Reviews and Monographs 综述与专论
生物化学与生物物理进展
Progress in Biochemistry and Biophysics 2013, 40(9):787~795
www.pibb.ac.cn
广谱抗病毒抑制剂研究进展*
王程玉王晓佳＊＊
(中国农业大学动物医学院，农业部人畜共患病重点实验室，北京100193)
摘要研制广谱抗病毒制剂是病毒学前瞻性方向，也是国际医药界倍受瞩目的热点之一．近年来，广谱抗病毒制剂相关研究
获得长足进展，突破了抗病毒制剂单一宿主的瓶颈与限制，以及广谱类制剂活性相对较弱的原有思维，部分成果已面向临床应用．本文基于病毒侵染以及宿主细胞防御两个层面，全面综述新型广谱抗病毒抑制剂的研究进展与应用潜力，讨论现存的挑战，并展望了未来研究趋势．关键词
广谱，抗病毒制剂，病毒入侵，感染，细胞防御
DOI :10.3724/SP.J.1206.2012.00611
学科分类号Q6
病毒按其外壳是否包裹着富含脂质的膜可简单地分为无囊膜病毒与有囊膜病毒两类．无囊膜病毒主要是通过吞饮作用在网格蛋白介导下进入被感染细胞；有囊膜病毒的入侵主要是病毒囊膜与宿主细胞膜的融合过程．根据病毒入侵过程中囊膜表面糖蛋白的构象变化，囊膜病毒可被分为3类：其中正黏病毒科、反转录病毒科、纤丝病毒科、副黏病毒科与冠状病毒科被归为Ⅰ类囊膜病毒，其代表病毒为流感病毒、人免疫缺陷病毒、埃博拉病毒与严重急性呼吸综合征病毒[1]；黄病毒科与披膜病毒科被归为Ⅱ类囊膜病毒[2]，其代表病毒为登革热病毒与日本脑炎病毒；疱疹病毒科、弹状病毒科与杆状病毒科被归为Ⅲ类囊膜病毒[3]，其代表病毒为单纯疱疹病毒与水泡性口炎病毒．目前广谱抗病毒制剂研究基于两方面设计，一是从病毒侵染层面，二是从宿主细胞防御层面，相关研究已取得很多突破性成果，包括通过高通量方法筛选活性分子、表达重组蛋白，以及发现具有广谱抗病毒效果的生物提取物等，其中部分制剂或药品业已面向临床试验或商品化．本文综述了这些广谱抗病毒制剂的设计与研究进展．
病毒与宿主细胞吸附、融合或胞吞、脱壳、复制、病毒粒子的装配与出芽等一个或者几个过程而设计，从而终止病毒的生命周期，例如抑制病毒融合糖蛋白的某一变构过程，可使病毒囊膜无法与宿主细胞膜融合．此研究策略的优势在于抗病毒制剂的作用位点明确、且不影响细胞结构，因此不易产生细胞毒性．不足之处在于，针对病毒特殊结构而设计的抗病毒制剂，通常广谱性不明显，易产生耐药性，甚至抗病毒治疗本身可选择性促进突变病毒的生长．相关综述详见本节下文，以及图1与表1. 1．1病毒与受体吸附
病毒与宿主细胞的膜融合是囊膜病毒入侵宿主细胞的第一步，此过程涉及到病毒囊膜表面蛋白与宿主细胞表面受体蛋白(或唾液酸) 之间的相互作用与构象变化．流感病毒通过与含唾液酸的结合受体(血凝素与神经氨酸酶) 相互作用而入侵细胞，唾液酸酶则可通过水解唾液酸，使病毒无法结合到细胞膜表面，从而对抗病毒入侵．抗流感药物扎那米韦
*国家自然基金(31101819)及新世纪人才基金(NCET-11-0486)资助项目.
**通讯联系人.
Tel:010-62734377, E-mail:[email protected]收稿日期：2012-12-16，接受日期：2013-01-23
1基于病毒侵染层面设计的抗病毒制剂
从病毒侵染层面研究抗病毒制剂，即基于抑制
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HIV
生物化学与生物物理进展Prog. Biochem. Biophys. 2013; 40(9)
IFV DENV VSV
LJ001gp120
PVP-coated
nano-silver
抑制gp120与CD4结合
HP-OVA
O H
O H
O H
O H
CD4
唾液酸
水解唾液酸DAS181
DC-SIGN (CD209)
HA CR6261抑制血凝素与唾液酸结合
CBAs 阻断病毒与受体结合
LJ001干扰囊膜结构
H O
H O
Fig. 1Broad -spectrum antiviral agents designed based on virus entry mechanism
图1
口炎病毒(vesicularstomatitis virus).
基于病毒入侵机制设计的广谱抗病毒抑制剂
HIV ：人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus ) ；IFV ：流感病毒(influenzavirus) ；DENV ：登革热病毒(Denguevirus) ；VSV ：水泡性
和奥司他韦，以及新近报道的帕拉米韦均属于神经氨酸酶阻断剂范畴，前两者在临床应用过程中效果显著，但是近年来，随着流感病毒的不断变异与耐药毒株的产生，这些药物疗效下降甚至失效等问题日益严峻，研制新型抗病毒制剂迫在眉睫[4]．重组唾液酸酶(编号为DAS181，商品名为流感酶) 的出现象征着广谱意义上的抗流感蛋白类药物的研制取得重大进展，其可有效地保护小鼠免受现阶段已呈现耐药性的各种流感与副流感病毒侵染，亦可防控继发肺炎球菌感染的威胁[5]．最近，有学者基于血凝素高度保守的抗原表位，研发了一种单克隆抗体CR6261，其可阻断病毒与靶细胞膜融合时的构象重排，从而抑制高致病性流感病毒的侵染，无论是攻毒前或者之后1天内注射CR6261(30mg/kg体重剂量) ，均可使感染小鼠获得有效保护，对于其他10种血清型流感病毒也有显著抑制作用，表明其具备开发为广谱抗流感制剂的潜力[6]．
近年来，基于人免疫缺陷病毒与受体相互作用机理而设计的抗病毒制剂也取得很大进展，免疫缺陷病毒只有一种囊膜糖蛋白gp160，可被宿主细胞蛋白酶作用后裂解成以共价键相结合的糖蛋白gp120与gp41，其中gp120负责与细胞受体CD4
及其辅助受体(CCR5、CXCR4) 结合．银离子本身即具有抗病毒与杀菌能力，聚乙烯吡咯烷酮包被的纳米银颗粒(PVP-coatednano-silver) 可通过竞争性地与gp120结合，使之失去与CD4受体结合的能力，致使病毒无法入侵细胞，从而可在无细胞环境下起到抗病毒效果，因此具备研制成外用软膏剂型的潜质[7]．与此相似，食物蛋白中普遍存在的卵清蛋白具有一定的微生物杀伤作用，而经过3-羟基邻苯二甲酸酐修饰的卵清蛋白(HP-OVA)则具有广谱抗病毒作用，不仅可阻止gp120蛋白与受体互作，还可影响gp41蛋白核心六螺旋束结构(1.2节有详述) 的形成，以阻断病毒-宿主细胞膜融合发生[8]，卵清蛋白来源广泛且造价低廉，因此被开发为预防性抗病毒制剂有明显的市场竞争优势．此外，DC-SIGN(CD209)是登革热病毒入侵树突状细胞表面的主要受体与靶位，植物凝集素提取物CBAs 则被报道可阻断病毒粒子与DC-SIGN 结合，从而抑制病毒入侵[9]．当然，由于存在其他入侵途径与受体(如CD206与热休克蛋白70) ，这种抑制是不完全的．1．2
病毒膜融合
人免疫缺陷病毒囊膜表面糖蛋白gp120与细胞
H O
H O
2013; 40(9)王程玉, 等：广谱抗病毒抑制剂研究进展
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受体结合后，可促使跨膜亚单位gp41发生变构，其两段七肽重复区域(heptadrepeat ，HR) 相互作用
形成六螺旋束结构，以拉近病毒囊膜与细胞膜距离并最终引发膜融合发生．值得关注的是，Ⅰ类囊膜病毒膜融合过程中融合糖蛋白HRs 区域均可互作形成相似的六螺旋束结构，可见此融合核心结构是设计广谱抗病毒制剂的理想靶位．P20是通过双酵母杂交技术从人类骨髓细胞DNA 信息库中筛选出的一类gp41蛋白结合分子，可直接影响HR 及六聚螺旋束的功能以阻断病毒与宿主细胞膜融合．P20与已上市的HR 同源物恩夫韦地(T-20)并没有交叉耐药性，且对其他囊膜病毒无效．更值得关注的是，含片段WGRLEGRRT 的4种突变体相对于其他7种P20突变体分子，显示出更强的抗病毒活性，且对其他病毒存在潜在的膜融合抑制活性，这为设计广谱抗病毒药物提供了参考靶位[10]．本课题组根据Ⅰ类与Ⅲ类囊膜病毒糖蛋白HR 区域及六螺旋束结构的固有特征，将各个氨基酸位点进行功能性突变与重组整合———即根据a 位点高度保守的特点(为亮氨酸L 或异亮氨酸I) ，不予改动，非重要螺旋形成单位(b，c ，f 及g 位氨基酸，亲水位点) 交叉置换为赖氨酸(K)或谷氨酸(E)，以促进螺旋结构形成盐桥的趋势，此突变不影响蛋白质的电荷平衡，重点考虑不同病毒HR 区域在d ，e 位(蛋白质结合位点) 氨基酸的性质，如疏水性及极性等，进行突变与重组设计，最终研制出对三科病毒膜融合均有高效阻遏作用的多肽[11]．鉴于多肽类制剂的半衰期较短，课题组对该多肽进行修饰，结果表明胆固醇修饰物以1.6mg/kg体重肌注4次即可获得75%以上的保护率(待发表) ，相对未修饰多肽需每日注射(一般为9～12次) ，该项研究无疑可为多肽类抗病毒制剂的临床应用提供重要的现实可行性．此外，胆固醇修饰物可穿过动物的血脑屏障，这为保护中枢神经系统免受病毒侵染提供新的策略．病毒复制
流感病毒囊膜与细胞内质网膜融合后，释放出单股负链RNA ，其编码RNA 多聚酶、核蛋白、膜蛋白与非结构蛋白等构件(后者在内质网或高尔基1．3
体上组装M 蛋白和包膜) ，同时在细胞核内，病毒的遗传物质不断复制并与RNA 多聚酶、核蛋白等组建病毒核心，这就是病毒的复制过程．1993年，在俄罗斯药物化学研究中心研制出一种新型抗流感病毒药物阿比多尔(arbidol)，这是一种白色粉末状吲哚衍生物，其抗病毒机理与大多数抗病毒药物不
同，不仅可干扰病毒与细胞膜融合，还可通过激活2, 5-寡腺苷酸合成酶(其催化合成的寡腺苷酸可激活细胞中的核糖核酸酶L ，降解病毒的mRNA 及细胞的RNA ，以抑制蛋白质的合成) ，从而阻断病毒早期复制．阿比多尔还拥有独特的药理作用与良好的安全性能，临床上对甲乙型流感、呼吸道综合症，以及其他呼吸道病毒均有一定抑制效果，被认为是值得进一步开发的广谱抗病毒制剂[12]．二氢乳酸脱氢酶(DHODH)可将二氢乳清酸脱氢生成乳清乳酸，这是嘧啶生物合成的关键步骤，而最终产物尿嘧啶核苷酸是DNA 与RNA 合成的必需原料．化合物A3可通过与DHODH 结合以中断嘧啶的生物合成，从而阻止多种病毒的复制，包括负链RNA 病毒(如甲乙型流感病毒) 、正链RNA 病毒(丙型肝炎病毒与登革热病毒) 与DNA 病毒(牛痘病毒与腺病毒) 等[13]．有趣的是，A3化合物的结构不同于已知的DHODH 抑制剂来氟米特(leflunomide)或布喹那(brequinar)，可见其作用模式也有所不同，相关机理尚待进一步阐明．与此相似，新近发现的JMN3-003分子可通过阻止病毒的RNA 多聚酶活性，使病毒无法复制，但不会影响未感染细胞中信使RNA 与蛋白质的合成，研究同时证明，JMN3-003既不会迅速引发病毒的耐药性突变，也没有明显的副作用[14]．
基因沉默系统是生物体抵抗病原体侵染的防卫体系，而在长期的协同进化过程中，一些病原体编码蛋白可抵消基因沉默作用．基因转录与翻译水平小干扰RNA(siRNA)介导的抑制或沉默现象，在抗病毒研究中具有重要意义，为临床病毒感染性疾病的防治提供了新的对策．日本脑炎病毒基因的高变异性，使作用于单一机制的抗病毒药物往往难以起效．科研人员近期根据该病毒4个主要血清型的7个主要基因序列，设计出9种siRNA ，进而采用新型RNA 多聚酶将这9种siRNA 高度保守区重新组合，最终设计出新型siRNA 类似物，其同时表达以上9种siRNA ，可有效阻止不同血清型脑炎病毒的复制[15]，当然这种设计也只限于“相对广谱”的概念范畴．1．4病毒出芽
流感病毒在感染细胞中成功复制后，新合成的核糖核蛋白复合体(即病毒核糖核酸与RNA 多聚酶以及核蛋白等组建的病毒核心) 可通过CRM1等一系列复杂的出核途径，进入细胞质内装配成病毒核衣壳，成熟的子代病毒继而被释放到细胞外，这就
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是病毒的出芽过程．病毒核衣壳蛋白表面有许多富含α螺旋结构的区域，抑制这些“热点区域”与其他核衣壳蛋白的结合，即可有效阻断病毒出芽．进一步研究表明，在不同病毒之间该热点区域的基因序列相似性并不很高，然而含有氨基酸序列“GDFNALSN ”的区域却是多种病毒的作用靶位，尤其包括一些无囊膜病毒(如腺病毒与呼肠病毒) ，同时此区域也是病毒蛋白质-细胞蛋白质互作的关键结合域[16]，相关研究为发现与设计广谱抗病毒制剂提供了新视角．
改变或者消除为病毒复制所需但是对细胞本身生长并不重要的蛋白质或分子，以影响病毒的生命周期，从而达到抗病毒效果．针对宿主细胞的抗病毒制剂，可以在真正意义上达到广谱抗病毒的目的，且可最小化耐药性产生的可能性．但问题在于，如何确定抗病毒制剂靶向的蛋白质或分子仅为病毒所需而不为细胞所必需，以及如何将抗病毒制剂的细胞毒性控制在机体能够承受的范围之内，这些论题的解析需要开展细胞信号途径方面的系统化研究．相关综述详见本节下文，以及图2与表1．
2基于宿主细胞防御层面设计的抗病毒制剂
从宿主细胞防御层面研究抗病毒制剂，即通过
TSG-101
干扰嘧啶
生物合成DHODH A3
阻断酪氨酸激酶-受体结合
AG879/A9
FGI-104
阻止TSG-101助病毒出芽
RKTs 激活
siRNA
PI3k/Akt等细胞途径抑制细胞凋亡诱导
阻断PI3k/Akt途径
Akt-Ⅳ
抑制病毒诱导
早期复制
RdRp
抑制RNA 聚合酶作用JMN3-003
DRACOs dsRNA
检测病毒dsRNA
ROS
NSC62914抗细胞氧化
Fig. 2Broad -spectrum antiviral agents designed based on cell defense mechanism
图2
基于宿主细胞防御机制设计的广谱抗病毒抑制剂
2．1
细胞膜
病毒囊膜本质上是出芽时所带离宿主的部分细
胞膜，尽管如此，病毒囊膜与细胞膜却有明显不同．研究表明，当细胞膜受到大于0.2μm 而小于10μm 的损伤后，几秒钟内就会被胞浆内膜修复，而病毒囊膜不具备这些修复功能(如新陈代谢) ．与抗菌肽作用机理相似，芳香甲基二烯罗丹宁衍生物(LJ001)的设计也是利用细胞膜与病毒囊膜的结构学差异，通过改变病毒囊膜双分子层结构，从而不
可逆地阻止病毒与细胞膜融合过程．基于此机理，不难解释LJ001为何无法阻止修复后受感染细胞与邻近细胞发生膜融合，以及为何LJ001对多种不同科的囊膜病毒效果显著，但是对非囊膜病毒无效的原因[17]．与LJ001破坏病毒囊膜以干扰病毒入侵的机理不同，下述化合物是名副其实地靶向于细胞膜———在对海洋生物抗病毒活性物质研究中，科学家们发现，角鲨体内没有任何反转录病毒的核酸序列，而此序列在其他鱼类中却大量存在，表明角鲨
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的病毒防御机制非常有效而独特．奇怪的是，角鲨基因组既无干扰素基因也无干扰素受体基因，说明
角鲨抵御病毒入侵与干扰素抗病毒途径无关．从角鲨与八目鳗组织中提取的角鲨胺(squalamin)被认为在抗病毒过程中起着重要作用．很多病毒都利用肌动蛋白细胞骨架入侵宿主细胞，细胞膜的向细胞质面有一些由于静电力作用(这为病毒复制所需) 而被锚定的蛋白质(即膜锚定蛋白) ，其突变或者缺失可能干扰病毒入侵、复制、装配与出芽等多个过程．在与带负电荷的磷脂双分子层融合后，携带正电荷的角鲨胺可干扰并促使膜锚定蛋白异位．此外，角鲨胺还可通过替换细胞膜内表面阳离子的抑制成分以激活离子通道并抑制钠质子交换，使细胞不再支持病毒复制，由此可见角鲨胺至少可在病毒入侵与复制两个阶段对抗病毒侵染．据报道，角鲨胺在肝脏中的半衰期为12～24h ，以每日10～15mg/kg体重的剂量腹腔注射，并持续6～9天使用，可保护85%以上受感染动物免受多种囊膜病毒感染[18]．2．2
细胞自噬与凋亡
细胞程序性死亡(包括细胞自噬与凋亡) 是宿主对抗病原体侵染的第一道防御线，对维持细胞内环境稳定也具有重要作用．然而病原体在长期进化过程中往往可以调控甚至成功逃避自噬与凋亡的抗感染作用，如疱疹病毒可通过其编码的蛋白抑制细胞程序性死亡的发生，从而逃避宿主自清除，而登革热与人类免疫缺陷症病毒则可利用细胞程序性死亡，以促进自身增殖．解析病毒如何调控细胞程序性死亡以利于自身的生长与复制，可为研制抗病毒制剂提供新对策．双链RNA 激活切冬酶寡聚体(DRACOs)的设计与研究被认为是2011年病毒学领域最重要的发明与科学成果之一，其选择性地激活含有特异双链RNA(dsRNA)的细胞发生凋亡，使受感染细胞迅速凋亡，促使宿主在与病原体感染的对抗中占据优势地位．由于正常细胞中并不含有dsRNA(这也是区别感染与未感染细胞的一项决定性依据) ，理论上讲，DRACOs 对未感染细胞并无毒性作用．DRACOs 可对抗15种病毒的侵染，在不同细胞中均可发挥强抗病毒活性，同时DRACOs 突破了病毒是否有囊膜的限制，这为研制广谱抗病毒制剂开拓了全新的研究方向[19]．当然，该项研究仅证明其对实验小鼠没有明显副作用，并未过多考虑可能引致的机体反应过度等潜在问题，相信进一步研究将提供全面阐释．
2．3细胞生长与信号途径
近期发现一些针对宿主细胞生长与信号途径而设计的抗病毒蛋白质或分子，其具备广谱学意义，值得关注的是，由于选择性压力并不直接作用于病毒本身，因此机体对这些蛋白质或分子的耐药性相对不易出现．基因组中有一类维持细胞基本生命活动所必须的基因，其表达物———管家蛋白是一些病毒试图发现并加以利用的靶位，病毒通过改变其表达水平与功能以利于自身入侵，这个过程被形容为“劫持”模式．被劫持分子TSG-101可辅助性排除细胞内衰老的蛋白质，病毒则利用TSG-101从细胞内部逆行迁移到外膜(在出芽阶段) ，FGI-104分子可通过阻断这一被劫持过程以有效抑制多种血源性病毒(如肝炎与免疫缺陷病毒) 以及生物威胁病毒(如埃博拉与牛痘病毒) 的复制，对呼吸道病毒(如流感病毒) 与性传播病毒(如疱疹病毒) 的相关研究正在进行中[20]．相似地，FGI-106也是可以防治病毒性出血热的小分子，据报道，即使机体感染埃博拉病毒1天后使用也有望治愈，同时FGI-106对于乙型肝炎病毒与人类免疫缺陷病毒等也有一定的抑制作用，其抗病毒机制目前尚不完全清楚[21]．酪氨酸激酶受体RTK 可自动磷酸化酪氨酸残基，并激活细胞内诸如ERK/MAPK与PI3K/Akt等途径，这些细胞信号传导途径不仅在细胞癌变中起到关键作用，在病毒复制过程中的作用也同样重要．作为RTK 的受体阻断剂，AG879与A9分子可抑制病毒蛋白出核、RNA 合成以及病毒释放，且对多种病毒均有效[22]．此外，包括水泡性口炎病毒在内的许多病毒均可激活PI3K/Akt内源信号途径，通过诱导细胞增殖分化以避免细胞发生凋亡，从而促其自身复制，苏氨酸激酶抑制剂Akt-Ⅳ则可阻断PI3K/Akt通路，使被感染细胞启动凋亡机制[23]，另有报道表明PI3K/Akt途径抑制剂可能干扰病毒早期复制，但作用机理尚不完全清楚．
抗氧化剂
需氧细胞在代谢过程中会产生一系列活性氧簇(reactiveoxygen species ，ROS) ，低浓度ROS 环境可以起到抗微生物及抗肿瘤效果，当然过量产生2．4
ROS 也会导致细胞损伤．抗氧化剂治疗方法在临床应用并不成功，因为氧化反应并不是病毒入侵的主要反应，此外，抗氧化剂药物的生物学可利用性较低，所针对的目标较少，而且安全性越高的药物药效越低．近期发现抗氧化剂NSC62914可清
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生物化学与生物物理进展Prog. Biochem. Biophys. 2013; 40(9)
除ROS ，并且激活抗氧化基因Nrf2，据报道，以2mg/kg体重剂量注射NSC62914，可有效对抗出血热类的病毒性传染病(如拉沙热与脑炎等) ，使80%以上的感染动物多存活5～6天，其作用机理尚待进一步研究[24]．
抑制剂的耐药性较少见．然而长期使用这些化学合成的蛋白酶抑制剂所产生的毒副作用和耐药性问题日益显现，寻找新型制剂并扩大其抗病毒谱则成为新的挑战．目前一些蛋白酶研究者仍在积极探索与研究，如基于蛋白酶介导的细胞凋亡途径筛选蛋白酶结合蛋白，以发现潜在的蛋白酶抑制子[27]，希望不久的将来会有所突破．3．2化学合成物
流感至今仍为流行最广的传染病，金刚烷胺和金刚烷乙胺是病毒M2离子通道阻断剂，也是美国最初用于流感临床治疗的抗病毒制剂．但是从2003年开始，一系列的耐药毒株产生，造成了金刚烷胺的普遍耐药性．已商品化的吡嗪衍生物———法匹拉韦(T-705)对几乎所有的RNA 病毒均有一定的抑制作用，同时不影响细胞DNA 或RNA 的合成，近期研究表明，T-705对各种流感病毒耐药突变株亦有良好的治疗效果[28]，遗憾的是，T-705的抗病毒机制仍不完全清楚，推测其直接靶向于病毒RNA 依赖的RNA 多聚酶，或可能优先并入病毒的RNA 以引起高突变．另一种已商品化的核苷类似物———利巴韦林(ribavirin，三氮唑核苷，又名病毒唑) ，可以治疗多种RNA 和DNA 病毒感染，其可采用多种机制抑制同一种病毒，如抑制GTP 形成、抑制病毒RNA 多聚酶以干扰病毒核酸复制、形成GTP 类似物RTP 以导致病毒蛋白翻译错误、调节Th2向Th1反应转变等[29]，T-705与利巴韦林的抗病毒机制研究仍在继续．临床应用方面，一般常将利巴韦林与干扰素联合使用以治疗多种病毒性传染病(如丙型肝炎病毒、腮腺炎病毒以及轮状病毒) ，其中聚乙二醇化干扰素与利巴韦林的联合治疗是全球公认的丙肝标准治疗方案，而对于这种治疗无应答或复发病例，则可考虑加入2011年被美国FDA 批准后的肝炎病毒蛋白酶抑制剂波西普韦(boceprevir)，据报道这三者联用效果显著，当然其安全性与有效性值得进一步关注．3．3生物提取物
有机体分泌的黏液可以阻滞比矩阵孔径还要小的病毒，这就是“黏膜吸附”现象，黏液中的某些成分还可通过多种途径水解与杀灭入侵的病原微生物，如某些鱼类(如鲶鱼、章鱼) 体表分泌大量黏液，发挥重要的屏障功能．覆盖于肠黏膜上皮细胞
—一种多孔的生物聚合物基质，的黏液素聚合物——
是先天免疫系统对抗病原体入侵的第一道关卡．科学家们近期发现，黏液提取物(如胃黏液中的黏蛋
3
3．1
已商品化抗病毒制剂的新发展
重组蛋白
2003年，在严重急性呼吸综合征病毒大爆发
时并没有高效的疫苗或者专一性抗病毒制剂，高免疫血清与干扰素曾被用来治疗，其中干扰素表现出
良好的临床效果，与皮质激素类药物共用可在更短时间内发挥功效(时间缩短50%)．干扰素可影响病毒复制周期的各个阶段，还可促进先天免疫反应并激活免疫细胞，因此成为理想的广谱抗病毒候选药物，但是普遍存在的耐药性等问题也不容忽视．新型四氢咔唑GSK983既可阻止非病毒感染因素引起的细胞癌变，也可以阻断多种不相关病毒的复制，包括腺病毒-5与人类多乳头瘤病毒等，据报道GSK983就是通过介导某个干扰素激活基因亚单位从而发挥抗病毒功效的[25]．近年来，更多研究聚焦于干扰素介导的信号途径及其抗病毒效应机理，如细胞固有的“2-5A/Rnase L 核糖核酸酶”经典途径———病毒感染细胞之后产生的双链dsRNA 会激活干扰素，干扰素随之产生2-5A 以激活Rnase L ，从而终止病毒复制[26]．其实2-5A 本身不能穿膜，而且在体内会很快降解并引起细胞凋亡，因此不具备成为抗病毒药物的潜质．目前科学家们正尝试通过高通量筛选，以期在性质稳定的候选者中发现具有相似性质的蛋白质或化合物．此外，鉴于干扰素作用起始阶段最易发生病毒耐药性突变，如果某种蛋白质能跳过干扰素激活过程而直接促使2-5A 激活Rnase L ，即既可达到广谱抗病毒作用，又不易产生耐药性，相信这是一个有前景的研究思路．
某些Ⅰ类囊膜病毒的核衣壳蛋白与囊膜表面糖蛋白最初以蛋白质前体形式存在，其被蛋白酶裂解后才可形成有感染力的病毒粒子．人免疫缺陷病毒天冬氨酸蛋白酶与冠状病毒主蛋白酶(3C蛋白酶) 是病毒剪切多聚蛋白过程中最重要的蛋白酶，也是广谱抗病毒制剂研究的重要参考靶位．蛋白酶抑制剂研究在经历十多年的发展后，已获得令人鼓舞的结果，目前科学家们还建议，在经典的“鸡尾酒”疗法中要多考虑选用蛋白酶抑制剂以达到更好的抗艾滋病效果，因为相对于逆转录酶抑制剂，蛋白酶
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白) 可以对抗多种病毒感染[30]，在此基础上有望研
制成抗病毒漱口剂或伤口处理添加剂，以保护机体体腔外表面免受病毒侵染，当然其作用机理尚待进一步明确．近年来，传统中草药在广谱抗病毒研究领域日益显示出重要性，如板蓝根与黄芪对抗呼吸道病毒感染、黄连与连翘对抗消化道与呼吸道病毒感染的效果都很显著，且不易产生耐药性．如今板
蓝根已开始按照现代药学理论与方法进行临床试验，一旦作用机理全部搞清楚，将为板蓝根走出国门扫除最后一丝障碍，这个新进展带给国人很多希望与期冀．其实广谱抗病毒制剂的研究思路仍不限于此，相信我国的原创性研究成果可为推进广谱抗病毒制剂的研制进程填上重要的一笔．
Table 1Summary of broad -spectrum antiviral agents
表1
中文名
病毒层面
新型单抗邻苯二甲酸酐修饰卵清蛋白碳水化合物结合物罗丹宁衍生
物
英文名CR6261HP-OVA
广谱抗病毒抑制剂汇总
来源
应用对象流感病毒/Ⅰ类反转录病毒/Ⅰ类
试验进展体内试验细胞试验
参考文献[6][8]
机理/靶位
作用于血凝素高通量筛选阻断糖蛋白结卵清蛋白修
合受体饰物
CBAs LJ001
阻断病毒结合植物凝集素提受体取物病毒囊膜结构高通量筛选
登革热病毒/Ⅱ类流感病毒等/广谱1) 反转录病毒等/Ⅰ类
细胞试验细胞试验细胞试验
[9][17][7]
聚乙烯吡咯PVP-coated nano-silver 抑制糖蛋白结纳米银修饰物合受体烷酮包被纳
米银P20蛋白新肽N2RNA 多聚酶抑制剂
细胞层面二氢乳酸脱
氢酶交联物
细胞表面唾液酸水解酶络氨酸激酶受体阻断剂双链RNA 激活切冬酶寡聚体角鲨胺FGI-104分子FGI-106分子小干扰RNA NSC62914苏氨酸激酶抑制剂
其他
法匹拉韦阿比多尔利巴韦林
P20CAU JMN-003Compound A3DAS181(Fludase誖) AG879&A9DRACOs
六螺旋束形成酵母双杂交六螺旋束形成病毒RNA 多
聚酶
突变重组高通量筛选
反转录病毒/Ⅰ类新城疫病毒/Ⅰ类正副黏病毒/Ⅰ类流感病毒等/广谱1) 流感病毒等/Ⅰ类流感病毒/Ⅰ类
广谱1)
细胞试验体内试验细胞试验细胞试验临床试验细胞试验细胞试验
[10][11][14][13][5][22][19]
嘧啶生物合成高通量筛选水解细胞表面重组唾液酸酶
唾液酸络氨酸激酶受高通量筛选
体诱导感染细胞双链RNA-蛋
凋亡白重组复合物宿主细胞膜表生物提取物面电位细胞信号途径高通量筛选细胞信号途径高通量筛选RNA 多聚酶抗细胞氧化PI3k/Akt途径机理不明
生物合成化学合成化学合成
Squalamine FGI-104FGI-106siRNA NSC62914Akt-ⅣFavipiravir (T-705)
Arbidol Ribavirin
广谱1)
血源病毒等/Ⅰ类Ⅱ类出血热病毒/Ⅰ类Ⅱ类脑炎病毒/Ⅱ类出血热病毒等/Ⅱ类弹状病毒等/Ⅰ类Ⅲ类
体内试验体内试验体内试验细胞试验体内试验细胞试验商品化商品化商品化
[18][20][21][15][24][23][28][12][29]
吡嗪化学合成出血热病毒等/Ⅰ类Ⅱ类
流感病毒等/Ⅰ类
广谱1)
2, 5-寡腺苷酸吲哚衍生物
合成酶次黄嘌呤单磷化学酶促合成
酸腺苷
1)
对超过10种不同科类病毒均有效.
··794
生物化学与生物物理进展Prog. Biochem. Biophys. 2013; 40(9)
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目前针对病毒感染，尤其当病原体属于突发或未知时，没有大量类似于抗生素一样广谱、高效、安全的药物治疗手段，加之病毒生化武器日益成为全人类的巨大潜在威胁，这些事实都强调新型广谱抗病毒制剂研制的必要性与紧迫性．疫苗是一种公认可行的治疗手段，曾为人类健康做出积极贡献，但是也面临一些棘手问题与缺憾，比如窄谱———疫苗只针对特定血清型的病毒有效，同时由于无法预测病毒的变异，以至于只有在传染病发作之后才能开展疫苗的研制，此外，还有一些病毒性传染病(如艾滋病) 的疫苗研制还属于空窗期．广谱抗病毒制剂的研制，可以与疫苗的使用互为补充，相得益彰．事实上广谱抗病毒制剂研究已获得令人瞩目的进展，相信也终将为人类在与各类病毒性传染病的对抗中占据优势地位做出难以替代的贡献．当然，以病毒靶为基础设计的抗病毒制剂易产生耐药性，而基于细胞靶所设计抗病毒制剂的作用靶位很难确定，需要进一步的改良设计与系统化考虑．
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Advances in Development of Broad -spectrum Antiviral Agents *
WANG Cheng-Yu, WANG Xiao-Jia **
(College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China)
Abstract The development of broad-spectrum antiviral agents has recently become a major thrust area in the
field of virology, and received enormous attention in the pharmaceutical industry worldwide. Much progress has been made to substantially extend the limitations of current antiviral therapy drugs, which are mostly pathogen-specific. Breakthroughs were made in establishing fundamental understanding of the underlying biochemical mechanisms. Part of the research results have been implemented for practical applications. The present review addresses the state-of-the-art knowledge, prospective applications, and challenges for the development of broad-spectrum antiviral agents. Detailed models of agent targets to virus entry and infection, and host cell defense are given. Finally, future research needs and opportunities are discussed. Key words broad-spectrum, antiviral agent, virus entry, infection, cell defense DOI :10.3724/SP.J.1206.2012.00611
*This work was supported by grants from The National Natural Science Foundation of China(31101819)and The Program for New Century Excellent Talents in University(NCET-11-0486).**Correspondingauthor.
Tel:86-10-62734377, E-mail:[email protected]:December 16, 2012
Accepted:January 23, 2013
Reviews and Monographs 综述与专论
生物化学与生物物理进展
Progress in Biochemistry and Biophysics 2013, 40(9):787~795
www.pibb.ac.cn
广谱抗病毒抑制剂研究进展*
王程玉王晓佳＊＊
(中国农业大学动物医学院，农业部人畜共患病重点实验室，北京100193)
摘要研制广谱抗病毒制剂是病毒学前瞻性方向，也是国际医药界倍受瞩目的热点之一．近年来，广谱抗病毒制剂相关研究
获得长足进展，突破了抗病毒制剂单一宿主的瓶颈与限制，以及广谱类制剂活性相对较弱的原有思维，部分成果已面向临床应用．本文基于病毒侵染以及宿主细胞防御两个层面，全面综述新型广谱抗病毒抑制剂的研究进展与应用潜力，讨论现存的挑战，并展望了未来研究趋势．关键词
广谱，抗病毒制剂，病毒入侵，感染，细胞防御
DOI :10.3724/SP.J.1206.2012.00611
学科分类号Q6
病毒按其外壳是否包裹着富含脂质的膜可简单地分为无囊膜病毒与有囊膜病毒两类．无囊膜病毒主要是通过吞饮作用在网格蛋白介导下进入被感染细胞；有囊膜病毒的入侵主要是病毒囊膜与宿主细胞膜的融合过程．根据病毒入侵过程中囊膜表面糖蛋白的构象变化，囊膜病毒可被分为3类：其中正黏病毒科、反转录病毒科、纤丝病毒科、副黏病毒科与冠状病毒科被归为Ⅰ类囊膜病毒，其代表病毒为流感病毒、人免疫缺陷病毒、埃博拉病毒与严重急性呼吸综合征病毒[1]；黄病毒科与披膜病毒科被归为Ⅱ类囊膜病毒[2]，其代表病毒为登革热病毒与日本脑炎病毒；疱疹病毒科、弹状病毒科与杆状病毒科被归为Ⅲ类囊膜病毒[3]，其代表病毒为单纯疱疹病毒与水泡性口炎病毒．目前广谱抗病毒制剂研究基于两方面设计，一是从病毒侵染层面，二是从宿主细胞防御层面，相关研究已取得很多突破性成果，包括通过高通量方法筛选活性分子、表达重组蛋白，以及发现具有广谱抗病毒效果的生物提取物等，其中部分制剂或药品业已面向临床试验或商品化．本文综述了这些广谱抗病毒制剂的设计与研究进展．
病毒与宿主细胞吸附、融合或胞吞、脱壳、复制、病毒粒子的装配与出芽等一个或者几个过程而设计，从而终止病毒的生命周期，例如抑制病毒融合糖蛋白的某一变构过程，可使病毒囊膜无法与宿主细胞膜融合．此研究策略的优势在于抗病毒制剂的作用位点明确、且不影响细胞结构，因此不易产生细胞毒性．不足之处在于，针对病毒特殊结构而设计的抗病毒制剂，通常广谱性不明显，易产生耐药性，甚至抗病毒治疗本身可选择性促进突变病毒的生长．相关综述详见本节下文，以及图1与表1. 1．1病毒与受体吸附
病毒与宿主细胞的膜融合是囊膜病毒入侵宿主细胞的第一步，此过程涉及到病毒囊膜表面蛋白与宿主细胞表面受体蛋白(或唾液酸) 之间的相互作用与构象变化．流感病毒通过与含唾液酸的结合受体(血凝素与神经氨酸酶) 相互作用而入侵细胞，唾液酸酶则可通过水解唾液酸，使病毒无法结合到细胞膜表面，从而对抗病毒入侵．抗流感药物扎那米韦
*国家自然基金(31101819)及新世纪人才基金(NCET-11-0486)资助项目.
**通讯联系人.
Tel:010-62734377, E-mail:[email protected]收稿日期：2012-12-16，接受日期：2013-01-23
1基于病毒侵染层面设计的抗病毒制剂
从病毒侵染层面研究抗病毒制剂，即基于抑制
··788
HIV
生物化学与生物物理进展Prog. Biochem. Biophys. 2013; 40(9)
IFV DENV VSV
LJ001gp120
PVP-coated
nano-silver
抑制gp120与CD4结合
HP-OVA
O H
O H
O H
O H
CD4
唾液酸
水解唾液酸DAS181
DC-SIGN (CD209)
HA CR6261抑制血凝素与唾液酸结合
CBAs 阻断病毒与受体结合
LJ001干扰囊膜结构
H O
H O
Fig. 1Broad -spectrum antiviral agents designed based on virus entry mechanism
图1
口炎病毒(vesicularstomatitis virus).
基于病毒入侵机制设计的广谱抗病毒抑制剂
HIV ：人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus ) ；IFV ：流感病毒(influenzavirus) ；DENV ：登革热病毒(Denguevirus) ；VSV ：水泡性
和奥司他韦，以及新近报道的帕拉米韦均属于神经氨酸酶阻断剂范畴，前两者在临床应用过程中效果显著，但是近年来，随着流感病毒的不断变异与耐药毒株的产生，这些药物疗效下降甚至失效等问题日益严峻，研制新型抗病毒制剂迫在眉睫[4]．重组唾液酸酶(编号为DAS181，商品名为流感酶) 的出现象征着广谱意义上的抗流感蛋白类药物的研制取得重大进展，其可有效地保护小鼠免受现阶段已呈现耐药性的各种流感与副流感病毒侵染，亦可防控继发肺炎球菌感染的威胁[5]．最近，有学者基于血凝素高度保守的抗原表位，研发了一种单克隆抗体CR6261，其可阻断病毒与靶细胞膜融合时的构象重排，从而抑制高致病性流感病毒的侵染，无论是攻毒前或者之后1天内注射CR6261(30mg/kg体重剂量) ，均可使感染小鼠获得有效保护，对于其他10种血清型流感病毒也有显著抑制作用，表明其具备开发为广谱抗流感制剂的潜力[6]．
近年来，基于人免疫缺陷病毒与受体相互作用机理而设计的抗病毒制剂也取得很大进展，免疫缺陷病毒只有一种囊膜糖蛋白gp160，可被宿主细胞蛋白酶作用后裂解成以共价键相结合的糖蛋白gp120与gp41，其中gp120负责与细胞受体CD4
及其辅助受体(CCR5、CXCR4) 结合．银离子本身即具有抗病毒与杀菌能力，聚乙烯吡咯烷酮包被的纳米银颗粒(PVP-coatednano-silver) 可通过竞争性地与gp120结合，使之失去与CD4受体结合的能力，致使病毒无法入侵细胞，从而可在无细胞环境下起到抗病毒效果，因此具备研制成外用软膏剂型的潜质[7]．与此相似，食物蛋白中普遍存在的卵清蛋白具有一定的微生物杀伤作用，而经过3-羟基邻苯二甲酸酐修饰的卵清蛋白(HP-OVA)则具有广谱抗病毒作用，不仅可阻止gp120蛋白与受体互作，还可影响gp41蛋白核心六螺旋束结构(1.2节有详述) 的形成，以阻断病毒-宿主细胞膜融合发生[8]，卵清蛋白来源广泛且造价低廉，因此被开发为预防性抗病毒制剂有明显的市场竞争优势．此外，DC-SIGN(CD209)是登革热病毒入侵树突状细胞表面的主要受体与靶位，植物凝集素提取物CBAs 则被报道可阻断病毒粒子与DC-SIGN 结合，从而抑制病毒入侵[9]．当然，由于存在其他入侵途径与受体(如CD206与热休克蛋白70) ，这种抑制是不完全的．1．2
病毒膜融合
人免疫缺陷病毒囊膜表面糖蛋白gp120与细胞
H O
H O
2013; 40(9)王程玉, 等：广谱抗病毒抑制剂研究进展
·789·
受体结合后，可促使跨膜亚单位gp41发生变构，其两段七肽重复区域(heptadrepeat ，HR) 相互作用
形成六螺旋束结构，以拉近病毒囊膜与细胞膜距离并最终引发膜融合发生．值得关注的是，Ⅰ类囊膜病毒膜融合过程中融合糖蛋白HRs 区域均可互作形成相似的六螺旋束结构，可见此融合核心结构是设计广谱抗病毒制剂的理想靶位．P20是通过双酵母杂交技术从人类骨髓细胞DNA 信息库中筛选出的一类gp41蛋白结合分子，可直接影响HR 及六聚螺旋束的功能以阻断病毒与宿主细胞膜融合．P20与已上市的HR 同源物恩夫韦地(T-20)并没有交叉耐药性，且对其他囊膜病毒无效．更值得关注的是，含片段WGRLEGRRT 的4种突变体相对于其他7种P20突变体分子，显示出更强的抗病毒活性，且对其他病毒存在潜在的膜融合抑制活性，这为设计广谱抗病毒药物提供了参考靶位[10]．本课题组根据Ⅰ类与Ⅲ类囊膜病毒糖蛋白HR 区域及六螺旋束结构的固有特征，将各个氨基酸位点进行功能性突变与重组整合———即根据a 位点高度保守的特点(为亮氨酸L 或异亮氨酸I) ，不予改动，非重要螺旋形成单位(b，c ，f 及g 位氨基酸，亲水位点) 交叉置换为赖氨酸(K)或谷氨酸(E)，以促进螺旋结构形成盐桥的趋势，此突变不影响蛋白质的电荷平衡，重点考虑不同病毒HR 区域在d ，e 位(蛋白质结合位点) 氨基酸的性质，如疏水性及极性等，进行突变与重组设计，最终研制出对三科病毒膜融合均有高效阻遏作用的多肽[11]．鉴于多肽类制剂的半衰期较短，课题组对该多肽进行修饰，结果表明胆固醇修饰物以1.6mg/kg体重肌注4次即可获得75%以上的保护率(待发表) ，相对未修饰多肽需每日注射(一般为9～12次) ，该项研究无疑可为多肽类抗病毒制剂的临床应用提供重要的现实可行性．此外，胆固醇修饰物可穿过动物的血脑屏障，这为保护中枢神经系统免受病毒侵染提供新的策略．病毒复制
流感病毒囊膜与细胞内质网膜融合后，释放出单股负链RNA ，其编码RNA 多聚酶、核蛋白、膜蛋白与非结构蛋白等构件(后者在内质网或高尔基1．3
体上组装M 蛋白和包膜) ，同时在细胞核内，病毒的遗传物质不断复制并与RNA 多聚酶、核蛋白等组建病毒核心，这就是病毒的复制过程．1993年，在俄罗斯药物化学研究中心研制出一种新型抗流感病毒药物阿比多尔(arbidol)，这是一种白色粉末状吲哚衍生物，其抗病毒机理与大多数抗病毒药物不
同，不仅可干扰病毒与细胞膜融合，还可通过激活2, 5-寡腺苷酸合成酶(其催化合成的寡腺苷酸可激活细胞中的核糖核酸酶L ，降解病毒的mRNA 及细胞的RNA ，以抑制蛋白质的合成) ，从而阻断病毒早期复制．阿比多尔还拥有独特的药理作用与良好的安全性能，临床上对甲乙型流感、呼吸道综合症，以及其他呼吸道病毒均有一定抑制效果，被认为是值得进一步开发的广谱抗病毒制剂[12]．二氢乳酸脱氢酶(DHODH)可将二氢乳清酸脱氢生成乳清乳酸，这是嘧啶生物合成的关键步骤，而最终产物尿嘧啶核苷酸是DNA 与RNA 合成的必需原料．化合物A3可通过与DHODH 结合以中断嘧啶的生物合成，从而阻止多种病毒的复制，包括负链RNA 病毒(如甲乙型流感病毒) 、正链RNA 病毒(丙型肝炎病毒与登革热病毒) 与DNA 病毒(牛痘病毒与腺病毒) 等[13]．有趣的是，A3化合物的结构不同于已知的DHODH 抑制剂来氟米特(leflunomide)或布喹那(brequinar)，可见其作用模式也有所不同，相关机理尚待进一步阐明．与此相似，新近发现的JMN3-003分子可通过阻止病毒的RNA 多聚酶活性，使病毒无法复制，但不会影响未感染细胞中信使RNA 与蛋白质的合成，研究同时证明，JMN3-003既不会迅速引发病毒的耐药性突变，也没有明显的副作用[14]．
基因沉默系统是生物体抵抗病原体侵染的防卫体系，而在长期的协同进化过程中，一些病原体编码蛋白可抵消基因沉默作用．基因转录与翻译水平小干扰RNA(siRNA)介导的抑制或沉默现象，在抗病毒研究中具有重要意义，为临床病毒感染性疾病的防治提供了新的对策．日本脑炎病毒基因的高变异性，使作用于单一机制的抗病毒药物往往难以起效．科研人员近期根据该病毒4个主要血清型的7个主要基因序列，设计出9种siRNA ，进而采用新型RNA 多聚酶将这9种siRNA 高度保守区重新组合，最终设计出新型siRNA 类似物，其同时表达以上9种siRNA ，可有效阻止不同血清型脑炎病毒的复制[15]，当然这种设计也只限于“相对广谱”的概念范畴．1．4病毒出芽
流感病毒在感染细胞中成功复制后，新合成的核糖核蛋白复合体(即病毒核糖核酸与RNA 多聚酶以及核蛋白等组建的病毒核心) 可通过CRM1等一系列复杂的出核途径，进入细胞质内装配成病毒核衣壳，成熟的子代病毒继而被释放到细胞外，这就
·790·
生物化学与生物物理进展Prog. Biochem. Biophys. 2013; 40(9)
是病毒的出芽过程．病毒核衣壳蛋白表面有许多富含α螺旋结构的区域，抑制这些“热点区域”与其他核衣壳蛋白的结合，即可有效阻断病毒出芽．进一步研究表明，在不同病毒之间该热点区域的基因序列相似性并不很高，然而含有氨基酸序列“GDFNALSN ”的区域却是多种病毒的作用靶位，尤其包括一些无囊膜病毒(如腺病毒与呼肠病毒) ，同时此区域也是病毒蛋白质-细胞蛋白质互作的关键结合域[16]，相关研究为发现与设计广谱抗病毒制剂提供了新视角．
改变或者消除为病毒复制所需但是对细胞本身生长并不重要的蛋白质或分子，以影响病毒的生命周期，从而达到抗病毒效果．针对宿主细胞的抗病毒制剂，可以在真正意义上达到广谱抗病毒的目的，且可最小化耐药性产生的可能性．但问题在于，如何确定抗病毒制剂靶向的蛋白质或分子仅为病毒所需而不为细胞所必需，以及如何将抗病毒制剂的细胞毒性控制在机体能够承受的范围之内，这些论题的解析需要开展细胞信号途径方面的系统化研究．相关综述详见本节下文，以及图2与表1．
2基于宿主细胞防御层面设计的抗病毒制剂
从宿主细胞防御层面研究抗病毒制剂，即通过
TSG-101
干扰嘧啶
生物合成DHODH A3
阻断酪氨酸激酶-受体结合
AG879/A9
FGI-104
阻止TSG-101助病毒出芽
RKTs 激活
siRNA
PI3k/Akt等细胞途径抑制细胞凋亡诱导
阻断PI3k/Akt途径
Akt-Ⅳ
抑制病毒诱导
早期复制
RdRp
抑制RNA 聚合酶作用JMN3-003
DRACOs dsRNA
检测病毒dsRNA
ROS
NSC62914抗细胞氧化
Fig. 2Broad -spectrum antiviral agents designed based on cell defense mechanism
图2
基于宿主细胞防御机制设计的广谱抗病毒抑制剂
2．1
细胞膜
病毒囊膜本质上是出芽时所带离宿主的部分细
胞膜，尽管如此，病毒囊膜与细胞膜却有明显不同．研究表明，当细胞膜受到大于0.2μm 而小于10μm 的损伤后，几秒钟内就会被胞浆内膜修复，而病毒囊膜不具备这些修复功能(如新陈代谢) ．与抗菌肽作用机理相似，芳香甲基二烯罗丹宁衍生物(LJ001)的设计也是利用细胞膜与病毒囊膜的结构学差异，通过改变病毒囊膜双分子层结构，从而不
可逆地阻止病毒与细胞膜融合过程．基于此机理，不难解释LJ001为何无法阻止修复后受感染细胞与邻近细胞发生膜融合，以及为何LJ001对多种不同科的囊膜病毒效果显著，但是对非囊膜病毒无效的原因[17]．与LJ001破坏病毒囊膜以干扰病毒入侵的机理不同，下述化合物是名副其实地靶向于细胞膜———在对海洋生物抗病毒活性物质研究中，科学家们发现，角鲨体内没有任何反转录病毒的核酸序列，而此序列在其他鱼类中却大量存在，表明角鲨
2013; 40(9)王程玉, 等：广谱抗病毒抑制剂研究进展
·791·
的病毒防御机制非常有效而独特．奇怪的是，角鲨基因组既无干扰素基因也无干扰素受体基因，说明
角鲨抵御病毒入侵与干扰素抗病毒途径无关．从角鲨与八目鳗组织中提取的角鲨胺(squalamin)被认为在抗病毒过程中起着重要作用．很多病毒都利用肌动蛋白细胞骨架入侵宿主细胞，细胞膜的向细胞质面有一些由于静电力作用(这为病毒复制所需) 而被锚定的蛋白质(即膜锚定蛋白) ，其突变或者缺失可能干扰病毒入侵、复制、装配与出芽等多个过程．在与带负电荷的磷脂双分子层融合后，携带正电荷的角鲨胺可干扰并促使膜锚定蛋白异位．此外，角鲨胺还可通过替换细胞膜内表面阳离子的抑制成分以激活离子通道并抑制钠质子交换，使细胞不再支持病毒复制，由此可见角鲨胺至少可在病毒入侵与复制两个阶段对抗病毒侵染．据报道，角鲨胺在肝脏中的半衰期为12～24h ，以每日10～15mg/kg体重的剂量腹腔注射，并持续6～9天使用，可保护85%以上受感染动物免受多种囊膜病毒感染[18]．2．2
细胞自噬与凋亡
细胞程序性死亡(包括细胞自噬与凋亡) 是宿主对抗病原体侵染的第一道防御线，对维持细胞内环境稳定也具有重要作用．然而病原体在长期进化过程中往往可以调控甚至成功逃避自噬与凋亡的抗感染作用，如疱疹病毒可通过其编码的蛋白抑制细胞程序性死亡的发生，从而逃避宿主自清除，而登革热与人类免疫缺陷症病毒则可利用细胞程序性死亡，以促进自身增殖．解析病毒如何调控细胞程序性死亡以利于自身的生长与复制，可为研制抗病毒制剂提供新对策．双链RNA 激活切冬酶寡聚体(DRACOs)的设计与研究被认为是2011年病毒学领域最重要的发明与科学成果之一，其选择性地激活含有特异双链RNA(dsRNA)的细胞发生凋亡，使受感染细胞迅速凋亡，促使宿主在与病原体感染的对抗中占据优势地位．由于正常细胞中并不含有dsRNA(这也是区别感染与未感染细胞的一项决定性依据) ，理论上讲，DRACOs 对未感染细胞并无毒性作用．DRACOs 可对抗15种病毒的侵染，在不同细胞中均可发挥强抗病毒活性，同时DRACOs 突破了病毒是否有囊膜的限制，这为研制广谱抗病毒制剂开拓了全新的研究方向[19]．当然，该项研究仅证明其对实验小鼠没有明显副作用，并未过多考虑可能引致的机体反应过度等潜在问题，相信进一步研究将提供全面阐释．
2．3细胞生长与信号途径
近期发现一些针对宿主细胞生长与信号途径而设计的抗病毒蛋白质或分子，其具备广谱学意义，值得关注的是，由于选择性压力并不直接作用于病毒本身，因此机体对这些蛋白质或分子的耐药性相对不易出现．基因组中有一类维持细胞基本生命活动所必须的基因，其表达物———管家蛋白是一些病毒试图发现并加以利用的靶位，病毒通过改变其表达水平与功能以利于自身入侵，这个过程被形容为“劫持”模式．被劫持分子TSG-101可辅助性排除细胞内衰老的蛋白质，病毒则利用TSG-101从细胞内部逆行迁移到外膜(在出芽阶段) ，FGI-104分子可通过阻断这一被劫持过程以有效抑制多种血源性病毒(如肝炎与免疫缺陷病毒) 以及生物威胁病毒(如埃博拉与牛痘病毒) 的复制，对呼吸道病毒(如流感病毒) 与性传播病毒(如疱疹病毒) 的相关研究正在进行中[20]．相似地，FGI-106也是可以防治病毒性出血热的小分子，据报道，即使机体感染埃博拉病毒1天后使用也有望治愈，同时FGI-106对于乙型肝炎病毒与人类免疫缺陷病毒等也有一定的抑制作用，其抗病毒机制目前尚不完全清楚[21]．酪氨酸激酶受体RTK 可自动磷酸化酪氨酸残基，并激活细胞内诸如ERK/MAPK与PI3K/Akt等途径，这些细胞信号传导途径不仅在细胞癌变中起到关键作用，在病毒复制过程中的作用也同样重要．作为RTK 的受体阻断剂，AG879与A9分子可抑制病毒蛋白出核、RNA 合成以及病毒释放，且对多种病毒均有效[22]．此外，包括水泡性口炎病毒在内的许多病毒均可激活PI3K/Akt内源信号途径，通过诱导细胞增殖分化以避免细胞发生凋亡，从而促其自身复制，苏氨酸激酶抑制剂Akt-Ⅳ则可阻断PI3K/Akt通路，使被感染细胞启动凋亡机制[23]，另有报道表明PI3K/Akt途径抑制剂可能干扰病毒早期复制，但作用机理尚不完全清楚．
抗氧化剂
需氧细胞在代谢过程中会产生一系列活性氧簇(reactiveoxygen species ，ROS) ，低浓度ROS 环境可以起到抗微生物及抗肿瘤效果，当然过量产生2．4
ROS 也会导致细胞损伤．抗氧化剂治疗方法在临床应用并不成功，因为氧化反应并不是病毒入侵的主要反应，此外，抗氧化剂药物的生物学可利用性较低，所针对的目标较少，而且安全性越高的药物药效越低．近期发现抗氧化剂NSC62914可清
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生物化学与生物物理进展Prog. Biochem. Biophys. 2013; 40(9)
除ROS ，并且激活抗氧化基因Nrf2，据报道，以2mg/kg体重剂量注射NSC62914，可有效对抗出血热类的病毒性传染病(如拉沙热与脑炎等) ，使80%以上的感染动物多存活5～6天，其作用机理尚待进一步研究[24]．
抑制剂的耐药性较少见．然而长期使用这些化学合成的蛋白酶抑制剂所产生的毒副作用和耐药性问题日益显现，寻找新型制剂并扩大其抗病毒谱则成为新的挑战．目前一些蛋白酶研究者仍在积极探索与研究，如基于蛋白酶介导的细胞凋亡途径筛选蛋白酶结合蛋白，以发现潜在的蛋白酶抑制子[27]，希望不久的将来会有所突破．3．2化学合成物
流感至今仍为流行最广的传染病，金刚烷胺和金刚烷乙胺是病毒M2离子通道阻断剂，也是美国最初用于流感临床治疗的抗病毒制剂．但是从2003年开始，一系列的耐药毒株产生，造成了金刚烷胺的普遍耐药性．已商品化的吡嗪衍生物———法匹拉韦(T-705)对几乎所有的RNA 病毒均有一定的抑制作用，同时不影响细胞DNA 或RNA 的合成，近期研究表明，T-705对各种流感病毒耐药突变株亦有良好的治疗效果[28]，遗憾的是，T-705的抗病毒机制仍不完全清楚，推测其直接靶向于病毒RNA 依赖的RNA 多聚酶，或可能优先并入病毒的RNA 以引起高突变．另一种已商品化的核苷类似物———利巴韦林(ribavirin，三氮唑核苷，又名病毒唑) ，可以治疗多种RNA 和DNA 病毒感染，其可采用多种机制抑制同一种病毒，如抑制GTP 形成、抑制病毒RNA 多聚酶以干扰病毒核酸复制、形成GTP 类似物RTP 以导致病毒蛋白翻译错误、调节Th2向Th1反应转变等[29]，T-705与利巴韦林的抗病毒机制研究仍在继续．临床应用方面，一般常将利巴韦林与干扰素联合使用以治疗多种病毒性传染病(如丙型肝炎病毒、腮腺炎病毒以及轮状病毒) ，其中聚乙二醇化干扰素与利巴韦林的联合治疗是全球公认的丙肝标准治疗方案，而对于这种治疗无应答或复发病例，则可考虑加入2011年被美国FDA 批准后的肝炎病毒蛋白酶抑制剂波西普韦(boceprevir)，据报道这三者联用效果显著，当然其安全性与有效性值得进一步关注．3．3生物提取物
有机体分泌的黏液可以阻滞比矩阵孔径还要小的病毒，这就是“黏膜吸附”现象，黏液中的某些成分还可通过多种途径水解与杀灭入侵的病原微生物，如某些鱼类(如鲶鱼、章鱼) 体表分泌大量黏液，发挥重要的屏障功能．覆盖于肠黏膜上皮细胞
—一种多孔的生物聚合物基质，的黏液素聚合物——
是先天免疫系统对抗病原体入侵的第一道关卡．科学家们近期发现，黏液提取物(如胃黏液中的黏蛋
3
3．1
已商品化抗病毒制剂的新发展
重组蛋白
2003年，在严重急性呼吸综合征病毒大爆发
时并没有高效的疫苗或者专一性抗病毒制剂，高免疫血清与干扰素曾被用来治疗，其中干扰素表现出
良好的临床效果，与皮质激素类药物共用可在更短时间内发挥功效(时间缩短50%)．干扰素可影响病毒复制周期的各个阶段，还可促进先天免疫反应并激活免疫细胞，因此成为理想的广谱抗病毒候选药物，但是普遍存在的耐药性等问题也不容忽视．新型四氢咔唑GSK983既可阻止非病毒感染因素引起的细胞癌变，也可以阻断多种不相关病毒的复制，包括腺病毒-5与人类多乳头瘤病毒等，据报道GSK983就是通过介导某个干扰素激活基因亚单位从而发挥抗病毒功效的[25]．近年来，更多研究聚焦于干扰素介导的信号途径及其抗病毒效应机理，如细胞固有的“2-5A/Rnase L 核糖核酸酶”经典途径———病毒感染细胞之后产生的双链dsRNA 会激活干扰素，干扰素随之产生2-5A 以激活Rnase L ，从而终止病毒复制[26]．其实2-5A 本身不能穿膜，而且在体内会很快降解并引起细胞凋亡，因此不具备成为抗病毒药物的潜质．目前科学家们正尝试通过高通量筛选，以期在性质稳定的候选者中发现具有相似性质的蛋白质或化合物．此外，鉴于干扰素作用起始阶段最易发生病毒耐药性突变，如果某种蛋白质能跳过干扰素激活过程而直接促使2-5A 激活Rnase L ，即既可达到广谱抗病毒作用，又不易产生耐药性，相信这是一个有前景的研究思路．
某些Ⅰ类囊膜病毒的核衣壳蛋白与囊膜表面糖蛋白最初以蛋白质前体形式存在，其被蛋白酶裂解后才可形成有感染力的病毒粒子．人免疫缺陷病毒天冬氨酸蛋白酶与冠状病毒主蛋白酶(3C蛋白酶) 是病毒剪切多聚蛋白过程中最重要的蛋白酶，也是广谱抗病毒制剂研究的重要参考靶位．蛋白酶抑制剂研究在经历十多年的发展后，已获得令人鼓舞的结果，目前科学家们还建议，在经典的“鸡尾酒”疗法中要多考虑选用蛋白酶抑制剂以达到更好的抗艾滋病效果，因为相对于逆转录酶抑制剂，蛋白酶
2013; 40(9)王程玉, 等：广谱抗病毒抑制剂研究进展
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白) 可以对抗多种病毒感染[30]，在此基础上有望研
制成抗病毒漱口剂或伤口处理添加剂，以保护机体体腔外表面免受病毒侵染，当然其作用机理尚待进一步明确．近年来，传统中草药在广谱抗病毒研究领域日益显示出重要性，如板蓝根与黄芪对抗呼吸道病毒感染、黄连与连翘对抗消化道与呼吸道病毒感染的效果都很显著，且不易产生耐药性．如今板
蓝根已开始按照现代药学理论与方法进行临床试验，一旦作用机理全部搞清楚，将为板蓝根走出国门扫除最后一丝障碍，这个新进展带给国人很多希望与期冀．其实广谱抗病毒制剂的研究思路仍不限于此，相信我国的原创性研究成果可为推进广谱抗病毒制剂的研制进程填上重要的一笔．
Table 1Summary of broad -spectrum antiviral agents
表1
中文名
病毒层面
新型单抗邻苯二甲酸酐修饰卵清蛋白碳水化合物结合物罗丹宁衍生
物
英文名CR6261HP-OVA
广谱抗病毒抑制剂汇总
来源
应用对象流感病毒/Ⅰ类反转录病毒/Ⅰ类
试验进展体内试验细胞试验
参考文献[6][8]
机理/靶位
作用于血凝素高通量筛选阻断糖蛋白结卵清蛋白修
合受体饰物
CBAs LJ001
阻断病毒结合植物凝集素提受体取物病毒囊膜结构高通量筛选
登革热病毒/Ⅱ类流感病毒等/广谱1) 反转录病毒等/Ⅰ类
细胞试验细胞试验细胞试验
[9][17][7]
聚乙烯吡咯PVP-coated nano-silver 抑制糖蛋白结纳米银修饰物合受体烷酮包被纳
米银P20蛋白新肽N2RNA 多聚酶抑制剂
细胞层面二氢乳酸脱
氢酶交联物
细胞表面唾液酸水解酶络氨酸激酶受体阻断剂双链RNA 激活切冬酶寡聚体角鲨胺FGI-104分子FGI-106分子小干扰RNA NSC62914苏氨酸激酶抑制剂
其他
法匹拉韦阿比多尔利巴韦林
P20CAU JMN-003Compound A3DAS181(Fludase誖) AG879&A9DRACOs
六螺旋束形成酵母双杂交六螺旋束形成病毒RNA 多
聚酶
突变重组高通量筛选
反转录病毒/Ⅰ类新城疫病毒/Ⅰ类正副黏病毒/Ⅰ类流感病毒等/广谱1) 流感病毒等/Ⅰ类流感病毒/Ⅰ类
广谱1)
细胞试验体内试验细胞试验细胞试验临床试验细胞试验细胞试验
[10][11][14][13][5][22][19]
嘧啶生物合成高通量筛选水解细胞表面重组唾液酸酶
唾液酸络氨酸激酶受高通量筛选
体诱导感染细胞双链RNA-蛋
凋亡白重组复合物宿主细胞膜表生物提取物面电位细胞信号途径高通量筛选细胞信号途径高通量筛选RNA 多聚酶抗细胞氧化PI3k/Akt途径机理不明
生物合成化学合成化学合成
Squalamine FGI-104FGI-106siRNA NSC62914Akt-ⅣFavipiravir (T-705)
Arbidol Ribavirin
广谱1)
血源病毒等/Ⅰ类Ⅱ类出血热病毒/Ⅰ类Ⅱ类脑炎病毒/Ⅱ类出血热病毒等/Ⅱ类弹状病毒等/Ⅰ类Ⅲ类
体内试验体内试验体内试验细胞试验体内试验细胞试验商品化商品化商品化
[18][20][21][15][24][23][28][12][29]
吡嗪化学合成出血热病毒等/Ⅰ类Ⅱ类
流感病毒等/Ⅰ类
广谱1)
2, 5-寡腺苷酸吲哚衍生物
合成酶次黄嘌呤单磷化学酶促合成
酸腺苷
1)
对超过10种不同科类病毒均有效.
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生物化学与生物物理进展Prog. Biochem. Biophys. 2013; 40(9)
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WANG Cheng-Yu, WANG Xiao-Jia **
(College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China)
Abstract The development of broad-spectrum antiviral agents has recently become a major thrust area in the
field of virology, and received enormous attention in the pharmaceutical industry worldwide. Much progress has been made to substantially extend the limitations of current antiviral therapy drugs, which are mostly pathogen-specific. Breakthroughs were made in establishing fundamental understanding of the underlying biochemical mechanisms. Part of the research results have been implemented for practical applications. The present review addresses the state-of-the-art knowledge, prospective applications, and challenges for the development of broad-spectrum antiviral agents. Detailed models of agent targets to virus entry and infection, and host cell defense are given. Finally, future research needs and opportunities are discussed. Key words broad-spectrum, antiviral agent, virus entry, infection, cell defense DOI :10.3724/SP.J.1206.2012.00611
*This work was supported by grants from The National Natural Science Foundation of China(31101819)and The Program for New Century Excellent Talents in University(NCET-11-0486).**Correspondingauthor.
Tel:86-10-62734377, E-mail:[email protected]:December 16, 2012
Accepted:January 23, 2013