病理组织切片的制作
卢文丽 吴中华 方肇勤
（2007/01/04）
一、器材（按一小组，约4-6人）
眼科镊：直无勾10cm 、弯无勾10cm各5把；
组织镊；12.5cm 2把；
眼科剪：直尖10cm 4把；
解剖剪：cr/14，4把；
普通双面刀片：10片/盒×1盒；
染色架：5个；
染色缸：1000ml，14-15个；
切片盒：50片/盒×3盒或100片/盒×2盒；
37度、60度恒温箱：各1个；
磨砂载玻片：50片/盒×3盒；
盖玻片：100片/盒×2盒；
广口瓶：30ml或60ml×20个；
滴管及配套吸头：4个；
玻璃漏斗：φ90 3个；玻璃搅棒：2支
普通粗孔大张滤纸：20张；
φ90mm玻璃培养皿：4个；
中号普通毛笔：2支；
烧杯：500ml 、1000ml 各1个；
量筒：100ml、500 ml、1000 ml各1个；
组织切片机及配套刀片：4台；
摊片用水浴锅：2台；
生物切片石蜡：5盒，熔点：56-58℃；
电子天平：1台；
酒精灯：150ml，4台；
脱水篮：1-2个；
打火机、标签纸、铅笔各一，卷筒纸、乳胶手套、口罩、医用纱布足量。
二．试剂
苦味酸（2.4.6-三硝基苯酚）：30g/瓶×1瓶；
37%~40%福尔马林液：500ml/瓶×1瓶；
冰醋酸：AR，500ml/瓶×1瓶；
无水乙醇：AR，500ml/瓶×10瓶；
二甲苯：AR，500ml/瓶×10瓶；
hematoxylin苏木色素（苏木精）：10g/瓶×1瓶；
酸性品红（曙红丫水溶）：25g/瓶×1瓶；
碘酸钠：AR，500g/瓶×1瓶；柠檬酸：AR，500g/瓶×1瓶; 水合氯醛：AR，250g/瓶×1瓶; 铵矾（ALNH4(SO4)2·12H2O）或钾矾（ALK(SO4)2·12H2O）：500g/瓶×1瓶 蛋白甘油（甘油/鸡蛋清=1/1）：50ml
中性树胶：100g/瓶×2瓶。若中性树胶过于粘稠，可与二甲苯按7/3的比例稀释。 蒸馏水：5000ml
三．实验步骤
（一）固定液、染色液的配置
（1）Bouin氏液
苦味酸饱和水溶液 75ml
37%~40%福尔马林液 25ml
冰醋酸 5ml
苦味酸饱和溶液的浓度为100ml水中加1g苦味酸。
（2）Mayer苏木精液
苏木精 1g
蒸馏水 1000 ml
铵矾或钾矾 50 g
碘酸钠 0.2g
柠檬酸 1g
水合氯醛 50 g
将苏木精溶于蒸馏水内（需要时可微热），加入研细的明矾，摇震助溶（需要时再加温），明矾溶解后，依次加入碘酸钠、柠檬酸、水合氯醛等试剂。配制后即可供使用。
（3）曙红
曙红 0.5~1g
蒸馏水 100ml
混匀后过滤
（二）组织取材
取舌、胸腺、脾、胃、肝、十二指肠等6种脏器。
（三）固定与修块
上午：取组织块入Bouin氏液中，组织块的直径应小于7mm。
下午：修块，用双面刀片将组织块修剪成3~5mm3大小。
若中午取材，则晚上修快。具体修块方法如下表1：
（四）脱水与透明
在以下过程，要求经常晃动组织块，以保证组织块可以充分地与乙醇或二甲苯接触，在每一步骤之后，要充分滤干组织块，一般用筒纸吸干组织块上的液体，以免影响其他液体的浓度，但要防止组织块干燥。全过程约需要4.5h（270min）。
1．75%乙醇 50min
2．85%乙醇 50min
3．95%乙醇 （I） 30min
4．95%乙醇 （II） 30min
5．100%乙醇（I） 30min
6．100%乙醇（II） 30min
7 1/2 二甲苯（乙醇与二甲苯等体积） 20min
8．二甲苯（I） 20min
9．二甲苯（II） 10min（可依据透明效果而定）
透明效果的判断：如组织块颜色加深透明，二甲苯溶液颜色透明，即表明脱水效果很好；如脱水不好，二甲苯溶液颜色会变混浊。使用过的酒精或二甲苯倒入烧杯里以便回收。
（五）浸蜡、包埋与修蜡块
1．浸蜡：可在脱水与透明进行时，将60℃恒温箱打开，使大烧杯内的石蜡充分溶解，待脱水与透明结束后，可将脱水篮整个或包裹在纱布内的组织块转入充分溶解的石蜡里，于60℃恒温箱放置120分钟。
2．包埋：包埋有多种器具，比较简洁廉价的方法是采用纸盒。可在浸蜡的同时将纸盒做好，包埋时将60℃的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将各组织块按一定的顺序排列好，使切面朝下。我们建议，不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件一致，且以便读片和比较。为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板上（或大培养皿内），然后将玻璃板置于80-90℃左右热水上，包埋时蜡盒底部要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较好。组织包埋方法可参见表2。
3．修蜡块：待纸盒内蜡凝固后(若需要使蜡块迅速凝固，可将包埋好的蜡块置于4℃冰水混和物中)。将蜡块取出，用刀片将其修成梯形，通常蜡块大小视组织多少而定，为保证切片顺利，组织块与蜡块边缘之间的距离不得小于2mm。修剪下来的残蜡应回收，以便再用。
（六）切片
在载玻片上擦少量甘油蛋白。可滴半滴甘油蛋白于载玻片上，用手指充分抹匀，呈半干状为佳。
切片厚约4~8μm，通常厚约6μm，细胞小而密的组织如胸腺，可以切4~5μm，而细胞疏的组织，如下丘脑可切10μm。将切片在55℃左右水浴中展开，展开程度以带黄颜色的组织完全摊平为准。
用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切片，斜放在木架上，立即放入37℃烘箱中过夜，一般时间越长效果越好，以切片紧贴于载玻片上呈半透明状为佳。每个组织块捞片2张。
过夜后，将载玻片置于玻片架上，进行下面的实验。
（七）脱蜡、染色与脱水
取出玻片架后，应将玻片架倾斜，以使载玻片上的试剂流尽，然后用筒纸将玻片架和载玻片下缘的试剂吸干，以免影响其他试剂的浓度。全过程约需要50min。
1．脱蜡到水
（1）二甲苯（I） 15分钟
（2）二甲苯（II） 15分钟
（3）100%乙醇 2分钟
（4）95%乙醇（I） 1分钟
（5）95%乙醇（II） 1分钟
（6）蒸馏水浸洗 1分钟
2．染色
（7）苏木精 30秒钟
（8）自来水冲洗1分钟，但应注意不能用水直接冲在玻片上，以免冲走切片。（显微镜下观察效果）
（9）伊红（着色即可） 10秒钟
（10）蒸馏水浸洗 1分钟
3．脱水
（10）95%乙醇（I） 1分钟
（11）95%乙醇（II） 1分钟
（12）100%乙醇 2分钟
（13）二甲苯（I） 2分钟
（14）二甲苯（II） 3~5分钟
（八）封片
将载玻片从玻片架上取下，滴加1~2滴中性树胶，用眼科镊夹住盖玻片的一角，轻轻盖上盖玻片，让中性树胶沿着盖玻片充分展开，之后倾斜载玻片，用筒纸将多余的中性树胶吸干，同时注意避免有气泡的产生，平放载玻片，室温下长期保存。
参考文献：
1.杜卓民主编.实用组织学技术[M].第2版,北京:人民卫生出版社,1998
2.[英]C. F. A卡林著,孔庆雷译[M].组织病理学和组织化学技术手册.北京:科学出版社,1982
附：
中医学综合实验病理组织切片制作时刻表
（1）组织取材、固定：第1天上午或中午
（2）组织修块、固定：第1天下午或晚上
（3）组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片：第2天全天
脱水、透明8:00-12:30 4.5h
浸蜡12:30－14:30 2h
包埋14:30-15:30 1h
修块16:00-17:00 1h
切片17:30-21:30 4h
烘片21:30至第3日早晨
（4）切片染色、封片：第3日
染色1个流程需要50min，染色完后即封片。
整个过程需要3天的时间。
病理组织切片的制作
卢文丽 吴中华 方肇勤
（2007/01/04）
一、器材（按一小组，约4-6人）
眼科镊：直无勾10cm 、弯无勾10cm各5把；
组织镊；12.5cm 2把；
眼科剪：直尖10cm 4把；
解剖剪：cr/14，4把；
普通双面刀片：10片/盒×1盒；
染色架：5个；
染色缸：1000ml，14-15个；
切片盒：50片/盒×3盒或100片/盒×2盒；
37度、60度恒温箱：各1个；
磨砂载玻片：50片/盒×3盒；
盖玻片：100片/盒×2盒；
广口瓶：30ml或60ml×20个；
滴管及配套吸头：4个；
玻璃漏斗：φ90 3个；玻璃搅棒：2支
普通粗孔大张滤纸：20张；
φ90mm玻璃培养皿：4个；
中号普通毛笔：2支；
烧杯：500ml 、1000ml 各1个；
量筒：100ml、500 ml、1000 ml各1个；
组织切片机及配套刀片：4台；
摊片用水浴锅：2台；
生物切片石蜡：5盒，熔点：56-58℃；
电子天平：1台；
酒精灯：150ml，4台；
脱水篮：1-2个；
打火机、标签纸、铅笔各一，卷筒纸、乳胶手套、口罩、医用纱布足量。
二．试剂
苦味酸（2.4.6-三硝基苯酚）：30g/瓶×1瓶；
37%~40%福尔马林液：500ml/瓶×1瓶；
冰醋酸：AR，500ml/瓶×1瓶；
无水乙醇：AR，500ml/瓶×10瓶；
二甲苯：AR，500ml/瓶×10瓶；
hematoxylin苏木色素（苏木精）：10g/瓶×1瓶；
酸性品红（曙红丫水溶）：25g/瓶×1瓶；
碘酸钠：AR，500g/瓶×1瓶；柠檬酸：AR，500g/瓶×1瓶; 水合氯醛：AR，250g/瓶×1瓶; 铵矾（ALNH4(SO4)2·12H2O）或钾矾（ALK(SO4)2·12H2O）：500g/瓶×1瓶 蛋白甘油（甘油/鸡蛋清=1/1）：50ml
中性树胶：100g/瓶×2瓶。若中性树胶过于粘稠，可与二甲苯按7/3的比例稀释。 蒸馏水：5000ml
三．实验步骤
（一）固定液、染色液的配置
（1）Bouin氏液
苦味酸饱和水溶液 75ml
37%~40%福尔马林液 25ml
冰醋酸 5ml
苦味酸饱和溶液的浓度为100ml水中加1g苦味酸。
（2）Mayer苏木精液
苏木精 1g
蒸馏水 1000 ml
铵矾或钾矾 50 g
碘酸钠 0.2g
柠檬酸 1g
水合氯醛 50 g
将苏木精溶于蒸馏水内（需要时可微热），加入研细的明矾，摇震助溶（需要时再加温），明矾溶解后，依次加入碘酸钠、柠檬酸、水合氯醛等试剂。配制后即可供使用。
（3）曙红
曙红 0.5~1g
蒸馏水 100ml
混匀后过滤
（二）组织取材
取舌、胸腺、脾、胃、肝、十二指肠等6种脏器。
（三）固定与修块
上午：取组织块入Bouin氏液中，组织块的直径应小于7mm。
下午：修块，用双面刀片将组织块修剪成3~5mm3大小。
若中午取材，则晚上修快。具体修块方法如下表1：
（四）脱水与透明
在以下过程，要求经常晃动组织块，以保证组织块可以充分地与乙醇或二甲苯接触，在每一步骤之后，要充分滤干组织块，一般用筒纸吸干组织块上的液体，以免影响其他液体的浓度，但要防止组织块干燥。全过程约需要4.5h（270min）。
1．75%乙醇 50min
2．85%乙醇 50min
3．95%乙醇 （I） 30min
4．95%乙醇 （II） 30min
5．100%乙醇（I） 30min
6．100%乙醇（II） 30min
7 1/2 二甲苯（乙醇与二甲苯等体积） 20min
8．二甲苯（I） 20min
9．二甲苯（II） 10min（可依据透明效果而定）
透明效果的判断：如组织块颜色加深透明，二甲苯溶液颜色透明，即表明脱水效果很好；如脱水不好，二甲苯溶液颜色会变混浊。使用过的酒精或二甲苯倒入烧杯里以便回收。
（五）浸蜡、包埋与修蜡块
1．浸蜡：可在脱水与透明进行时，将60℃恒温箱打开，使大烧杯内的石蜡充分溶解，待脱水与透明结束后，可将脱水篮整个或包裹在纱布内的组织块转入充分溶解的石蜡里，于60℃恒温箱放置120分钟。
2．包埋：包埋有多种器具，比较简洁廉价的方法是采用纸盒。可在浸蜡的同时将纸盒做好，包埋时将60℃的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将各组织块按一定的顺序排列好，使切面朝下。我们建议，不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件一致，且以便读片和比较。为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板上（或大培养皿内），然后将玻璃板置于80-90℃左右热水上，包埋时蜡盒底部要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较好。组织包埋方法可参见表2。
3．修蜡块：待纸盒内蜡凝固后(若需要使蜡块迅速凝固，可将包埋好的蜡块置于4℃冰水混和物中)。将蜡块取出，用刀片将其修成梯形，通常蜡块大小视组织多少而定，为保证切片顺利，组织块与蜡块边缘之间的距离不得小于2mm。修剪下来的残蜡应回收，以便再用。
（六）切片
在载玻片上擦少量甘油蛋白。可滴半滴甘油蛋白于载玻片上，用手指充分抹匀，呈半干状为佳。
切片厚约4~8μm，通常厚约6μm，细胞小而密的组织如胸腺，可以切4~5μm，而细胞疏的组织，如下丘脑可切10μm。将切片在55℃左右水浴中展开，展开程度以带黄颜色的组织完全摊平为准。
用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切片，斜放在木架上，立即放入37℃烘箱中过夜，一般时间越长效果越好，以切片紧贴于载玻片上呈半透明状为佳。每个组织块捞片2张。
过夜后，将载玻片置于玻片架上，进行下面的实验。
（七）脱蜡、染色与脱水
取出玻片架后，应将玻片架倾斜，以使载玻片上的试剂流尽，然后用筒纸将玻片架和载玻片下缘的试剂吸干，以免影响其他试剂的浓度。全过程约需要50min。
1．脱蜡到水
（1）二甲苯（I） 15分钟
（2）二甲苯（II） 15分钟
（3）100%乙醇 2分钟
（4）95%乙醇（I） 1分钟
（5）95%乙醇（II） 1分钟
（6）蒸馏水浸洗 1分钟
2．染色
（7）苏木精 30秒钟
（8）自来水冲洗1分钟，但应注意不能用水直接冲在玻片上，以免冲走切片。（显微镜下观察效果）
（9）伊红（着色即可） 10秒钟
（10）蒸馏水浸洗 1分钟
3．脱水
（10）95%乙醇（I） 1分钟
（11）95%乙醇（II） 1分钟
（12）100%乙醇 2分钟
（13）二甲苯（I） 2分钟
（14）二甲苯（II） 3~5分钟
（八）封片
将载玻片从玻片架上取下，滴加1~2滴中性树胶，用眼科镊夹住盖玻片的一角，轻轻盖上盖玻片，让中性树胶沿着盖玻片充分展开，之后倾斜载玻片，用筒纸将多余的中性树胶吸干，同时注意避免有气泡的产生，平放载玻片，室温下长期保存。
参考文献：
1.杜卓民主编.实用组织学技术[M].第2版,北京:人民卫生出版社,1998
2.[英]C. F. A卡林著,孔庆雷译[M].组织病理学和组织化学技术手册.北京:科学出版社,1982
附：
中医学综合实验病理组织切片制作时刻表
（1）组织取材、固定：第1天上午或中午
（2）组织修块、固定：第1天下午或晚上
（3）组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片：第2天全天
脱水、透明8:00-12:30 4.5h
浸蜡12:30－14:30 2h
包埋14:30-15:30 1h
修块16:00-17:00 1h
切片17:30-21:30 4h
烘片21:30至第3日早晨
（4）切片染色、封片：第3日
染色1个流程需要50min，染色完后即封片。
整个过程需要3天的时间。