实验五 蛋白质脱盐——凝胶过滤法
【实验目的】
了解凝胶过滤层析技术的工作原理，掌握凝胶过滤层析技术，获得脱盐后的目的蛋白质溶液 【实验原理】
目的蛋白质用盐析法从细胞裂解中沉淀分离后，其中尚有大量的硫酸铵，需要脱盐才能获得较纯的样品。常用的脱盐方法有透析法、电透析法和凝胶过滤法。透析法及电透析法耗时长，样品稀释度大，不易放大进行大规模生产，所以工业生产中应用较少。凝胶过滤层析脱盐过程中盐分子和蛋白质分子大小差异巨大，蛋白质溶液中小分子的盐分子随着层析流动相进入孔径较小的固定相致辞使其在层析中的迁移速率小，而蛋白质因分子尺寸较大，不能随流动相进入固定相中，因此在层析柱中的迁移速率大，首先从层析术中流出，实现脱盐。
用凝胶过滤法脱盐时，为了使盐同蛋白质充分地分离，除了应选用足够长的层析柱之外，还应对样品的体积加以限制。样品的体积如果过大就导致蛋白质带同盐带不能分开。一般来就，样品体积不超过床体积的30%。这一数据的确定是根据盐和蛋白质的分离体积（Vsep ）决定的。两种物质分离体积的定义为，当两种物质的混合物在凝胶过滤层析柱上能够完全分离时的最小体积（参看图一）。它在数值上等于：
Vsep=VeB -V eA C
1/2 V
由于种种原因（例如样品在柱中的微小振动、固定相和流动相之间的不平衡，样品在柱中发生的纵向扩散等），产生的洗脱峰总是比理论值要宽得多。如果上柱用的样品体积等于Vsep 时，由于上述原因，两种物质的洗脱曲线会重叠造成分离失败（如图二所示），因此，上样体积应Vsep ，但是上样体积过小会造成样品过度稀释。
为了提高脱盐样品的得率，上样体积一般15-20%床体积。
一般脱盐层析柱，应为粗短型柱，以提高脱的工作效率。
用凝胶过滤层析技术对白质溶液进行脱盐处理时， 样品的浓度对分离效果，没有影响，但是，如果样品浓度过大，就会造成样品粘度增大，引起层析带和洗脱速率不稳定，造成洗脱曲线变宽和扭曲。
在选用洗脱液时，应考虑蛋白质的稳定性和蛋白质同层析介质之间的非特异性吸附作用，所以一般选用离子强度大于 0.02的磷酸缓冲液或Tris-HCl 缓冲液，如果脱盐后的蛋白质溶液要进行冷冻干燥处理时，应选用可以挥发的缓冲物质制备洗脱液，例如，乙酸铵、碳酸氢铵、乙酸乙烯二胺盐等。
洗脱液流速的大小对凝胶过滤层析柱的分辨率有影响。增大洗脱液的流速，将减小凝胶过滤层析柱的分辨率。最大分辨率时的最佳洗脱流速是2ml ·cm ·h 。但是有人发现将此速度提高5倍对分辨率的影响并不严重。在脱盐柱中，蛋白质很容易同盐分离，分辨率不是主要问题，所以可能采用较高的洗脱速度，即用5×2ml ·cm 2·h -1。 【实验器材】
φ15×500玻璃层析柱、部分收集器、紫外分光光度计、5ml 注射器及聚丙烯塑料毛细管、1ml 及5ml 吸管各2支、φ10×12试管50支、ф5×250玻璃棒、蠕动泵。 【实验试剂】
1. 含（NH 4）SO 4的目的蛋白质溶液，由实验五提供 2. 溶胀后的Sephadex-G25水悬浮液100ml
3. 铬酸钾兰色葡聚糖2000 标定液0.5ml(用1.5ml Eppendorf管称取K 2CrO 4 0.01克，兰色葡聚糖2000 0.002克，添加PBS 0.5ml)
4. 磷酸盐缓冲的生理盐水：将KH 2PO 4 0.24 克,Na 2HPO 4 1.44克和NaCl 8.0克溶于 900ml蒸馏水中用HCl 调pH 至7.4后定容至1000ml ，在15磅下灭菌20分钟。
5. Bradford试剂 【实验方法】
1. 溶胀好的Sephadex G25凝胶悬液静置后，用移液管小心移去凝胶表面的水层，注意不要造成凝胶丢失；
2. 将玻璃层析柱垂直安装于铁架台上，灌注20ml 蒸馏水，排除聚集在层析柱下部的空气泡；
3. 用玻棒将凝胶小心悬浮（注意不要引入气泡）后灌注入层析柱中，待凝胶在柱底形成2cm 高的胶柱时，打开柱下的出液阀门，使流出液流出速度为每分钟
-2
-1
5ml ，并随时用5ml 移液管吸取凝胶、小心添加在柱上面，待凝胶顶面距底部为50cm 时，停止加凝胶悬液：检查层析柱床是否均匀有无纹路和气泡； 4. 向柱顶添加PBS 至满，塞上顶塞、联通事先将输液速度调至2ml/min的蠕动泵，向柱顶输送PBS ，对柱进行平衡，在柱出液口处接一个200ml 量筒，测定记录平衡用PBS 的流出量，带流出液体积达到160ml 终止平衡；
5. 取下柱顶塞，用5ml 移液吸管小心移出柱顶的平衡液，注意不要扰动柱面，待液面降至其弯月面与柱顶凝胶相切时，关闭柱底出液阀：
6. 用带有塑料毛细管的注射器吸取K 2CrO 4和兰色葡聚糖2000组成的标定溶液0.5ml 小心沿柱壁添加到柱胶床上。打开出液阀并用50ml 量筒收集出液。待有色液完全进入柱内时关闭出液阀，用带毛细管的注射器至柱顶，塞上柱顶塞，开支蠕动泵。待兰色葡聚糖的兰色色带迁移至柱底时，记下流出液的量，将流出液毛细管出口与部分收集器相联，调正收集时间，使每分部的尺寸为1ml, 在610nm 的波长下测定OD 值，以OD 610值为纵座标，流出液体积为横座标，画出洗脱曲线（如下图所示）。将吸收峰处对应的洗脱液体积定义为柱外水体积（Vo ）得到Vo 后，改测定波长为410mn 继续测定各部分的OD 410, 取OD 410值的峰值的相对应的流出液体积为柱内水体积Vi 。
OD610
柱床体积Vt 等于Vo 、Vi 和干胶体积之和。
V Vi
7. 按照上述加标定溶液的方法将要脱盐的目的蛋白质溶液加至柱顶，以同样的方式收集洗脱液，在280nm 波长下测定OD 280得蛋白质洗脱曲线（如右图）
8. 收集A 、B 之间的分部得脱盐后的目的蛋白质溶液，用Bradford 试剂测定蛋白质的量，计算得率，样品置-20°C 冰箱保存。
Ve
B
OD 280
9. 脱盐柱继续用PBS 洗脱，待洗脱液体积超过Vi+5ml后，终止洗脱。
【思考题】
1. 你装的脱盐柱的柱参数是多少？
2. 为什么可以用K 2CrO 4和兰色葡聚糖测定凝胶过滤层析柱的柱参数？ 3. 如何使蛋白质的洗脱峰变得更加尖锐？
4. 右图表示一凝胶过滤柱的柱参数曲线请你分析一下产生此种现象的可能原因。
OD 610/410
Vo
Ve
实验五 蛋白质脱盐——凝胶过滤法
【实验目的】
了解凝胶过滤层析技术的工作原理，掌握凝胶过滤层析技术，获得脱盐后的目的蛋白质溶液 【实验原理】
目的蛋白质用盐析法从细胞裂解中沉淀分离后，其中尚有大量的硫酸铵，需要脱盐才能获得较纯的样品。常用的脱盐方法有透析法、电透析法和凝胶过滤法。透析法及电透析法耗时长，样品稀释度大，不易放大进行大规模生产，所以工业生产中应用较少。凝胶过滤层析脱盐过程中盐分子和蛋白质分子大小差异巨大，蛋白质溶液中小分子的盐分子随着层析流动相进入孔径较小的固定相致辞使其在层析中的迁移速率小，而蛋白质因分子尺寸较大，不能随流动相进入固定相中，因此在层析柱中的迁移速率大，首先从层析术中流出，实现脱盐。
用凝胶过滤法脱盐时，为了使盐同蛋白质充分地分离，除了应选用足够长的层析柱之外，还应对样品的体积加以限制。样品的体积如果过大就导致蛋白质带同盐带不能分开。一般来就，样品体积不超过床体积的30%。这一数据的确定是根据盐和蛋白质的分离体积（Vsep ）决定的。两种物质分离体积的定义为，当两种物质的混合物在凝胶过滤层析柱上能够完全分离时的最小体积（参看图一）。它在数值上等于：
Vsep=VeB -V eA C
1/2 V
由于种种原因（例如样品在柱中的微小振动、固定相和流动相之间的不平衡，样品在柱中发生的纵向扩散等），产生的洗脱峰总是比理论值要宽得多。如果上柱用的样品体积等于Vsep 时，由于上述原因，两种物质的洗脱曲线会重叠造成分离失败（如图二所示），因此，上样体积应Vsep ，但是上样体积过小会造成样品过度稀释。
为了提高脱盐样品的得率，上样体积一般15-20%床体积。
一般脱盐层析柱，应为粗短型柱，以提高脱的工作效率。
用凝胶过滤层析技术对白质溶液进行脱盐处理时， 样品的浓度对分离效果，没有影响，但是，如果样品浓度过大，就会造成样品粘度增大，引起层析带和洗脱速率不稳定，造成洗脱曲线变宽和扭曲。
在选用洗脱液时，应考虑蛋白质的稳定性和蛋白质同层析介质之间的非特异性吸附作用，所以一般选用离子强度大于 0.02的磷酸缓冲液或Tris-HCl 缓冲液，如果脱盐后的蛋白质溶液要进行冷冻干燥处理时，应选用可以挥发的缓冲物质制备洗脱液，例如，乙酸铵、碳酸氢铵、乙酸乙烯二胺盐等。
洗脱液流速的大小对凝胶过滤层析柱的分辨率有影响。增大洗脱液的流速，将减小凝胶过滤层析柱的分辨率。最大分辨率时的最佳洗脱流速是2ml ·cm ·h 。但是有人发现将此速度提高5倍对分辨率的影响并不严重。在脱盐柱中，蛋白质很容易同盐分离，分辨率不是主要问题，所以可能采用较高的洗脱速度，即用5×2ml ·cm 2·h -1。 【实验器材】
φ15×500玻璃层析柱、部分收集器、紫外分光光度计、5ml 注射器及聚丙烯塑料毛细管、1ml 及5ml 吸管各2支、φ10×12试管50支、ф5×250玻璃棒、蠕动泵。 【实验试剂】
1. 含（NH 4）SO 4的目的蛋白质溶液，由实验五提供 2. 溶胀后的Sephadex-G25水悬浮液100ml
3. 铬酸钾兰色葡聚糖2000 标定液0.5ml(用1.5ml Eppendorf管称取K 2CrO 4 0.01克，兰色葡聚糖2000 0.002克，添加PBS 0.5ml)
4. 磷酸盐缓冲的生理盐水：将KH 2PO 4 0.24 克,Na 2HPO 4 1.44克和NaCl 8.0克溶于 900ml蒸馏水中用HCl 调pH 至7.4后定容至1000ml ，在15磅下灭菌20分钟。
5. Bradford试剂 【实验方法】
1. 溶胀好的Sephadex G25凝胶悬液静置后，用移液管小心移去凝胶表面的水层，注意不要造成凝胶丢失；
2. 将玻璃层析柱垂直安装于铁架台上，灌注20ml 蒸馏水，排除聚集在层析柱下部的空气泡；
3. 用玻棒将凝胶小心悬浮（注意不要引入气泡）后灌注入层析柱中，待凝胶在柱底形成2cm 高的胶柱时，打开柱下的出液阀门，使流出液流出速度为每分钟
-2
-1
5ml ，并随时用5ml 移液管吸取凝胶、小心添加在柱上面，待凝胶顶面距底部为50cm 时，停止加凝胶悬液：检查层析柱床是否均匀有无纹路和气泡； 4. 向柱顶添加PBS 至满，塞上顶塞、联通事先将输液速度调至2ml/min的蠕动泵，向柱顶输送PBS ，对柱进行平衡，在柱出液口处接一个200ml 量筒，测定记录平衡用PBS 的流出量，带流出液体积达到160ml 终止平衡；
5. 取下柱顶塞，用5ml 移液吸管小心移出柱顶的平衡液，注意不要扰动柱面，待液面降至其弯月面与柱顶凝胶相切时，关闭柱底出液阀：
6. 用带有塑料毛细管的注射器吸取K 2CrO 4和兰色葡聚糖2000组成的标定溶液0.5ml 小心沿柱壁添加到柱胶床上。打开出液阀并用50ml 量筒收集出液。待有色液完全进入柱内时关闭出液阀，用带毛细管的注射器至柱顶，塞上柱顶塞，开支蠕动泵。待兰色葡聚糖的兰色色带迁移至柱底时，记下流出液的量，将流出液毛细管出口与部分收集器相联，调正收集时间，使每分部的尺寸为1ml, 在610nm 的波长下测定OD 值，以OD 610值为纵座标，流出液体积为横座标，画出洗脱曲线（如下图所示）。将吸收峰处对应的洗脱液体积定义为柱外水体积（Vo ）得到Vo 后，改测定波长为410mn 继续测定各部分的OD 410, 取OD 410值的峰值的相对应的流出液体积为柱内水体积Vi 。
OD610
柱床体积Vt 等于Vo 、Vi 和干胶体积之和。
V Vi
7. 按照上述加标定溶液的方法将要脱盐的目的蛋白质溶液加至柱顶，以同样的方式收集洗脱液，在280nm 波长下测定OD 280得蛋白质洗脱曲线（如右图）
8. 收集A 、B 之间的分部得脱盐后的目的蛋白质溶液，用Bradford 试剂测定蛋白质的量，计算得率，样品置-20°C 冰箱保存。
Ve
B
OD 280
9. 脱盐柱继续用PBS 洗脱，待洗脱液体积超过Vi+5ml后，终止洗脱。
【思考题】
1. 你装的脱盐柱的柱参数是多少？
2. 为什么可以用K 2CrO 4和兰色葡聚糖测定凝胶过滤层析柱的柱参数？ 3. 如何使蛋白质的洗脱峰变得更加尖锐？
4. 右图表示一凝胶过滤柱的柱参数曲线请你分析一下产生此种现象的可能原因。
OD 610/410
Vo
Ve