液，用脱色液脱掉剩余染料后，倒人脱色液第二天换一次脱色液，24 h后，即可看到清晰的蛋白质条带。 （4）蛋白质迁移率的计算，并与标准蛋白比较： 蛋白质迁移率Rm ＝d2 /d1 d1—溴酚蓝迁移率距离 d2—蛋白质迁移率
以标准蛋白迁移率为横坐标，以其分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，可得标准曲线，并估计未知样品蛋白的分子量。
实验五 等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点
一、实验目的与原理
蛋白质分子在电场中的迁移性质早就用来分离和鉴定蛋白质。但常规的电泳用于受介质成份，pH和离子强度的影响，其分辨率受到限制。而且用蛋白电泳时的迁移率来表征蛋白质的特征并非对所有蛋白质都合适。等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦实质是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。 在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。因此，这些分子总会是出于不断扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。 IEF技术的关键是得到一定范围的稳定的pH梯度，即找到合适的两性载体。根据氨基酸的两性电解质的特点，最初有人用组氨酰组氨酸溶液，但其pH范围很窄，应用受到限制。1969年，Vesterbery合成了一系列脂肪酸族聚氨基聚羧基的异构物，这些异构物具有不同的pK和pI。在pH 3－10的范围内构成了一个连续的系列。通过改变电性基团的成份与数量，可以得到各种pH范围的两性载体。其商品名为“Ampholine”，“Pharmalyte”等。 IEF目前已可区别等电点仅差0.01单位的成份，这样高的分辨率用一般电泳和离子交换层析技术是达不到的。因此，IEF是鉴定电荷不均一性的，通报是区别非常相似的分子的理想方法。另外，由于经过IEF的分离，能够使相同pI的分子都浓缩到一个区带，因而可用于蛋白质的制备。 IEF所使用的抗对流介质最早主要是用蔗糖梯度，这种系统耗时多，操作麻烦。因此，现在多采用聚丙烯酰胺或葡聚糖凝胶在抗对流介质，前者用于分析IEF和少量样品的制备，后者用于制备。应用凝胶等电点聚焦法不仅能测定两性电解质的等电点，而且能将具有不同等电点的混合物质进行分离鉴定。
通过实验了解等电点聚焦电泳的原理，学习和掌握蛋白质凝胶等电点聚焦电泳的方法技术，为学习掌握双向电泳技术打下良好的基础。
二、材料与方法 1.材料： 蛋白样品 2.试剂：
聚丙烯酰胺、甲叉聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP－40、 triton x-100、1M 磷酸、1M氢氧化钠、磺基水杨酸、 三氯乙酸、考马士亮兰 R－150、乙醇、冰乙酸 3.方法与操作步骤： （1）样品制备：
用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。
（2）制模具：
洗净两块IEF专用玻璃板，取一块IEF专用塑料垫板，确定好疏水和亲水面。在厚玻璃板放上塑料垫片，亲水面朝上，在垫板两边放上夹条，再在上面小心盖上簿玻璃板，玻璃板疏水面朝下。夹子夹好。 （2）配胶：
按配方混合胶溶液，抽气，加入TEMED。 （3）灌胶：
配好的胶迅速灌入模具。 （5）电泳：
等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面上任意位置放上小擦镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，恒功率25W电泳，约10分钟后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约30分钟，待电流达4mA以下，停止电泳。
（6）固定：取出塑料片，放入固定液中15分钟
（7）染色：取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至条带出现。 （8）干燥保存。
实验六、多酚氧化酶同功酶分析检测
一、实验原理
同功酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成及分子量却有所不同的一组酶。由于蛋白质分离技术的发展，特别是凝胶电泳的应用，使同功酶可以从细胞提取物中分离出来。这类酶由两个或两个以上的肽链聚合而成，它们的生理性质及理化性质，电泳的行为都是不同的。由于酶分子的大小、构象、所带电荷的不同，在一定条件下，在电场中泳动的方向速度各不相同，分离出不同的区带，因此通过凝胶电泳的图谱可对同功酶进行分析。本实验将提取的PPO进行电泳分析，并观察PPO同功酶电泳图谱。
二、材料： （1）样品：
硫酸铵沉淀的PPO粗酶样品和G－200纯化的样品 （2）PPO同功酶染色液：
1％邻苯二酚、0.05 M 磷酸缓冲液pH6.8、o.o6％对苯二胺溶液（用0.01 N 草酸配制）以3:1:1的混合液。
（3）电泳所需材料仪器设备参见实验讲义的凝胶电泳实验部分。
三、方法步骤
电泳方法与实验四的操作方法相同。
PPO同功酶的染色方法：将电泳完毕的凝胶放入染色液中1－2h，然后用乙醇:水:醋酸（10:15:15）溶液洗脱，至出现棕色谱带。其他凝胶电泳的制胶、上样、电泳等操作见实验讲义的凝胶电泳部分。
四、作业：画出PPO的的同功酶图谱。 附：
一、凝胶层析法 1.原理
凝胶层析法（gel chromatography）有几种名称，如凝胶过滤（gel filtration）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶透析层析（gel permeation chromatography）等。它的基本原理是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶本身是一种分子筛，它可把分子按大小不同进行分离，好象过筛一样，将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使其充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子进入到凝胶内部，流速较慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离纯化。
具有分子筛作用的凝胶主要有：葡聚糖（商品名为Sephadex G系列）、琼脂糖（商品名为Sepharose系列）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名Bio－gel）等。
2.柱材料的处理
称取一定量的Sephadex G－200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀24 h－36 h，去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止，凝胶材料就处理好了。 3.装柱方法
将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2 cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白检测议，待层析柱的平衡。 4.层析柱的平衡方法
在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的
溶液用层析过程中的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5－1 ml/ min，当下出口流出液的pH值与平衡缓冲液的pH值一致时，层析柱达到了平衡。
二、离子交换层析法 1.原理
离子交换作用一般是在固相和液相之间发生的可逆离子交换反应，利用这一反应可以分离各种可解离的物质。固相部分称为离子交换剂，其母体为不溶性高分子物质，如树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖或无机聚合物等，在其母体上连接了若干可解离的活性基团，分为强酸型、弱酸型、强碱型和弱碱型，因此它可吸附带正电荷的或带负电荷的被分离物，通过改变洗脱液的pH值或改变离子强度使被分离物得到分离纯化。
蛋白质分子也是两性物质，所以从机理上讲，离子交换层析法同样用于蛋白质组份的分离纯化。
2.DEAE－纤维素 DE 52阴离子交换剂材料的处理
本实验采用的是DEAE－纤维素 DE 52弱碱型阴离子交换剂，处理方法采用两步进行。第一步将DE 52阴离子交换剂干粉浸泡在0.5 N的HCL溶液中1－2 h，用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或pH 4以上，并将其在抽滤漏斗中抽干；第二步是将抽干的离子交换剂浸泡在0.5 N的NaOH溶液中1－2 h，再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性，这样离子交换剂材料就处理完毕，待装柱和层析柱的平衡。
DEAE－纤维素 DE 52阴离子交换剂的装柱方法和层析柱的平衡方法与Sephadex G－200材料的处理方法相同。
三、硫酸铵饱和度常用表
1.调整硫酸铵饱和度计算表（25℃）
硫酸铵终浓度（％饱和度）
2.调整硫酸铵溶液饱和度计算表（0℃）
在0℃硫酸铵终浓度（％饱和度）
免 疫 学 部 分
实验七 多酚氧化酶（PPO）抗血清的准备
一、实验原理
高等脊椎动物具有由大、小吞噬细胞，T，B，K淋巴细胞，抗体，补体等组成的体液免疫系统和细胞免疫系统。当外来的抗原物质进入机体后，即可产生细胞免疫和体液免疫，发生保护机体的特异性免疫反应。因此，制备抗血清一般都选用哺乳动物如兔、羊、鼠、马、驴、猴等做免疫动物，也可选用鸡、鸭等禽类或蛙等冷血动物做免疫动物。选择的动物与抗原来源的生物必须是异种的，种属相差愈远，抗原物质使机体产生的能力愈强，反之则弱。作为免疫用的动物其大小／性别／年龄要适合。年龄太小时免疫系统发育不全；年龄太大免疫系统机能衰退，这些都影响抗体的生成。个体尽可能大一些，个体太小不能获得足够的抗血清，因此，实验室一般选用年轻成熟、体重2.5-3kg、耳朵大、静脉粗、健康的雄性白兔做免疫动物。
抗原进入机体有多种途径。例如注入肌肉、皮下、皮内、淋巴结、静脉、腹腔和足掌等，经常采用的是肌肉或静脉注射。但病毒和加有多种化学物质的抗原不宜静脉注射。免疫途径一次不应超过两种。同一途径应采取多点注射，一般每个注射点的抗原剂量不应超过0.5ml。
抗原进入机体后不能马上引起产生抗体，而是要经过一段潜伏期（长短视抗原而异，如病毒抗原只需3-4天，蛋白抗原约一周左右），然后才有血液中出现抗体。开始产生的抗体滴度较低，维持时间短。必须给予第二次以至多次免疫才能产生持久的高滴度的抗体。在第二次注射抗原1-2天后，抗体水平显著提高，不久可达到比第一次高10-50倍的高峰，并可以在较长时间内维持在一个较高水平上，数月后才缓慢下降。采血后，如不再注射同样抗原，机体产生抗体的能力会日渐下降，但动物在休息一段时间，如2-3月后，再次注射同样的少量抗原，抗原含量又会很快上升，重新获得高价抗血清。这种现象称为免疫记忆或回忆。
抗原的注射量应该根据抗原的类型和动物的情况而定。一次注射剂量
过大，会产生免疫麻醉；太少则不能刺激机体发生免疫反应。多次低剂量注射也会免疫麻醉，其结果比一次大剂量造成的还要严重。因此，每次要注射合适剂量的抗原。一般蛋白质抗原以每千克动物体重0.5-2mg为宜。
在注射的抗原中，常常加入一些能增强其抗原性的物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂，其作用是延长抗原在体内存留的时间，同时刺激网状内皮系统，增强抗体的形成。佐剂分为福氏佐剂（Freund’s adjurant）和明矾佐剂。福氏佐剂较常用，其成分是灭菌的石蜡油和羊毛脂，二者的比例因情况而定，常用羊毛脂：石蜡油=1:4。佐剂又分为完全和非完全两种。佐剂中加入分枝杆菌如卡介苗、酐菌及结核菌。卡介苗的用量为3-4mg/ml佐剂）的称为完全佐剂，不加的称为非完全佐剂。
二、材料与器材 1、家兔：2.5-3kg
2、抗原：蛋白质（根据实验内容而定，本实验采用纯化的多分氧化酶） 3、羊毛脂（灭菌） 4、液体石蜡油（灭菌） 5、注射器、针头 6、乳体
三、操作方法 1、佐剂抗原制备：
取取羊毛脂1g，石蜡油5ml，混合。高压灭菌后，置4℃保存。使用前取所需数量置于乳体中研磨，待均匀后，边磨边滴加等体积抗原溶液（完全佐剂按3-4mg/ml加入卡介苗），继续研磨至成乳剂（滴于水内完全不扩散）为止。除上述乳化方法外，还可以用一支注射器装抗原溶液，另一支装佐剂，二管用塑料管连接，然后二者此推彼吸，反复两次，直至完全乳化为止。另外还可以用玻璃匀浆器乳化。 2、实验动物：
家兔，应预饲3-4天，令起适应环境，体检健康，才可开始免疫。 3、免疫：
吸取乳化好的抗原液进行皮内多次点注射，背部24个点，每点0.05m 四肢内侧8个点，每点0.15ml。共注射约2.0mg蛋白质抗原。1周后进行第二次加强免疫（剂量为0.5mg），采取背部和四肢内侧多点皮下注射。以后每两周再加强一次，共两次，剂量为1.0mg。
第一次注射为完全福氏佐剂，以后只注射不福氏佐剂。 4、抗血清准备：
在第四次加强免疫后可作为抗血清效价测定。从兔耳静脉采血，以试管沉淀法或双扩散法测定。双扩散法测定滴度（效价）为1:32时即可放血准备抗血清。将血液收集于灭菌试管中，作斜面，在室温放置1小时（或37℃水浴中30min）左右，以3000r/min离心10min，取其血清。根据实验需要按等级分成许多份装于小瓶内，于-20℃冰箱中保存。用时按需要取出。抗血清切忌反复冻融，以免降低其效价，也可将血清冷冻干燥成干粉，存放于4℃冰箱中。
三、抗血清效价及纯度测定 1、原理：
准备的免疫血清，必须进行效价（滴度）测定和纯度的鉴定，只有达到要求方能使用。免疫血清的效价是指它与一定量抗原作用时，出现肉眼可见沉淀反应的最大稀释度。它是免疫血清有效的量度。 测定抗血清效价的基本原理是：
抗原-抗体特异性结合所产生的沉淀反应。只要将可溶性抗原与相应抗血清混合，当两者比例合适，并有适合浓度电解质存在时，抗原-抗体既形成抗原抗体复合物，达到最大比例时，即形成肉眼可见的沉淀析出。解释沉淀形成的格子论学说（Lattice theory）认为，抗原是多价的，即可结合多个抗体分子；而抗体是双价的，只能结合俩个抗原分子。因此，抗原-抗体的结合可表现不同数量的关系。只有抗原、抗体两者的比例合适时，才会形成抗原抗体复合物而出现明显的沉淀。
抗原、抗体结合的过程可分为三种状态：
将比例最合适而出现沉淀的状态称为抗原-抗体等价区（Antigen-Antibody Equivalence Zone）。比例不合适，抗原或抗体过剩时，则有未结合的抗原或抗体游离于上清夜中，不能结合形成足量的抗原-抗体复合物，此时出现沉淀量少或不发生沉淀，这种状态，前者（抗原过剩）称为抗原过剩区，后者（抗体过剩）称为抗体过剩区。
抗原-抗体形成沉淀，除抗原、抗体的比例外，也受离子强度、pH和温度的影响。抗原、抗体反应介质的离子浓度在超过0.15mol/L时，随着盐浓度的增加沉淀形成量将逐步减少。介质的pH一般在6.5-8.6范围内时都能形成沉淀。一般说看透、抗原、抗体混合后条件合适时沉淀随即发生，但需在37℃放置30-60min才能看到沉淀，通常在冰箱贮存24小时后更能沉淀完全。
在免疫扩散法中，沉淀形成的快慢取决抗原、抗体的扩散速度，因此反应时间是由影响扩散的因素决定的。抗原-抗体的结合是相当稳定的，但也有可逆性质不变。当两者比例合适时，仍可以结合生成复合物。
抗血清中含有抗体，只与某一种抗原产生沉淀反应的抗血清称为单价血清。有些抗血清含有多种的抗体，能与多种抗原呈沉淀反应，称为多价抗血清，所发生的沉淀反应称为交叉反应。抗血清的纯度就是抗血清的单价性。
2、抗血清效价测定方法：
测定抗血清效价是应用一系列连续稀释的抗血清，与固定量的抗原进行反应，观察仍能出现沉淀的最大稀释度，此即为抗血清的效价（滴度）。沉淀反应可以用试管沉淀或免疫双扩散法检测。对于一种抗血清，测定效价的方法只能选用其中的一种，而不要交叉运用。 （1）试管沉淀法
在试管架中排放12-18支洗净、干燥的试管；
取准备好的抗血清0.5ml放入第一支试管中，加等量的生理盐水稀释，充分混匀。取出0.5ml放入第二支试管，加入等量的生理盐水稀释，充分混匀。取出0.5ml放入第三支试管，再加等量的生理盐水，如此不断稀释下去，
最后一管在充分混匀后，取出0.5ml弃去；
在每支稀释的抗血清试管中，加入0.5ml抗原溶液（1mg/ml），充分混匀；
将试管放入37℃水浴中，保温一定时间（约4-6小时）或置于冰箱中过夜。观察不再形成抗原-抗体沉淀反应的是哪一管，抗血清的效价（滴度）就由前一管的稀释度计算。例如，测定中是11管不再发生沉淀反应，那么此抗血清的效价则为1:210(1:1024)。 （2）免疫双扩散法：
免疫双扩散法是由Ouchterlong建立的，因此又称为Ouchterlong法。其主要原理是分子量在200000道尔顿以下的可溶性抗原和抗体能在琼脂或琼脂糖凝胶中，相向进行扩散时，当抗原和抗体相遇，其比例及反应条件合适，浓度大到又足形成肉眼可见的凝集复合物时，即在凝胶中呈现出沉淀线或弧。如果抗原和抗体无关时，就不会产生沉淀线。所以此法可用于以特异性抗体鉴定抗原或以已知抗原鉴定抗体。
抗原和抗体反应形成的沉淀线，具有免疫特异性屏障作用，能阻止该种抗原和抗体进一步扩散，但不妨碍其他抗原和抗体的扩散。这种选择性的渗透作用可以用来鉴定两种以上的抗原和抗体。因为每对成分相遇时都各自形成沉淀线而不相互干扰，所以从沉淀线的数目即可知这个系统中存在的抗原和抗体的最低数目。由图可以看出双扩散时不同抗原抗体形成的不同沉淀线。
图（1）是在双扩凝胶板上的一个凹孔中含有抗原A，另一个凹孔中含有相应抗体（Anti-A），经双扩反应后即可观察到沉淀线。图（2）是凝胶板上两个凹孔中含有相同的抗原A，下凹孔中含有相应的抗体（Anti-A），扩散反应后形成彼此重叠的沉淀线或抗原性相同图形。图（3）是在凝胶板上两凹孔中加入含有两种不同的抗原成分，其中一个抗原含有两个抗原的组分（A-xy和A-x），下凹孔中加入的抗血清含有抗上述两种抗原的特异性抗体（Anti-x和Anti-y），扩散反应后能形成部分融合的沉淀线。图（4）是在凝胶板上两凹孔中含有两种不同的抗原（抗原A和B），下凹孔中含有抗原A和B的两种特异性抗体，扩散反应后能形成了相互交叉的沉淀线或抗
原性相异图。图（5）是在凝胶板上两凹孔中含有不同的抗原混合液（A+B和B+C），下凹孔中含有各种抗原组分的特异性抗体（Anti-A，Anti-B，Anti-C），扩散反应后能形成多种的沉淀线和抗原性相同或抗原性相异的综合图形。
图1 图2 图3
图4 图5
对扩散中形成的不同沉淀线示意图
以上这些反应都是在各个凹孔中抗原抗体溶液浓度大致相同的情况下出现的，如果有差异则沉淀线会有所不同。沉淀位置的偏移主要与抗原抗体的比例有关，若抗原量相对多一些则偏向抗体孔，反之偏向抗原孔。
免疫扩散法，样品用量少，操作简单，反应灵敏。蛋白质样品含量很低，而且其它方法难以检测的都可以用此方法测定。 3、试剂与器材
（1）0.1mol/L，pH8.6（离子强度0.05mol/L）巴比妥-巴比妥钠缓冲液巴比妥钠10.3g，巴比妥1.84g溶解后，定溶至1000ml。 （2）琼脂或琼脂糖。 （3）0.9%（W/V）NaCl溶液。
（4）抗原、抗血清。
（5）载玻片7.5cm×2.5cm，洗净干燥。 （6）打孔器，直径3-4mm。
（7）染色液：称取氨基黑10B（Amido Black 10B）0.5g溶于冰醋酸：甲醇+1:9的混合液内（V/V）。
（8）洗脱液：冰醋酸：甲醇+1:9的混合液内（V/V）。 4、操作方法
（1）0.1%琼脂的准备：
称取1.32g琼脂或琼脂糖置于三角瓶中，加入蒸馏水60ml，沸水浴中热溶解（直火加热煮沸底部琼脂易变焦）。然后加入60ml0.1mol/L，pH8.6巴比妥缓冲液，混匀，在56℃水浴中保温备用。 （2）琼脂板准备：
取1片洗净干燥的载玻片，放置在水平台上。用吸管取3ml溶化好的琼脂液（56℃左右），控制六上流速放于载玻片的中央，让溶胶自然分布于整块载玻片上，冷却后即成凝胶板。用打孔器在凝固的胶板上按图打孔：孔的直径3-4mm，孔距为5mm。打完孔用针头将孔中琼脂挑去。 （3）稀释抗血清：按试管沉淀法操作。 （4）加样和扩散：
将稀释好的抗血清依次加入外围凹孔内，分别为1:21，1:22，1:23，1:24，1:25，1:26„„（记录顺序）。在中央凹孔中加入抗原（1mg/ml）。加入孔中的抗原、抗体量与凝胶表面平齐为宜。加样后将载玻片放置在一个培养皿内，其中放两层湿纱布以保持一定的湿度。大培养皿放置于37℃水浴或放入冰箱中扩散，几小时或过夜后，即可观察白色沉淀线。出现沉淀线的孔既为免疫扩散的抗血清效价。
双向扩散图
（5）染色及保存：
为了提高沉淀线的可见度和保存标本，可进行如下的染色处理。
漂洗琼脂板：在沉淀线形成后，将琼脂平板浸泡于0.9%NaCl溶液中， 持续48小时，每天换2-3次NaCl溶液，洗去未结合的抗原和抗体蛋白 质；
干燥：浸泡清洗后，用一定大小的滤纸经蒸馏水湿润后覆盖在琼脂平板上，并于℃恒温箱中干燥。然后用蒸馏水湿润，从干透了的琼脂板上剥去滤纸。
染色：将干琼脂板置于培养皿中，加入10%醋酸，浸泡10min。弃去醋酸液后，染色60min。再用脱色液脱色。脱色液每隔15min换一次，直至无染料洗下为止。
（4）抗血清纯度鉴定：
检测抗血清的纯度（单位性）常用的方法是交叉试验。即在双扩散实验中，改换抗原成分，这种抗原的性质很近似产生抗血清的抗原。当在双扩散试验中，这种抗原能于抗血清产生沉淀反应时，称为有交叉反应。说明抗血清部不纯，不是单价抗血清。若这种抗原与抗血清不产生沉淀反应，则称为无交叉反应，说明抗血清较纯。如双扩散法试验说明：兔抗猪生长激素的抗血清，与羊生长激素有交叉反应说明猪、羊生长激素具有同源性，且亲缘关系较近。抗血清的纯度还可以用免疫电泳法测定。
实验八 多酚氧化酶（PPO）扩散免疫电泳
一、实验原理
免疫电泳是将电泳与免疫双扩散法相结合的技术。其基本原理是先将蛋白质抗原在琼脂板上进行电泳使之分成许多组分，然后再用特异性免疫血清向蛋白质各组分进行扩散。当抗原、抗体相互扩散相遇且比例适合时，即可形成不同的沉淀线。
免疫电泳法是鉴定蛋白质的重要方法之一，其法简单易行，分辨率很高，如血清蛋白质分析中，只需要极少量的血清，经电泳后即可分离出近15-20种蛋白质组分。在电泳分离之后，需要鉴定其中的成分，如清蛋白，只要用特异性清蛋白的免疫血清进行免疫扩散反应，若样品中有清蛋白即可显示出沉淀线来。
二、实验试剂材料及器材
（1）1.5%琼脂：配制方法免疫双扩散法
（2）抗原、抗体
（3）0.1m0l/L，pH8.6巴比妥盐缓冲液，同免疫双扩散法。
（4）染色及脱色液：同免疫双扩散法。
（5）7.5cm×2.5cm载玻片
（6）打孔器，直径4mm
（7）挖槽刀，在厚1mm的硬纸片两边夹子固定两叶刀片。
（8）电泳仪
三、操作方法
（1）载玻片的准备：
所用载玻片应用硫酸洗液浸泡，以水冲洗至无酸为止，贮存于75%的乙醇内，用前擦干而不要留下布毛，做到洁净无油腻。
（2）琼脂板准备：
将洁净的载玻片放置在水平台上，用吸管吸取3ml准备好的1.5ml琼脂板（56℃），匀速放于载玻片的中央，使胶液覆盖于载玻片上，要均匀平整，不带气泡。待凝固后，放入有湿纱布的大培养皿内，贮存于冰箱备用，琼脂平板最好在使用前24小时内准备。使用时取出，用打孔器和挖槽刀打孔和挖槽。也可以将预制好的有机玻璃条放在载玻片的中央，再将琼脂胶
液放于载玻片上，待冷凝后，取出有机玻璃条，即形成一条槽，即扩散槽。
（3）加样：
用微量进样器取待测蛋白质溶液（血清样品大约10l左右），放入凹孔内。
（4）电泳：
将凝胶板（随同载玻片）放入电泳槽，两边电极槽中加入0.1mol/L pH8.6巴比妥盐缓冲液。用三、四层纱布或滤纸作桥，连接电极缓冲液和琼脂板。盖上电泳槽盖。接通电源，调节电压为6V/cm（共约45V左右），电泳40-60min。断电后取出琼脂板胶。
（5）免疫扩散：
取出琼脂胶板后，将扩散槽中的琼脂或预先放的有机玻璃条出去，用微量进样器取适当稀释的抗血清（预先经试验确定），加到扩散槽内（大约需50l）。然后将琼脂胶板放在湿润的大培养皿内，在室温或冰箱中扩散24小时，观察其沉淀线的生成。
（6）结果处理：
直接照相记录沉淀线或用染色法（见双扩散法）观察和保存。
实验九 多酚氧化酶（PPO）火箭免疫电泳
一、实验原理与要求
在适当的免疫条件下，给某种动物注射外源蛋白质，一定时间以后，在该动物（免疫动物）体内发生免疫反应，血液里就产生免疫球蛋白（Ig），外源蛋白质称为抗原。产生的免疫球蛋白称为抗体。这种抗体与诱导产生该抗体的抗原，有特异性结合的特征——特异性免疫沉淀。定量免疫电泳（又称火箭免疫电泳）就是基于抗原在含有抗体的凝胶中进行电泳移动，与相应的抗体在比例合适时形成特异性沉淀，不同的抗原-抗体形成各自的特异性沉淀，而沉淀一般以峰的形式出现。这种沉淀峰的面积，或峰高与抗原-抗体之比，在一定浓度范围内呈线性关系。
控制好一定条件，使大多数抗体分子在凝胶中不移动。而当具有不同迁移率的龛影分子移动时，一开始与之有特异结合的抗体也跟着抗原在凝胶移动。但随着时间的推移，在抗原上结合到的抗体分子越来越多。移动到某一距离达到合适的比例时，就产生特异性的免疫沉淀。这一点通常称为等价点（equivalence point）。一旦出现沉淀，即使再继续电泳，沉淀的位置将不再改变。但是，将会有更多的抗体与之结合，使沉淀变得清楚。
沉淀峰的面积与这个电泳体系中抗原和抗体的浓度有关，其关系如下：
沉淀峰面积+K×抗原的浓度/抗体的浓度
K：在标准量免疫电泳中测得的系数
因此，可以控制抗体浓度保持恒定。通过在标准量免疫电泳中得到的沉淀峰面积以参考溶液中蛋白质的面积作比较，然后得到一个特定蛋白质的免疫定量。
定量免疫电泳（又称火箭免疫电泳）的基本条件：
在电泳时，抗体不移动。这样，在整个电泳过程中移动抗原周围的抗体分布始终是恒定不变的。因此，要满足这样一种特定的环境，通常的电泳分离应在pH8.6的条件下进行。因为只要在这个pH条件下，几乎所有的蛋白质都带有负电荷，并向阳极移动。而作为抗体的-球蛋白虽带有少量负电荷，也要向阳极移动。但如果采用1%琼脂糖来代替琼脂，则其电渗作用能有效地抵消向阳极移动的力，最终达到使抗体在电场中不移动的目的。
一般来说，只有那些具有向阳极移动速度较快的蛋白质，才能用免疫电泳进行定量检测。但等电点pI接近8.0的一些蛋白质，就难以用定量免疫
电泳进行检测定量。原因是，在pH8.6的条件下，进行电泳，这些蛋白质的移动距离很小，无法准确定量。为解决这个问题，可以用价甲酰化、乙酰化或氨甲酰化进行处理，使这些蛋白质带有更多的静负电荷。这样就能在pH8.6的条件下，加快向阳极移动的速度，达到准确定量的目的。
酰化反应的常用条件是：
蛋白质样品溶液0.3%甲醛稀释到分析所要求的浓度后，置室温反应20-30min。其反应式为：
H H COOH H COOH
C=O + N-CH-R C=N-CH-R + H2O
H H H
这个反应抑制了蛋白质中氨基的解离。因此，这可增加蛋白质解离的静负电荷数。
二、常规定量免疫电泳（火箭免疫电泳）的方法
常规定量免疫电泳，又称火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis），因为样品是从一定大小的起始凹孔中朝一个方向移动，形成的抗原-抗体的沉淀峰形似火箭而得此名。在一定的浓度范围内，形成的沉淀峰高与所加的样品浓度呈正比。一般沉淀峰高在5-60mm之间时，定量比较正确，测定的精度一般超过95%。这个方法要求使用单价抗血清。如果达不到单价的要求，则测定的精度就会相应降低。
如果有特异的抗血清，大多数蛋白质均可以用这个方法进行检定。定量准确与否，依赖于抗血清的有效程度。只要在得到纯物质时，测定出的浓度才是真实可信的。
在pH8.6的环境中，带有负电荷的一些蛋白质可以很方便地用这个方法进行测定。但是，对于那些带有正电荷的，或静电荷为零的蛋白质，就不适于应用这个方法。例如：免疫球蛋白（Ig），在pH8.6时，静电荷几乎等于零。因此，如果要将免疫球蛋白（Ig）作为抗原来定量测定必须经过处理，使其增加静电荷后，才能用这个方法对其进行检定。经常使用的处理
方法是前面提到的乙酰化、甲酰化或氨甲酰化。
1、火箭免疫电泳所需的试剂
（1）电泳支持介质必须是琼脂糖：
一般配制成1.5%的浓度并分装成若干小瓶，每瓶约30ml。使用时将小瓶置于沸水中，使琼脂糖熔化，并保持在52℃水浴中备用。
（2）缓冲溶液：
常用的缓冲溶液为0.2mol/L，pH8.6的巴比妥缓冲液。配制方法是：206g巴比妥钠+40g巴比妥酸，用蒸馏水定溶到1000ml。如有必要，可加10g叠氮钠，或加10ml的5%麝香草酚的异丙醇溶液作防腐剂。这样配制的缓冲液为贮备液。
用于电泳：将上述贮备液稀释6倍成0.02mol/L，pH8.6 。
用于制板：将上述贮备液稀释3倍成0.04mol/L，pH8.6 。
（3）染色溶液和脱色溶液：
a.0.5%考马斯亮蓝
b.1%氨基黑10B
两者用甲醇：水：冰醋酸（45:445:10）混合液作溶剂配制。该溶剂也是脱色剂。
（4）抗体（抗血清）
家兔或羊的抗血清常可用于定量免疫电泳，如果要得到精确的结果，必须使用单价抗血清。
2、火箭免疫电泳操作方法
（1）电泳板的制备：
火箭电泳可以在大小不同的玻璃板上进行。但是使用的似乎是8×8cm和20×10cm两种尺寸。铺在玻璃板上的凝胶厚度一般在1-2mm之间，最适厚度为1.5mm，太厚或太薄均会影响定量的准确性。
对于8×8cm的板，需用5ml的1.5%(W/V)的琼脂糖与等体积含有一定量某种价抗血清的0.04mo0l/L巴比妥缓冲溶液混匀，趁热铺在玻璃板上，待冷却凝固后使用。抗血清的准确用量应该预备实验决定。即加入不同量的抗血清，用一定量的抗原进行火箭电泳，选出沉淀峰高在2-5cm之间的相应
的抗血清浓度，就是最适的抗血清用量。一般在50-100l之间。
如果实验室温度较低，制板时玻璃板需预热保持一定温度。在玻璃板上上倒凝胶溶液时，必须小心避免混入气泡。
琼脂糖凝胶大约15min后凝固。因此，在这一段时间内玻璃板必须始终保持水平位置。胶凝固后，在板的一端约1cm处用打孔器打孔，作为样品电泳时的起始位置。应按照事先画好起始孔位置以及孔间距离的样板进行打孔，借以保证起始孔位在同一直线上，并具有相同的孔间距离（一般为5mm）。
起始孔大小决定于样品用量。一般的关系是，直径1.7mm的孔可加样2l，2.5mm直径的孔可加样5l，直径4mm可加样10l。
对于20×10cm的板，凝胶和缓冲液的用量各增加3倍。即15ml凝胶溶液和15ml缓冲溶液混合。其余步骤同前。但为了制成均匀一致的凝胶板，铺凝胶前玻璃必须预热至50℃。
（2）电泳：
将制备好的凝胶电泳板放在合适的电泳槽中，板的两端用滤纸或吸水纸与电泳槽中的缓冲液相连，滤纸芯覆盖到凝胶面上至少5mm。连接要均匀、平整，变遍及整个电泳板的宽度。打有样品孔的一端接负极，接通电源，调节电压到1V/cm，然后，在通电的情况下用微量注射器将样品溶液旧土、加入到起始孔内。
精确的样品用量，根据样品的性质、测定的目的，通过预备试验来确定。通常是加2-5l/孔。
样品加完后，增加电压到8-10V/cm进行电泳。电泳时间的长短则随样品和所加电压的不同而异。例如：用上述条件，血清中的白蛋白分离需要约2小时，那么，电泳移动比白蛋白慢的一些球蛋白的分离，就需要更多的时间，有时可达5小时。
（3）检定：
完成电泳分离后，关闭电源，取出电泳板，并在其面上覆盖一层滤纸。滤纸与凝胶面的接触应紧密平整，无空隙或折叠。然后，在滤纸上上面再放吸水纸，其厚度不少于1cm。让其自行吸水15-20min。之后，取下吸水纸和滤纸。凝胶板用热吹风干燥。接着，将干燥的凝胶在上述染色液中浸泡
15min。取出后。用脱色液洗涤两次，时间为10-20min。最后，用甲醇淋洗至没有背景颜色为止。应注意淋洗时间不宜过长，一般为5min左右。否则染色的分离斑点也有被洗掉的危险。
定量测定是根据峰高—浓度曲线来计算。染色结束红，分离图谱进行照相放大，然后，再量峰高。
应该注意的是：被测样品和标准样品所用的电泳板大小/起始样品孔位置以及其他操作必须完全相同。
这个方法的灵敏度依赖于分析体系，抗原与抗体的相对浓度。降低抗体的浓度，可以提高灵敏度。但由于染色灵敏度的限制，一般蛋白质量低于0.3g/ml就难以检出。倘若抗体用同位素标记，检测的灵敏度可以显著提高，一般可以提高40-60倍。
三、 操作中应注意的问题
（1） 通常使用的琼脂糖浓度是1%，应煮沸分装备用。煮沸是为了溶解 澄清，但反复煮沸琼脂糖溶液易变黄。所以应分装备用以减少熔化次数。冬季制板时，底版（一般用玻璃板）需预热至60℃左右。将熔化的琼脂糖溶液铺满整个底版面,，时间越快越好。一般最好不超过10秒钟，倾倒琼脂糖溶液时，必须连续液流，不能间断。否则有可能造成气泡。
（2） 电泳后非沉淀蛋白的去除：
这常是一个必不可少的步骤。用压片比较方便。方法是：电泳后在胶面上覆盖一张滤纸，注意不应有气泡在胶面与滤纸之间。在其上再加5-8层滤纸，并用一块厚玻璃板压在其上，玻璃板上再加适当的重物。这样加压20min左右，就压成一薄层胶片。小心取下重物、玻璃板和几层滤纸，将凝胶片（连同底板）浸于0.1mol/L NaCl溶液中15-20min，水洗15-20min，重复盐浸和水洗一次，再用上述方法压片15-20min，最后使胶片在热气流中干燥10-20min，就成去除非沉淀蛋白的凝胶干片。
（3） 火箭免疫电泳的先决条件之一是：
让抗原在一个抗体不迁移的pH条件下发生电泳移动。抗原的氨基甲酰化可以增加其向阳极移动的速度。但是，抗体的氨基甲酰化作用不是使它
移动，而是降低它的pI，使它在更低的pH条件下移动。由于氨基甲酰化的程度不一样，可以做到在pH4.5-8.6的范围内，抗体都不会移动。因此，利用氨基甲酰化方法可以极大地定量免疫电泳的应用范围。例如：经氨基甲酰化的免疫球蛋白已可用于人体IgG的免疫电泳定量分析，其条件是pH5.0。氨基甲酰化的抗体应在4℃冰箱中保存。
（4） 在电泳过程中，整块凝胶板上的电场强度的均匀性是极为重要的 因为定量的依据是沉淀峰的高度，而沉淀峰的高度在其他条件下一致的情况下，与电场强度呈正比。因此，必须使整个凝胶面上的电场强度一致。这也要求连接凝胶板和电极缓冲液之间的导电芯必须和凝胶面的宽度完全一致。
（5） 在定量分析的情况下，如果一块凝胶板上需要点若干个样品，为 首尾之间各个样品的沉淀峰能作为分析比较，应在通电情况下（1-2V/cm）点样，并且在5min内完成全部点样。这样做才能基本避免 扩散的影响。
待样品和已知标准样品的定量比较，除比较沉淀峰高低外，还要比较沉淀峰面积，可能会更准确。
所用的标准样品溶液或参考溶液和样品中的蛋白质必须有相同的免疫学性质。如果只有部分相同就会引起定量误差。血清蛋白的定量应用混合血清。因为，有好多因素会影响沉淀峰的高度，所以每块凝胶板上都必须加参考溶液进行电泳比较。
（6） 未知待测样品和参考样品最适稀释度的选择也是应注意的问题。种 选择主要取决于需要包括浓度范围以及所容许的定量重复性。如果事先知道待测样品中蛋白质的浓度范围，就可以容易地作出待测样品的稀释标准。大多数的待测样品稀释浓度可以处在参考溶液的稀释范围内。
（7） 关于检测的敏感度和方法的重复性问题：
一般凝胶中 使用较少的抗血清，如：0.1%(V/V)的抗血清，可增加检测的敏感度。但若使用染色方法蛋白质浓度低于0.3mg/L，就不大可能检测出来。若利用同位素标记抗体的办法其检测的灵敏度至少增加60倍。方法的重复性与测定条件的一致性密切相关。常用求算的标准差（standard deviation，简称SD）来表示重复性的好坏。
（8） 如果使用电压太大，起始样品孔中的缓冲液有可能会由于电流太干。 这样，就会使样品蛋白质的移动发生变化，移动前沿在凝胶表面移动得更快。如果凝胶层太厚，会产生上下的温度梯度。如果凝胶因电流太大造成过热，接着又骤冷，会使大量水滴凝结在凝胶表面，这样就容易使沉淀峰改变位置，甚至会产生不规则的沉淀痕迹和拖尾。
（9） 峰形不规则和弯曲问题：
这主要原因是由于凝胶板与导电芯之间接触不良，或是凝胶板厚薄不匀。其结果是电流大小不一致，电场强度与样品的移动不呈线性。也可能是由于凝胶表面蒸发干燥而收缩，电阻降低，使电流变大造成的。
（10） 有时会发现电泳结束后没有沉淀峰出现。当然，最明显的原因凝 胶中不含抗体，或没有相应的特异性抗体，也有可能是抗原－抗体比例不合适，正负电极接反、pH变化太大、冷却不够、电场强度太大、凝胶表面凝结水滴、凝胶与底板剥离，或接线断开等。
如果抗血清中含有抗其它一些组分的抗体，或者某些蛋白质之间存在部分免疫化学一致性，就可能出现额外的沉淀峰（线）。通过导电芯进入凝胶板中的一些杂质，特别是一些蛋白质，也可产生沉淀线（峰），这可以在两者之间放一层半透膜来表面。有时候在电泳过程中，电泳突然中断一段时间，也可能会造成虚假的沉淀带。电泳时间不够，过早停止电泳，形成的抗原－抗体沉淀峰没有峰顶，或模糊不清的沉淀带，无法进行定性和定量分析。
实验十 Western bloting技术
一、目的与原理
Western bloting技术是用来检测蛋白表达的特定的、灵敏的方法。主要由蛋白质的SDS－PAGE、电转及杂交几部分组成。Western印迹法检测蛋白的敏感性约为1-5ng，0.75mm厚的SDS-PAGE板的一个孔可上总蛋白量约为100μg，所以只要被检蛋白不低于总蛋白量的万分之一，即可被检测出来。如果所分析的样品为未知时，应同时作阳性对照。 杂交技术主要有NC膜的封闭， 靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋白的一抗与二抗的反应，显色等几部分构成。该技术的原理及过程主要为转移到NC等膜上的蛋白带。用其它蛋白作为封闭液，将膜上余下的其它蛋白可结合点封闭。加入与待检测目标靶蛋白有特异性的第一抗体，经免疫反应，一抗将与目标蛋白结合，再经用洗膜液洗涤后，膜上仅在靶蛋白上结合有第一抗体。再加入与第一抗体有免疫特异性的二抗，使之与一抗反应，反应后，经洗膜液洗涤，二抗就仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体，所以通过酶标反应，在显色液中，膜上结合靶蛋白－一抗－二抗的位置即将呈现一定的颜色。
二、材料与方法
1.材料：
待检测蛋白
2.仪器：
电转移槽，电泳仪，塑料封口机，摇床
3.试剂：
转移缓冲液：
48 mM Tris, 39 mM 甘氨酸, 0.037% SDS 同时加20%甲醇。 封闭液：
1% (W/V) 脱脂奶粉,溶于TBST中。
TBST：
150 mM NaCl,
50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
0. 01% antiform A
0.02%叠氮钠
第二抗体稀释溶液：
1% (W/V) 脱脂奶粉,溶于TBST中
0. 5% Tween 20
辣根过氧化物酶显色液(可用Ⅰ或Ⅱ)
Ⅰ 取6mg diaminobenzidine tetrahydrochloride 溶于9ml 100mM
Tris-HCl(pH7.6)崐中，加入1ml 0.3%(w/v) 2‟的NiCl或2‟的CoCl，过滤
去除沉淀。取10μl 30%双氧水与上液充分混匀。注意，此液必须新鲜配制。
Ⅱ 取20mg,4-chlor-1-raphthol于20ml冷甲醇中，另取60μl30%双氧
水，混匀。
注意，此液必须新鲜配制。
三、方法与操作步骤：
（1）SDS－PAGE电泳见实验四
（2）电转
1 剪6块3mm滤纸和一块NC膜；
2 将剪好的3mm滤纸和NC膜在转移缓冲液中浸泡3-5分钟；
3 按下列过程安装转移装置,将塑料支架平放在含转移缓冲液的托盘
中,在塑料支架上放一块海绵
4 将3块3mm滤纸对齐放在海绵上,然后依次将NC膜、凝胶、及另3块
虑纸和海绵放上；
凝胶一面向负极；
6 接通电源电压40伏，电流0.17-0.2Ａ，转移1.5-6小时；
7 转移结束后，取出塑料支架,依次取掉各层,用铅笔在膜的上沿作 好标记，切下其中一个孔所对应膜的一半,用氨基黑或考马士亮兰
染色,检查转移效果；
8 将其于的NC膜放在一张干净的３MM滤纸上，室温干燥30-60分钟； 9 NC膜的封闭：
5 用塑料支架夹尽上述各层，放入电转移槽内，NC膜一侧向正极，
将经电转移并干燥的NC膜放于一平皿中，加入封闭液（液面需盖 过胶面）室温下轻轻遥荡2-3小时；
10 将第一抗体用封闭液稀释，稀释度由预实验确定，但可参考下列 数据：
多克隆抗体，1:100-1:5000
培养的杂交瘤细胞上情液，1:100
鼠腹水细胞1:1000-1:10000
11 将B中封闭好的NC膜，放入塑料袋中，加入一抗，加入量为0.1ml 一抗/cm2NC膜，赶尽塑料袋内所有气泡，封口机封口，4℃下轻轻 震荡2小时。
12 洗膜：
反应结束，将塑料袋剪开，弃去反应液，用PBS洗三次，每次10 分钟；
将膜从PBS溶液中转至150 mM NaCl,50 mM Tris-HCl(pH7.5)溶液 中室温下轻轻震荡10分钟；
13 将二抗用二抗稀释液稀释，稀释度一般为1:200-1:2000； 将膜放入一塑料袋中，加入二抗溶液，加入量一般为0,1ml二抗溶 液/cm2膜，封好塑料袋，在室温下轻轻震荡１小时；
14 剪开塑料袋，取出NC膜，在150 mM NaCl,50 mM Tris-HCl(pH7.5) 溶液中冲洗1-5次，每次10分钟。
15 将膜放入显色液中，室温下轻轻摇动；
16 待条带出现后（约显色1-3分钟），立刻用水洗膜，然后转入PBS 中， 然后拍照实验结果。
实验十一 亲和层析法分离纯化胰蛋白酶
一、实验目的与原理
生物大分子化合物的重要特征之一是具有与某些相对应的分子通过次级键或共价键专一结合的能力即亲和力。例如酶与抑制剂之间，抗原与抗体之间，结合的双方不仅是专一的，而且结合以后可以在不丧失生物活性的基础上用物理或化学的方法进行解离。根据这一特性，如果把具有亲和力的一对分子的某一方连接于水不溶的固相载体上作为固定相，那么另一方随着流动相流经该固定相时，双方便亲和结合为一个整体。然后只有改变某种物理条件或化学条件使结合的双方解离，即能得到与固定相有特异亲和力的某一特定物质。这种利用生物分子和相对应分子之间亲和结合和解离性质而建立起来的层析方法称之为亲和层析。
亲和层析作为一种新型的分离纯化技术，可以用来纯化各种酶、抗体、抗原、维生素结合、传递蛋白、激素和药物的受体、核酸以及其他生物大分子化合物。与一般的提纯生物大分子化合物的方法相比，亲和层析具有简单、快速、得率和纯化倍数高等显著特点，尤其适合实验室规模的微量生物大分子化合物的分离纯化。但是，亲和层析也有其局限性。由于某一种生物大分子化合物只与特定的配基之间具有亲和力，因此针对每一个分离对象不仅需要寻找和制备专一的固相配基，而且还需要选择特定的层析条件。几乎没有统一的方法可供任意配套。
用于生物活性分子固相化的材料首先要求能够功能化，即具有能活化或修饰的功能基团，以使配基与之结合，除此之外，固相化材料必须具有稳定的物理化学性质，优良的流通性，非专一性吸附小等特性。常用的固相载体有纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和交联琼脂糖等。
为了将配基偶联与固相载体上，需要使固相载体活化，即使载体具有与配基进行反应，生成共价偶联物的性质，其方法根据固相载体的性质而定。琼脂糖、葡聚糖或纤维素活化最常用的方法是溴化氰法，此外，也可以用均二氯三嗪或三氯三嗪、高碘酸盐、环氧乙烷等方法。活化了的固相载体与配基偶联，便可得到亲和吸附剂。
适合亲和层析法来分离纯化的物质和他们的配基有
本实验将胰蛋白酶抑制剂－鸡卵粘蛋白与Sepharose 4B偶联为亲和层析拄，用以提纯胰蛋白酶。通过实验学习和掌握蛋白质的亲和层析原理与技术。其实验内容为：
1.鸡卵蛋白的制备。
2.Sepharose 4B的活化和酶抑制剂的偶联。
3.胰蛋白酶粗制品的亲和层析。
二、材料与方法
1.材料与试剂：
（1）制备鸡卵粘蛋白
10％ TCA，用固体NaOH调pH至1.05～1.10，需要50 ml。
5 N HCL，5 N NaOH
冷丙酮
BAEE－0.05 M，pH 8.0 Tris－HCL缓冲液（每ml含0.34BAEE和2.22 mg CaCl2），50 ml。
胰蛋白酶液
新鲜鸡蛋2只
pH 8.0，0.1 M Tris－HCL缓冲液
（2）Sepharose 4B的活化和偶联
Sepharose 4B 7 ml
1.5 M Na2CO3 250 ml
0.1 M NaHCO3（含0.5 M NaCL）pH 8.5 1000 ml
0.1 M Hcl－Gly pH 2.8 100 ml
0.2 N 甲酸 250 ml
0.2 M Tris－HCl pH 7.5 500 ml
0.1 M Tris－HCl pH 7.5,（含0.5 M KCl,0.05 M CaCl2）500 ml 0.1 N 甲酸钾－0.5 N Kcl pH 2.5 500 ml
0.1 N Na2CO3－NaHCO3 pH 9.5 100 ml
（3）亲和层析
0.1 M Tris－HCl pH 7.5（含0.5 M KCl,0.05 M CaCl2）200 ml 粗胰蛋白酶液约50 ml
0.1 N 甲酸钾－0.5 M KCl pH 2.5 100 ml
2.仪器器材
抽滤瓶500－1000 ml
层析拄
紫外分光光度计
紫外蛋白监测仪
烧结漏斗
移液器
磁力搅拌器
3.方法与步骤
（1）鸡卵粘蛋白的制备
鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白是糖蛋白，分子量为28000，但糖成份上有差别。有四种不同组份，等电点的范围为pH 3.9－
4.5,280 nm的消光系数为：A＝4.13（1％,1 cm）。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定。 制备方法：
取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50 ml，置于烧杯中，外用温水浴25℃～30℃，在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积的三氯乙酸－丙酮（1:2V/V），立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终pH约3.5，再继续搅拌30 min，然后在4℃放置过夜。
次日用布氏漏斗抽滤，得黄绿色清液。
边搅拌边加入4℃预冷的丙酮200 ml沉淀蛋白，在4℃放置2 h之后将上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于4000 rpm离心5 min，收集沉淀。 将沉淀溶于10 ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4 h，换水两次，再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜，4000 rpm离心10 min，去除不溶物，取少量上清液，用水稀释适当倍数，测A280计算所得蛋白总量。
测定鸡卵粘蛋白抑制活力：
按附：测定胰蛋白酶活力方法，取BAEE溶液2.8 ml，加入o.15 ml 0.1 M Tris－HCL pH 8.0缓冲溶液，加入50 μl胰蛋白酶溶液，立即混匀，于25℃下用紫外分光光度计测定A253 0.5 min读数一次，测3 min。
加鸡卵粘蛋白后胰蛋白酶剩余活力的测定：将鸡卵粘蛋白和胰蛋白酶按一定比例混合，使二者充分结合后，测混合液的胰蛋白酶活力，测得抑制后的剩余活力，一般所用粘蛋白量抑制50％的胰蛋白酶活力为宜。此实验中，可按以下量操作：
取鸡卵粘蛋白液，用无离子水稀释成 0.2 mg 蛋白/ml,取70 ml稀释后的鸡卵粘蛋白液加入140 mlTris－HCl pH 8.0，0.01 M的缓冲液。再加入70 ml蛋白酶液，摇匀，于室温下放置10 min，取0.2 ml加入到2.8 ml BAEE溶液中，搅匀后测A253，0.5 min记录A253一次，共记录3 min，计算胰蛋白酶经抑制剂作用后的剩余活力。
计算抑制比活力：抑制一个胰蛋白酶活力单位（BAEE单位）所需的鸡卵粘蛋白量定为抑制剂的一个活力单位，抑制剂的比活力单位为每 mg 的抑制剂所能抑制胰蛋白酶的比活力单位数。在本实验中由下式计算；
抑制比活力＝（A253/min）/{ 0.001×鸡卵粘蛋白用量（mg）}
A253/min－不加抑制剂的每min A253变化值减去加抑制剂后的每min A253的变化值。
0.01 mg－鸡卵粘蛋白的用量。
若抑制活力>5000 BAEE单位/mg，则此粘蛋白经丙酮沉淀制成蛋白成品后可直接用于偶联反应。若抑制活力较小，则需进一步用DEAE－纤维素柱层析纯化。
丙酮沉淀鸡卵粘蛋白：将经过脱盐的鸡卵粘蛋白用HCl调至pH 4，测量体积后转入三角瓶中，加入2倍体积的冷丙酮，加盖置于冰箱中，次日，于4000 rpm离心20 min,收集沉淀，置于干燥器中抽去丙酮，加盖置于冰箱中保存。
附：胰蛋白酶的活力测定：
胰蛋白酶的催化专一性表现在对于由氨基酸所形成肽键、酰胺键和酯键，且对酯键的催化再用灵敏度强于另两种键，本法采用人工合成的N－苯甲酰－L精氨乙酯（BEAA）为底物，研究胰蛋白酶的特异催化活性。N－苯甲酰－L精氨乙酯在波长253 nm下的紫外吸收远远弱于N－苯甲酰－L精氨酸（BA）的紫外光吸收。在胰蛋白酶的催化下，随着酯键的水解，N－苯甲酰－L精氨酸逐渐增多，随之反应体系的紫外吸收相应增加，由此即可建立测定胰蛋白酶活力的特异方法。
胰蛋白酶的BAEE单位定义是：在规定的实验条件下，引起每min光密度值增加0.001的酶量定为1个BAEE单位。
实验肽键：
测定容积 3.0 ml
比色杯光程 1.0 cm
波长 253 nm
温度 25℃
底物溶液 2.8 ml
酶溶液 0.2 ml
溶液配制：
0.05 M Tris－HCl缓冲液，pH 8.0
50 ml 0.1 M Tris＋29.2 ml 0.1 N HCl＋水至100 ml
底物溶液：50 ml 0.05 M Tris－HCl缓冲液pH 8.0＋111 mg CaCl2＋17 mg BAEE。即每ml 0.05 M Tris－HCl缓冲液pH 8.0（含有0.34 mg BAEE和2.22 mgCaCl2）。
酶溶液：制备流程中的酶蛋白原液，稀释约200倍，现配现用。稀释倍数应以控制溶液的蛋白质含量为10－20 r /ml为宜，稀释液用0.001 N Hcl。
测定方法：选好两只石英比色杯，一只比色杯加2.5 ml底物溶液，0.2 ml 0.001 N Hcl，作为空白对照，另一只比色杯中加入2.8 ml底物溶液，此时应先将分光光度计调好零点，然后于第二只比色杯中加0.2 ml酶溶液（适当稀释），迅速混匀，计时测定。每隔30秒钟读数一次，待光密度值增加趋于平稳后，停止测定，计算出每min平均O.D.253增加值（只取直线部分）。根据下式计算样品液中的BAEE单位和比活力：
BAEE单位＝（A253 / min）/ （0.001×0.2）×D
比活力（BAEE/ mg）＝（BAEE单位 / ml）/ { 蛋白质含量（mg/ml）}
＝（A253/min×A1cm280）/（A280×0.001×0.2）×D2 / D1
D1：为测定蛋白质含量的稀释倍数。
D2：为测定酶活力的稀释倍数。
（2）Sepharose 4B的活化及偶联
在碱性条件下，琼脂糖凝胶用溴化氰（CNBr）活化可引入活泼的亚氨基碳酸盐，在弱碱条件下能直接与卵类粘蛋白的游离氨基偶联，生成氨基碳酸盐和异脲衍生物。
活化及偶联方法：取Sepharose 4B沉淀体积7 ml，在烧结漏斗中，用约10倍体积的无离子水抽洗。再用40 ml,1.5 M Na2CO3溶液抽洗2次，得半干滤饼，倒入25 ml的烧杯中，加入20 ml,1.5 M Na2CO3溶液。将此载体悬浮液置于冰箱中，迅速称取1 g CNBr溶于1 ml乙晴中，将CNBr溶液滴加入
冰浴的载体悬浮液中，并用磁力搅拌，反应8 min后，将活化的载体迅速转入烧结漏斗中，用预冷的0.1 M NaHCO3 pH 8.5溶液200 ml抽洗。将半干的活化了的Sepharose 4B加入40 ml,1 M NaHCO3 pH 8.5溶液，搅拌下立即加入用15 ml,0.1 M碳酸钠缓冲溶液 pH 9.5溶解的鸡卵粘蛋白溶液中，于冰浴上轻轻搅拌2～3 h，4℃放置过夜。
偶联量测定：将偶联反应进行了16～20 h的Sepharose 4B„卵粘蛋白从冰箱取出，用烧结漏斗抽滤偶联缓冲液，用o.1 N NaHCO3缓冲液 pH 8.5抽洗多次，用o.1 M HCl„Gly pH 2.8液分次抽洗，用0.2 N 甲酸抽洗至O.D.值小于0.01，并稳定为止。测定每次选出的蛋白量，计算未偶联的蛋白总量，根据参加偶联的蛋白总量计算出偶联上的蛋白质百分率。
（3）胰蛋白酶的亲和层析
卵类粘蛋白在pH 7～8的条件下能与胰蛋白酶专一地结合，而在pH 2～3时又能解离，因而掌握好上柱的pH条件和洗脱缓冲液条件，便可将胰蛋白酶从含杂蛋白的粗酶液中选择性地结合于柱上，待洗去不结合或非专一性结合的杂蛋白后，改变pH值便可将胰蛋白酶洗脱下来。从而达到纯化的目的。由于亲和层析结合的专一性，上柱体积可以比较大，得到浓缩的提纯产品。
亲和层析步骤：
胰蛋白酶粗制品的制备：将1.5 kg猪胰脏剥除脂肪和结缔组织并绞碎；加2倍冷乙酸酸化，在10℃下提取1～2 h，并不断搅拌；用四层纱布过滤，收集滤液，以500 ml酸化水再次将残渣提取1～2 h，汇编滤液；用5 N 硫酸调至pH 2.5－3.0，放置3～4 h，折叠滤纸过滤，收集滤液；加钙至0.1 M，用5 N NaOH溶液调至pH 8.0，加入约1 mg的结晶猪胰蛋白酶，室温搅拌4 h，待测定比活力后即可上柱。
将鸡卵粘蛋白„Sepharose 4B 装柱（1×10 cm）,用pH7.5, 0.1 M含0.5 M KCL，O.O5 M CaCL2的缓冲液平衡，平衡约2～3倍的柱体积。将粗胰酶液上样柱层析。用紫外蛋白监测仪280 nm处监测蛋白吸收峰，随着上柱和流出的杂蛋白量的平衡，吸收峰达到稳定，一旦上柱的胰蛋白酶量超过柱的负荷时，则胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此时应停止样品上样，改