第三节 蛋白质浓度的测定
蛋白质溶液浓度测定方法有多种，下述几种方法可供选用。蛋白质浓度的测定，往往用于计算纯化方法的回收率的重要方法。
一、双缩脲法
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，至令仍广泛采用。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期价段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m?NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
二、Lowry法
此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。
三、紫外吸收法
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：
是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值。是蛋白质溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值。
此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的。因此，对其他蛋白质和其他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此，浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm处的消光系数（）在0.5～2.5之间变化。
所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的α0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58。在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10μl/ml～100μl/ml的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到：
光密度之差求 得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是，蛋白质之间的分子量差异比较大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因pH改变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。
A考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度
(一)实验原理
双缩脲法(Biuret法)和Folin?酚试剂法(Lowry法)的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法)，是根据蛋白质与染料相结合的
原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置(lmax)，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是:
(1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
(2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是:
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g?球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有:去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干扰Lowary法一样)。
(3)标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
(二)试剂与器材
1.试剂:
(1)标准蛋白质溶液，用 g?球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
(2)考马斯亮兰G-250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2.器材:
(1)可见光分光光度计 (2)旋涡混合器 (3)试管16支
(三)操作方法
1.标准方法
(1)取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
(2)加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG-250试剂。
注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
(3)用标准蛋白质量(mg)为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准
曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。
2.微量法
当样品中蛋白质浓度较稀时(10-100mg/ml)，可将取样量(包括补加的水)加大到0.5ml或1.0ml，空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O，考马斯亮蓝G-250试剂仍加5.0ml，同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595
.分光光度法是基于不同分子结构的物质对电磁辐射的选择性吸收而建立起来的方法，属于分子吸收光谱分析。当光通过溶液时，被测物质分子吸收某一波长的单色光，被吸收的光强度与光通过的距离成正比。虽然现在了解到Bouguer早在1729年已提出上述关系的数学表达式，但通常认为Lambert于1760年最早发现表达式，其数学形式为:
T=I/I0=e-kb
其中I0为入射光强，I为透射光强，e为自然对数的底，k为常数，b为光程长度(通常以cm表示)。
比尔定律等同于Bouguer定律，只是比尔定律以浓度来表达。将两个定律结合起来，组成Beer-Bouguer定律:
T=I/I0=e-kbc
其中c为吸光物质的浓度(通常以g/L或mg/L为单位)。将上式取以10为底的对数后，得到线性表达式:
A=-logT=-log(I/I0)=log(I0/I)=εbc
其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数。
上述表达式通常称为比尔定律。它表明，当特定波长的单色光通过溶液时，样品的吸光度与溶液中吸收物浓度和光通过的距离成正比。
在波长、溶液和温度确定的情况下，摩尔消光系数是由给定物质的特性决定的。实际上，测得的摩尔消光系数也和使用的仪器有关。因此，在定量分析中，通常并不用已知物质的摩尔消光系数，而是用一个或多个已知浓度的待测物质作一条校准或工作曲线。
===================================
：①吸光系数：Beer定律的数学表达式为A=kbc，若溶液的浓度c以g/L为单位，b为光径以cm为单位，则常数K称为吸光系数，以a表示，其单位为升/（克·厘米）[L/(g·cm],A=kbc可写成A=abc。②摩尔吸光系数：公式A=kbc中的以为1mol/L,b为1cm时，则系数k称为摩尔吸光系数，以ε表示，单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]，A=kbc可写成A=εc。在实际工作中，不能直接用1mol/L这种高浓度的溶液测定吸光度，而是在稀释成适当浓度时测定吸光度进行运算。ε值与入射光波长、溶液的性质等因素有关。如NADH在260nm时ε为15000，写成ε260NADH=15×103；在340nm时ε为6220，写成ε340NADH=6.22×103。③比吸光系数：如公式A=kbc中的c是百分浓度（w/v）b为cm，则常数k可用E%表示，称为比
吸光系数或百分吸光系数，A=kbc可写成A=E%bc。当待测物的化学结构是已知者可用ε值分析，若所测物的化学结构是未知的，则ε无法确定，此时用比吸光系数分析就很方便。a、ε和E常用作粗定量分析，主要用于定性分析。
B . 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。
此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。
1. 280nm的光吸收法
因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。
许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。
蛋白质浓度 = (A280′10 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml)
(Q 1%浓度?10mg/ml)
2. 280nm和260nm的吸收差法
核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：
纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 ? 1.8
纯核酸的光吸收比值： A280/A260 ? 0.5
含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)
此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。
3. 215nm与225nm的吸收差法
蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。
用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差： 吸收差D= A215 －A225
以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。
本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。
4. 肽键测定法
蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。
进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。
本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱
第三节 蛋白质浓度的测定
蛋白质溶液浓度测定方法有多种，下述几种方法可供选用。蛋白质浓度的测定，往往用于计算纯化方法的回收率的重要方法。
一、双缩脲法
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，至令仍广泛采用。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期价段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m?NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
二、Lowry法
此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。
三、紫外吸收法
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：
是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值。是蛋白质溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值。
此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的。因此，对其他蛋白质和其他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此，浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm处的消光系数（）在0.5～2.5之间变化。
所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的α0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58。在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10μl/ml～100μl/ml的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到：
光密度之差求 得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是，蛋白质之间的分子量差异比较大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因pH改变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。
A考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度
(一)实验原理
双缩脲法(Biuret法)和Folin?酚试剂法(Lowry法)的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法)，是根据蛋白质与染料相结合的
原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置(lmax)，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是:
(1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
(2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是:
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g?球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有:去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干扰Lowary法一样)。
(3)标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
(二)试剂与器材
1.试剂:
(1)标准蛋白质溶液，用 g?球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
(2)考马斯亮兰G-250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2.器材:
(1)可见光分光光度计 (2)旋涡混合器 (3)试管16支
(三)操作方法
1.标准方法
(1)取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
(2)加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG-250试剂。
注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
(3)用标准蛋白质量(mg)为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准
曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。
2.微量法
当样品中蛋白质浓度较稀时(10-100mg/ml)，可将取样量(包括补加的水)加大到0.5ml或1.0ml，空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O，考马斯亮蓝G-250试剂仍加5.0ml，同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595
.分光光度法是基于不同分子结构的物质对电磁辐射的选择性吸收而建立起来的方法，属于分子吸收光谱分析。当光通过溶液时，被测物质分子吸收某一波长的单色光，被吸收的光强度与光通过的距离成正比。虽然现在了解到Bouguer早在1729年已提出上述关系的数学表达式，但通常认为Lambert于1760年最早发现表达式，其数学形式为:
T=I/I0=e-kb
其中I0为入射光强，I为透射光强，e为自然对数的底，k为常数，b为光程长度(通常以cm表示)。
比尔定律等同于Bouguer定律，只是比尔定律以浓度来表达。将两个定律结合起来，组成Beer-Bouguer定律:
T=I/I0=e-kbc
其中c为吸光物质的浓度(通常以g/L或mg/L为单位)。将上式取以10为底的对数后，得到线性表达式:
A=-logT=-log(I/I0)=log(I0/I)=εbc
其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数。
上述表达式通常称为比尔定律。它表明，当特定波长的单色光通过溶液时，样品的吸光度与溶液中吸收物浓度和光通过的距离成正比。
在波长、溶液和温度确定的情况下，摩尔消光系数是由给定物质的特性决定的。实际上，测得的摩尔消光系数也和使用的仪器有关。因此，在定量分析中，通常并不用已知物质的摩尔消光系数，而是用一个或多个已知浓度的待测物质作一条校准或工作曲线。
===================================
：①吸光系数：Beer定律的数学表达式为A=kbc，若溶液的浓度c以g/L为单位，b为光径以cm为单位，则常数K称为吸光系数，以a表示，其单位为升/（克·厘米）[L/(g·cm],A=kbc可写成A=abc。②摩尔吸光系数：公式A=kbc中的以为1mol/L,b为1cm时，则系数k称为摩尔吸光系数，以ε表示，单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]，A=kbc可写成A=εc。在实际工作中，不能直接用1mol/L这种高浓度的溶液测定吸光度，而是在稀释成适当浓度时测定吸光度进行运算。ε值与入射光波长、溶液的性质等因素有关。如NADH在260nm时ε为15000，写成ε260NADH=15×103；在340nm时ε为6220，写成ε340NADH=6.22×103。③比吸光系数：如公式A=kbc中的c是百分浓度（w/v）b为cm，则常数k可用E%表示，称为比
吸光系数或百分吸光系数，A=kbc可写成A=E%bc。当待测物的化学结构是已知者可用ε值分析，若所测物的化学结构是未知的，则ε无法确定，此时用比吸光系数分析就很方便。a、ε和E常用作粗定量分析，主要用于定性分析。
B . 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。
此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。
1. 280nm的光吸收法
因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。
许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。
蛋白质浓度 = (A280′10 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml)
(Q 1%浓度?10mg/ml)
2. 280nm和260nm的吸收差法
核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：
纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 ? 1.8
纯核酸的光吸收比值： A280/A260 ? 0.5
含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)
此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。
3. 215nm与225nm的吸收差法
蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。
用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差： 吸收差D= A215 －A225
以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。
本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。
4. 肽键测定法
蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。
进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。
本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱