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第八章 细胞增殖和凋亡异常与疾病
第一节 细胞增殖异常与疾病
一、细胞周期的概述
二、细胞周期的调控
三、细胞周期调控异常与疾病
四、调控细胞周期与疾病的防治
第二节 细胞凋亡异常与疾病
一、细胞凋亡的概述
二、细胞凋亡的调控
三、细胞凋亡调控异常与疾病
四、调控细胞凋亡与疾病的防治
第八章 细胞增殖和凋亡异常与疾病
多细胞生物从组织到器官的结构形成和功能执行取决于细胞的数量和质量。正常情况下，细胞通过分裂增加细胞的数量，通过细胞分化(cell differentiation)形成特定形态、结构和生理功能的子代细胞；通过凋亡参与胚胎的发育和形态的造就，清除体内无能的、有害的、突变的或受损的细胞，以保证细胞的数量和质量。细胞的增殖、分化和凋亡始终贯穿于生命的全过程，它们相互伴随，相互关联，在胚胎发育和机体的稳态调节中发挥重要的作用。它们既受细胞外信号的影响，又依靠细胞内的级联反应进行调控，使细胞的增殖、分化或凋亡有序地进行，如果其中的任一环节发生障碍，可使机体内特定的细胞、组织和器官的结构、功能和代谢异常，导致疾病的发生。本章节主要讨论细胞增殖和凋亡异常与疾病。
第一节 细胞增殖异常与疾病
细胞增殖(cell proliferation) 是指细胞分裂和再生的过程，细胞通过分裂进行增殖，使遗传信息传给子代，保持物种的延续性和数量增多。细胞增殖是通过细胞周期来实现的，细胞周期是多阶段和多因素参与的有序的调节过程。
一、 细胞周期的概述
细胞周期(cell cycle) 或称细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束到下一次分裂终了的过程或间隔时间。依不同时相特点细胞周期分为四个阶段，即G1期(first gap phase，DNA 合成前期) 、S 期(synthetic phase，DNA 合成期) 、G2期(second gap phase ，DNA 合成后期) 和M 期(mitotic phase ，有丝分裂期) 。其中最关键的是S 期，此期细胞进行DNA 倍增和染色体复制。但并非所有细胞均处于增殖状态，根据细胞的增殖特性可将其分为三种：
(1)周期性细胞：也称连续分裂细胞。这些细胞按G 1→S →G2→M 四个阶段循环，连续运转。如表皮细胞和骨髓细胞等，它们担负着组织生长和修复任务。周期性细胞始终处于增殖和死亡的动态平衡中，不断地增殖以补充衰老脱落或死亡的细胞，这种更新称为稳态更新(steady-state renewing)。
(2)G0期细胞：也称休眠细胞。这些细胞可暂时脱离细胞周期，不进行增殖，需要适当刺激方可重新进入细胞周期，如肝和肾细胞等。G0期细胞在遭遇损伤
或应激等刺激后可返回细胞周期，进行细胞增殖，这种更新称为条件性更新 (conditional renewing)。
(3)终端分化细胞：也称不分裂细胞。一般情况下这些细胞不可逆地脱离细胞周期、丧失增殖能力并具一定生理功能，如神经细胞和心肌细胞等。但最近有迹象表明这些细胞在特定的条件下可返回细胞周期，并进行增殖。
细胞周期的特点：①单向性：即细胞只能沿G 1→S →G2→M 方向推进而不能逆行；②阶段性：各期细胞形态和代谢特点有明显差异，细胞可因某种原因而在某时相停滞下来，待生长条件适合后细胞又可重新活跃到下一时相；③检查点：各时相交叉处存在着检查点 ( checkpoint )，决定细胞下一步的增殖趋向；④细胞微环境：细胞周期是否顺利推进与细胞外信号和条件等密切相关。
二、细胞周期的调控
在多细胞生物体内，各类细胞周期存在一个非常严密的调控系统，使各类细胞可依机体的需要进行增殖或处于静止状态。细胞周期通过细胞内某些物质的合成、降解或活化来控制，还受细胞内外的各种信号的种类强度和持续时间的影响。
(一) 细胞周期自身调控
细胞周期的运行主要是通过细胞周期素或称周期蛋白(cyclin)随细胞周期不同时相进行合成与降解，通过周期素依赖性激酶(cyclin dependent kinase, CDK) 有序地磷酸化和去磷酸化来调节，同时可由CDK 抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitor, CDI)时相变化，检查点对DNA 损伤及复制和纺锤体组装作出反应加以调控等来实现(图8-1) 。
1．Cyclin ：已发现哺乳动物细胞中至少有8种cyclin ，共14个成员，即cyclinA 、cyclinB1-2、cyclinC 、cyclinD1-3、cyclinE 、cyclinF 、cyclinG1-2、cyclinH 、cyclinI 、cyclinK 和cyclinT1-2。分为三大类，即G 1期、S 期和G2/M期细胞cyclin ，各成员分别在相应期高表达（图8-2）。Cyclin 作为调节亚基，需要与催化亚基CDK 形成复合物，激活相应的CDK 和加强CDK 对特定底物的作用，驱动该期前行（表8-1）。
表8-1哺乳动物细胞主要的 Cyclin-CDK 复合物及其相关蛋白
Cyclins 相关CDKS 细胞周期作用 相关蛋白 底物
A CDK1，CDK2 S ﹢G2→M P107﹢E2F ，P21，PCNA Rb B(B1，B2) CDK1（cdc2） G2→M P21, PCNA Rb D(D1-3) CDK4(2，5，6) G1 Rb,P21,P27,P15-16,PCNA Rb E CDK2 G1﹢G1→S P107﹢E2F ，P21,PCNA Rb H CDK7 G1,S,G2,M - CDK1,4,6
Cyclin 在细胞周期中自始至终是以恒定的速度产生，有丝分裂时消失是因为降解大于合成，在间期时积累是由于合成大于降解。在各类细胞中CDK 表达的分子浓度在细胞周期各阶段是稳定的，由于cyclin 的周期性波动，以致CDK 出现周期性的活性变化。
另外，增殖细胞核抗原周期相关蛋白，它不与CDK 结合，而作为DNA 聚合酶的附属蛋白，促进DNA 聚合酶延伸DNA ，在S 期浓度最高，故常作为S 期标志物之一。
2．CDK ：是一组丝氨酸/苏氨酸(serine/threonine，Ser/Thr)蛋白激酶，各成员有不同程度的同源性，故称CDK 家族，已发现CDK 家族有9个成员CDKl-9。 CDK 激活依赖于与cyclin 的结合和其分子中某些氨基酸残基的磷酸化状态。含催化亚基的CDK 需要cyclin 提供调节亚基才能显示活性，只有cyclin 浓度升高达到阈值时，才能与相应的CDK 结合形成cyclin/CDK复合体，这时CDK 才能被激活；CDK 分子中含有活化部位和抑制部位，只有前者处于磷酸化和后者处于去磷酸化状态，CDK 才显活性。CDK 的活性还受其上游的CDK 活化激酶(CDK-activating kinase, CAK)的影响。CAK 正是通过使CDK 分子中的活化部位的氨基酸残基磷酸化来参与调控CDK 的活性。
CDK 的灭活，除了泛素( ubiquitin)介导的蛋白水解体系外，CDI 也可特异性抑制CDK 的活性(图8-3) 。
3．CDI ：是CDK 的抑制物，分子量较小，哺乳类细胞的CDI 主要包括Ink4 (1nhibitors of kinase4)和Kip(kinase inhibitory protein，Kip) 或称Cip(cdk-interacting
protein1) 或Wafl(wild-type P53 activated fragment1)等。①Ink 是一组CDK4的抑制蛋白，分子量在15 ~ 20KD ，含有一个重复的结构域ankyrin ，可特异性地与CDK4/6结合，防止其与cyclin 再结合或降低cyclin/CDK复合物的稳定性，以抑制其激酶活性。Ink4的成员包括P16Ink4a 、P15 Ink4b、P18 Ink4c 、P19 Ink4d 。其中研究较多的为P16Ink4a ，在S 期达高峰，是G1/S限制点负调控机制的重要组成部分。② Kip 是一组CDK 的抑制蛋白，N 端含有一个保守的80个氨基酸序列，可经非共价键与cyclin/CDK复合物结合，形成三元体或四元体抑制CDK 。Kip 的成员包括P21kipl 、P27kip1和P57kip2，它们在N-末端具有高度的结构和功能相似性，可特异性抑制几种cyclinD/CDK的蛋白酶活性；但其C-末端还具有各不相同的功能区。其中研究得较多的是P21kipl 、P27kip1。P21kipl 是作用较强，作用谱较广的一种CDI 。它主要调控细胞周期确保遗传物质精确地传递给下一代，以消除由于DNA 损伤而引发肿瘤，还参与细胞应激状态的信号转导。调节其合成主要有P53依赖性和P53非依赖性两条途径。P27kip1为停止细胞分裂所必需，在休止细胞内呈高表达，而在增殖细胞内呈低表达。P27kip1与G1后期所形成的cyclinE/CDK2复合物结合，通过C-末端抑制CDK2 (T160 ) 的磷酸化，灭活其活性，阻滞细胞周期。
4．细胞周期检查点：在生物进化过程中，细胞发展出了一套保证细胞周期中DNA 复制和染色体分配质量的检查机制，通常称为细胞周期检查点，这是一类负反馈调节机制。
细胞周期检查点分为三种：①DNA 损伤检查点：位于G/S交界处，如果DNA 受损，则把细胞阻滞在G1期，先进行DNA 修复，然后才能复制；②DNA 复制检查点：位于S/G2交界处，负责检查DNA 复制进度；③纺锤体组装检查点：通过检查有功能的纺锤体形成，管理染色体的正确分配。细胞周期中存在的这些检查点，可对细胞周期中前一事件(如DNA 复制或DNA 完整性和损伤) 作出反应，例如发生细胞周期阻滞，以保证细胞增殖按质完成。因此，细胞周期中某一检查点失灵、检查点的组成部件受损或检查点控制回路的调节障碍与疾病和衰老等密切相关。
检查点由三个部分构成：①探测器：负责检测上一期进展的质量问题；②传感器：将探测器所检获的“出了质量问题” 信号下传，如磷酸激酶传递给效应
器；③效应器：由效应器去中断细胞周期进程并启动修复机制。细胞周期反应CDK 既是细胞周期转折的主要调节因子，也是细胞周期检查点的效应器。因此，细胞周期中某一检查点失灵、检查点的组成部件受损或检查点控制回路的调节障碍与肿瘤和衰老等密切相关。
(二) 细胞外信号对细胞周期的调控
细胞外信号包括细胞因子、激素、基质和营养等，可分为增殖和抑制信号。 增殖信号如大多数肽类生长因子等可促使G0期细胞进入细胞周期。这些因子与细胞膜上的受体结合，启动细胞内的信号转导，促进cyclinD 合成，同时下调CDI 的合成，cyclinD 与相应的CDK 结合，使P105Rb 磷酸化而失去抑制E2F 的作用，游离的E2F 激活DNA 合成基因等，使细胞进入G1期，如丝裂原刺激持续存在，细胞继而进入S 期。而MAPK 若被磷酸化，则可抑制cyclin 降解，使细胞停留在M 期。
抑制信号如转化生长因子β (transforming growth factor-β，TGF-β) 在体内外能广泛抑制正常细胞和肿瘤细胞生长，并使细胞阻滞于G1期。TGF-β对细胞周期的调节是下调cyclin 和CDK 等的表达，主要是在G1期抑制CDK4的表达，同时还诱导P21kip l、P27kip1和P15 Ink4b等CDI 产生。
三、细胞周期调控异常与疾病
细胞周期的调控是细胞在对不同信号进行整合后依靠细胞内的级联反应完成的，其任一环节发生异常则可导致细胞增殖过度或缺陷，同时也常常伴有细胞分化异常。本节主要讨论细胞增殖异常与疾病。
(一) 细胞增殖过度
细胞增殖过度可致疾病如肿瘤、肝肺肾纤维化、前列腺肥大、原发性血小板增多症、家族性红细胞增多症、类风湿关节炎、银屑病、肾小管间质性病变、动脉粥样硬化等，其中研究最为深入的是肿瘤。下面以肿瘤为例，探讨肿瘤细胞恶性增殖与细胞周期调控异常的关系。
1．Cyclin 的异常 肿瘤的发生与cyclin(主要是cyclinD 、E) 过量表达有关。CyclinD(又称为Bcl-1) 是公认的原癌基因产物，同时也是生长因子感受器。研究显示在许多肿瘤中CyclinD1呈过表达，其机制为：①基因扩增：这是cyclinD1
过量表达的主要机制，如在B 细胞淋巴瘤、乳腺癌、胃肠癌及食道癌中，扩增程度可高达16倍以上；②染色体倒位：如在人甲状旁腺肿瘤发生倒位inv(11)(p15：q13) ，使cyclinD1基因受控于bcl-1启动子，D1蛋白伴随甲状旁腺素的大量分泌而大量产生；③染色体易位：如在B 细胞淋巴瘤，由于bcl-1断裂点发生t (11:14)(q13：q32) 易位，使cyclinD1基因易受免疫球蛋白重链基因增强子的影响而大量表达。④其它：CyclinD1在许多肿瘤中发现有扩增，尤其在乳腺癌中基因扩增达15％，而蛋白过表达高达45％，基因的扩增与过表达不成比例，提示除了扩增还可能存在其他导致过表达的机制。
CyclinD1对于正常及某些肿瘤的G1期是至关重要的，业已证明过量表达的cyclinD1可使细胞易被转化，但单独却不足以使原代细胞发生转化，需与其他癌基因协同作用，如与ras 协同作用才能转化大鼠肾细胞或大鼠胚胎成纤维细胞，与myc 协同作用能诱导转基因小鼠发生B 淋巴瘤等。另外cyclinD1本身的升高存在一个阈值，超过此阈值，则细胞反而不会进入S 期。
2. CDK的增多 肿瘤细胞中常见CDK4和CDK6的过表达。其中CDK4可能是TGF －β介导细胞增殖抑制的靶蛋白。用TGF-β处理人角化细胞时可抑制CDK4的mRNA 表达；用TGF -β处理水貂肺上皮细胞(MVILU)时可引起CDK4蛋白的减少。高浓度的CDK4可对抗p15的作用；在诱导细胞分化过程中，常有CDK4表达的下调，而CDK4持续高表达则抑制细胞分化的进行。
3. CDI 表达不足和突变 真核细胞的细胞周期由cyclin 依次激活相应的CDK 所推动。作为CDK 的抑制物，CDI 的变化直接影响CDK 的活性，由此影响细胞周期的进行。CDI 基因是肿瘤抑制基因，在肿瘤中CDI 基因有不同程度的异常，肿瘤细胞呈现CDI 表达不足或突变。
(1) InK4失活： InK4可直接与cyclinD1竞争结合G1期激酶CDK4／CDK6，抑制其对P Rb 的磷酸化作用，使游离的E2F-1与未磷酸化的P105Rb 结合，导致依赖于E2F-1转录的基因不能转录；也可间接地抑制多种生化反应(包括DNA 合成) ，从而抑制细胞周期进展。InK4失活(以缺失为主, 错义突变也较常见) 将导致细胞周期调控紊乱，诱发多种肿瘤。其中研究较多的是p16Ink4a 基因，该基因失活如纯合性缺失、染色体异位、CpG 岛高度甲基化等可与多种肿瘤发生有关，如黑色素瘤、胶质瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌、食管癌、急性白血病、乳腺癌和
直肠癌细胞等。
(2) Kip含量减少：Kip 能抑制多种CDK 的活性，如CDK2/3/4/6等，在细胞分化、细胞周期监控以及肿瘤的发生方面具有极其重要的作用，其中P21kip1、P27kip1的研究较为深入。P21kip1的表达减弱或消失可使抑制细胞增殖的作用减弱，或细胞正常增生转变为过度增生且分化不良，导致肿瘤如肝癌、黑色素瘤和骨肉瘤等的发生。P27kip1的表达降低常与肿瘤发生、分化、分级和预后等有关，P27kip1的表达越低，肿瘤分化越差、分级越高，预后越差。在人类肿瘤中常可以检测到P27kip1的表达降低，如乳腺癌，前列腺癌，肺癌，胃癌，大肠癌，卵巢癌等。
4. 检查点功能障碍 细胞周期主要的检查点是DNA 损伤检查点，分别位于G1/S和G2/M交界处，当它探测到DNA 损伤包括基因组或纺锤体损伤时，就会打断细胞周期进程，正是在检查点的正确调控下，确保细胞周期精确和有序地进行。p53基因是人类肿瘤中突变率最高的基因。在G1/S交界处，P53作为一个DNA 损伤检查点分子，能保证细胞在DNA 损伤后，停顿于G1期，以使在DNA 复制前有充分时间对损伤进行修复。如果DNA 损伤修复失败，P53则过度表达，通过直接激活bax 凋亡基因或下调bcl-2抗凋亡基因表达而诱导凋亡。这样可以消除癌前病变细胞不恰当地进入S 期，否则促进癌症的发生和发展。另外如果P53丢失可使细胞易于产生药物诱导的基因扩增，细胞分裂和降低染色体准确度。正常中心粒的复制开始于G1/S转变期，缺失P53时，一个细胞周期中可产生多个中心粒，最终导致有丝分裂时染色体分离异常，遗传的不稳定性又导致染色体数目和DNA 倍数改变，细胞进一步逃避免疫监视而演变成恶性肿瘤细胞，同时可见肿瘤侵袭性、转移性或化疗抵抗作用等增加。例如Li-Fraumeni 癌症综合征患者很容易在30岁前患各种癌症，就是因为遗传一个突变的p53基因，因而肿瘤高发。
DNA 双链断裂还可在G2/M转变期激活DNA 损伤检查点，阻止细胞进入有丝分裂，以增加修复时间和诱导修复基因转录，完成DNA 断裂损伤的修复。如果失去G2/M检查点的阻滞作用，就会引起染色体端粒附近DNA 序列丢失以及染色体的重排和基因扩增。
(二) 细胞增殖缺陷
增殖缺陷可导致许多疾病，如糖尿病肾病、神经退行性疾病(阿尔茨海默病和帕金森氏病) 和再生障碍性贫血等。糖尿病肾病是糖尿病的慢性肾脏并发症，主要是由于肾小球硬化导致肾功能减退。在糖尿病实验模型中，虽然无G1/S期Cyclin 及CDK2、CDK4的改变，但是研究发现肾小球p27表达增高，如利用p27反义寡核苷酸处理可以促进高糖环境中系膜细胞的增殖。同时研究发现高血糖或糖基化产物促进体内TGF-β1及受体表达，TGF-β1又作用于细胞周期调控蛋白，使pRb 处于低磷酸化状态。总之认为糖尿病肾病与p27过表达和pRb 低磷酸化状态协同作用抑制肾小管上皮细胞、系膜细胞或血管内皮细胞的增殖所致。
此外值得一提的是衰老，衰老是细胞脱离细胞周期并不可逆地丧失增殖能力后进入的一种相对稳定的状态。研究表明衰老细胞中的CDK 及cyclin 均有异常表达，如cyclinD 和cyclinE 的mRNA 水平比休眠细胞高很多倍，但cyclin-CDK 复合物的活性却比休眠细胞低得多；在衰老细胞中缺乏cyclinA 、cyclinB 、CDK4和CDC2的mRNA 及其产物；同时有研究表明衰老细胞中，虽然CDK2总磷酸化水平不变，但cyclinD/E-CDK中的磷酸化水平却下降，从而导致细胞停滞于G1期；另外在衰老细胞中CDI 如P16Ink4、P15Ink4和P21kip1的过表达，能抑制G1期cyclin-CDK 复合物的活性。总之，就目前的研究进展而言，衰老是多因素综合作用的结果。至于在衰老时cyclin 、CDK 和CDI 的异常表达的原因以及其促进衰老的机制尚未阐明。
四、调控细胞周期与疾病的防治
细胞周期及其调控好比一台高度自动化的机器，一经启动就按编好的程序有序地进行。如细胞自动程序、检查机制或信息传递通路等任一环节出现故障，都可使细胞周期失控，导致各种异常。其中最常见的是肿瘤，因此以肿瘤为例探讨调控细胞周期与疾病的防治。
1．合理利用增殖相关信号 EGF作为生长信号在乳腺癌尤其是非激素依赖型乳腺癌的发病机制中有着十分重要的意义。该信号可通过与受体结合激活受体酪氨酸激酶系统，经过Ras 和Akt 等途径激活NF-кβ, 提高CDK2激酶活性和使cyclinD1过表达，促肿瘤细胞的增殖，通过降低EGF 含量或采用抗EGFR 的单抗阻抑EGF 与EGFR 结合可使细胞增殖减弱。另外，当神经细胞受损时，通过输
注外源性神经生长因子可促使神经细胞的修复。
2. 抑制cyclin 或和CDK 的表达和活性 体外内实验证实，向肿瘤细胞注射抗cyclinD1抗体或反义寡核苷酸可在一定程度上抑制肺癌细胞由G1向S 期过渡，并逆转转化细胞的形态。 CDK 抑制剂Flavopiridol 是一种作用谱较广的CDK 抑制剂，在纳摩尔浓度水平可抑制CDK1、CDK2、CDK4和CDK6，从而使细胞停滞于G1/S和G2/M。
3．提高CDI 的表达和活性 CDI 基因是肿瘤抑制基因，在肿瘤中CDI 基因和蛋白有不同程度的异常，如将外源p27转染人星形瘤细胞、乳腺癌和鼻咽癌细胞，能够抑制其生长，逆转恶性表型，减少非整倍体细胞，同时使G2/M细胞增多；如将p21cDNA 转染人甲状腺、脑、肺和直肠癌等多种瘤细胞，可抑制其生长和增强其对化疗的敏感性；如采用TGF-β或cAMP 处理骨髓瘤细胞系、电离辐射处理成纤维细胞瘤或1，25-二羟维生素D3处理Hela 细胞系均可使p27kip1 的表达量明显增加，因此增加CDI 的量和提高CDI 的活性，通过修复缺陷的细胞周期调控机制可达到抑瘤作用。
4. 修复或利用缺陷的细胞周期检查点 在多数的肿瘤中可见p53基因的异常，通过转染野生型p53(wt p53) 修复缺陷的细胞周期检查点，可使肿瘤细胞的恶性表型部分逆转。同时在肿瘤治疗中，尤其是G1/S期和G2/M期DNA 损伤关卡均缺陷的肿瘤，可利用丧失G2/M阻滞作用的特性提高治疗效果。电离辐射可引起含wt p53基因的人类肿瘤细胞G1期和G2期阻滞；含突变型p53(mt p53) 基因的肿瘤细胞则只有G2期阻滞，应用药物如咖啡因缩短瘤细胞G2期则可以增加含mt p53基因的肿瘤细胞放射敏感性。此外大多数肿瘤p53基因是突变的，这些细胞G1/S期和G2/M期DNA 损伤关卡都已丧失，而肿瘤周围正常组织仍含有wt p53，如果同时应用缩短G2期的药物可使常规放化疗能够选择性地杀伤肿瘤细胞而减少对正常组织的不良作用。
第二节 细胞凋亡异常与疾病
一、细胞凋亡的概述
凋亡一词源于希腊文，原意为“花瓣或树叶的枯落”。现认为细胞凋亡 ( apoptosis ) 是指由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过
程，是程序性细胞死亡 ( Programmed cell death，PCD )的形式之一。它是病理学家Kerr 等人在1972年提出的一个不同于坏死的细胞死亡新概念，它们之间在许多方面存在显著差异 ( 见表8-2 ，图8-4) 。
表8-2细胞凋亡与坏死的比较
坏死 凋亡
1. 性质 病理性, 非特异性 生理性或病理性, 特异性
2. 诱导因素 强烈刺激, 随机发生 较弱刺激, 非随机发生
3. 生化特点 被动过程, 无新蛋白合成, 不耗能 主动过程, 有新蛋白合成，耗能
4. 形态变化 细胞肿胀, 细胞结构全面溶解破坏 细胞皱缩, 核固缩，细胞结构完整
5.DNA 电泳 弥散性降解, 电泳呈均一DNA 片状 DNA 片段化, 电泳呈梯状条带
6. 炎症反应 溶酶体破裂, 局部炎症反应 溶酶体相对完整, 局部无炎症反应
7. 凋亡小体 无 有
8. 基因调控 无 有
细胞凋亡过程可分为三个阶段：①诱导期 凋亡相关因素的作用及其启动的相关信号转导，细胞凋亡的相关因素包括诱导性因素(射线、高温、TNF 、细菌和病毒等) 和抑制性因素(IL-2、NGF 、ACTH 等) ；②效应期 相关基因接受死亡信号后按预定程序启动合成执行凋亡所需的各种酶类等，引起核酸内切酶 和caspase 家族的级联反应；③降解期 底物降解如核酸内切酶破坏多种基因，Caspase 导致细胞结构的解体等，引起细胞凋亡。
1. 细胞凋亡的形态学改变
细胞发生凋亡的早期，其表面的微绒毛消失，并与胞外基质或周围细胞分离。随后胞浆脱水，胞膜空泡化 ( blebbing )，细胞体积缩小，出现固缩( condensation )。内质网不断扩张并与胞膜融合，形成膜表面的芽状突起，称为出芽 ( budding )。晚期核质高度浓缩融合成团，染色质集中分布在核膜的边缘，呈新月形或马蹄形分布，称为染色质边集 ( margination )。但线粒体和溶酶体的形态结构变化不大。胞膜皱缩内陷，分割包裹胞浆或和核碎片，形成泡状小体称为凋亡小体( apoptosis ，这是凋亡细胞特征性的形态学改变（见图8-4）。
2．细胞凋亡的生化改变
细胞凋亡过程中可出现各种生化改变如内源性核酸内切酶激活、Caspase 的激活和DNA 的片段化断裂等，其中后者尤为重要。
DNA 的片段化是细胞凋亡主要特征。它是细胞凋亡诱导性因素通过激活内源性核酸内切酶，并攻击核小体之间的连接区以致发生断裂而形成180～200bp 的片段。这些片段在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征性的“梯”状 ( 1adder pattern ) 条带，这是判断凋亡发生的客观指标之一。同时也可见 Caspase 的激活，它是引起细胞凋亡形态学改变的主要原因之一。
二、细胞凋亡的调控
(一) 凋亡信号
1．生理性凋亡信号
(1) 某些激素和细胞因子的直接作用 糖皮质激素是淋巴细胞凋亡的典型信号；甲状腺素在蝌蚪转变为青蛙的器官凋亡性退化中起重要作用；TNF 可诱导多种细胞发生凋亡；某些兴奋性神经递质也能诱导某些神经元凋亡，如谷氨酸可诱导皮质神经元等发生凋亡。
(2) 某些激素和细胞因子的间接作用 细胞增殖需要从其它细胞获得足够的增殖信号，当其缺乏时，自杀基因 ( killer gene ) 可被激活并引发凋亡。如睾丸组织发育不良使睾丸酮不足，可致前列腺上皮细胞发生凋亡；腺垂体分泌的促肾上腺皮质激素不足可促进肾上腺皮质细胞凋亡等。
2．病理性凋亡信号
一般认为能对细胞造成伤害的许多因素都可诱发凋亡，如生物及化学毒素、病毒感染、射线、应激和化疗药等，甚至营养因素的缺乏和过度的功能负荷都能诱导凋亡，如心肌细胞负荷过重导致心肌细胞凋亡。但上述有害因素超过一定的剂量范围时则可直接引起细胞坏死。另外并不是所有的有害因素都引起凋亡，有些反而抑制凋亡，如各种化学促癌物、某些病毒(如EB 病毒、人类乳头状瘤病毒 ) 等。故认为能否诱导细胞凋亡可能与有害因素的种类、强度和持续的时间等相关。病理性凋亡信号可经下列环节诱导细胞凋亡。
(1) 氧化应激的作用 γ射线和紫外线通过辐射直接分解水分子产生羟自由基(OH) ；损伤因素(如感染、毒素等) 通过活化巨噬细胞使活性氧生成增多，并.
通过多种途径诱导凋亡，如启动膜脂质的过氧化使Ca 2+进入细胞增多；活性氧通过对DNA 的损伤，使ADP 核糖转移酶活化促进凋亡；或直接激活某些死亡基因程序等。
(2)死亡受体的激活 死亡受体是一组TNF 受体基因超家族的成员，包括Fas 、TNFR1和死亡受体3-5(death receptors, DR3、4、5) 等。它们是一组膜蛋白，与相应配体(凋亡信号) 结合后即触发凋亡过程。这些配体型凋亡信号可以是生理性的，也可以是病理性的，如Fas 配体、TNF 、DR3-5配体等。
(3)线粒体结构和功能的改变 凋亡早期可见线粒体跨膜电位(△ψm ) 的明显下降，其出现早于凋亡的生化和形态学异常。△ψm 下降的原因可能与线粒体通透性转换孔(permeability transition pore，PTP) 的改变相关， PTP 的异常可影响线粒体膜通透性(permeability transition ，PT) ，导致线粒体的能量代谢障碍等而诱发凋亡。
另外Ca 2+是参与多种蛋白质、磷脂和核酸分解酶的激活因子，特别是核酸内切酶，它是凋亡过程DNA 断裂成片段的执行者。化学毒物、细菌及病毒和氧化应激等通过干扰细胞Ca 2+通道及转运系统引起钙稳态失衡，从而诱导凋亡。
（二）细胞凋亡信号的转导
1．死亡受体介导的凋亡通路 “死亡受体通路”是由胞外TNF 超家族的死亡配体如TNF-ａ、FasL 、TWEAK 和TRAIL 引发的。这些配体和相关的细胞表面死亡受体如Fas 、TNFR 、DR3-5结合，使受体三聚化并活化，三聚化的死亡受体通过DD （death domain ）域募集衔接蛋白如TRADD 和/或FADD 。衔接蛋白通过死亡效应域（death effecter domain, DED）与procaspase-8形成死亡诱导信号复合物（death-inducing signaling complex, DISC）。procaspase-8具有弱的催化活性，在DISC 中局部浓度高，可发生自我剪接并活化，然后释放到胞浆并启动caspase-8的级联反应，激活下游的效应caspase 如caspase-3、6和-7，导致细胞凋亡；活化的caspase-8同时能激活Bcl-2家族的促凋亡因子Bid ( binding interface database) ，形成一种截短的Bid （ truncated Bid, tBid），后者转移到线粒体，破坏线粒体膜的通透性，从而诱导Cyto-C 释放进入胞浆，进而把死亡受体通路和线粒体通路联系起来，有效地扩大了凋亡信号的作用。
目前研究的较多的是Fas 蛋白，Fas 蛋白是细胞膜上的跨膜蛋白，属于TNFR
家族。作为膜受体的Fas 蛋白可与T 淋巴细胞表面的Fas 配体结合，也可与抗Fas 的抗体结合，从而启动细胞凋亡，其相关的信号转导通路为：①Fas 配体或抗Fas 抗体与Fas 蛋白结合，引起神经鞘磷脂酶的活性上升，使神经鞘磷脂分解产生神经酰胺并作为第二信使激活相应的蛋白激酶，从而诱导细胞凋亡；②抗Fas 抗体或TNF 与Fas 蛋白结合后可激活ICE ( 1L-1 β converting enzyme ) 样的caspase ，后者可降解H1组蛋白，使染色体松弛，DNA 链舒展而暴露出核酸内切酶的酶切位点，使DNA 链易被切割；③Fas 蛋白被激活后也可以通过Ca 2﹢信号系统传递死亡信息而导致细胞凋亡。
2．线粒体介导的凋亡通路 线粒体途径是众多细胞凋亡信号转导途径中最重要的途径之一。该通路涉及一个CED-4/CED-3样的“凋亡体”，还需要位于线粒体的促凋亡蛋白的参与，它主要是由死亡受体非依赖的凋亡诱导信号（如射线，化疗药、微生物、细胞因子和生长因子缺乏等）启动的。一般认为氧化应激所致的损伤和钙稳态失衡等可作用于线粒体通透性转换孔，导致线粒体膜通透性的增高，促使线粒体释放凋亡启动因子 (Cyto-C、AIF 、Apaf-1) 、Smac/Diablo ( second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pI ) 和procaspase-3等入胞浆，并通过下列机制导致细胞凋亡：①Cyto-C 在dATP 存在的情况下，与凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)结合，使Apaf-1暴露出CARD 结构域 ( caspase activation and recruitment domain )，并与procaspase-9的CARD 结合形成凋亡的复合体( apoptosome )，导致procaspase-9激活，后者通过级联反应激活下游的procaspase-3、6、7等，这些蛋白酶通过多个途径作用于细胞骨架蛋白、DNA 修复调节因子、细胞周期调节蛋白等，也包括Bcl-2家族的某些成员，导致细胞DNA 修复功能丧失、核酸内切酶激活、DNA 片断化，失去正常功能而凋亡。②AIF 通过促进线粒体释放细胞色素C 而增强凋亡的信号，并可快速激活核酸内切酶；③Smac/Diablo可能通过阻断凋亡抑制蛋白 ( inhibitors of apoptosis protein, IAPs ) 的作用，参与细胞凋亡的调控。IAPs 为一组具有抑制凋亡作用的蛋白，主要抑制caspase-3，7，9而抑制细胞的凋亡。
另有报道提及内质网可以介导凋亡通路，内质网中过多蛋白的积累或钙平衡的破坏，可以引起内质网压力增高导致细胞凋亡。一般情况下凋亡刺激可以激活三种凋亡通路的一种，且以前两种为主。
（三）细胞凋亡的执行
1. caspases
天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶（cystein-containing aspartate-specific
protease ，Caspase ）又称半胱天冬酶是研究得最清楚的细胞凋亡执行者。最先发现caspase 是ICE ，即caspase-1，随后又发现了一系列的caspase ，统称为caspases ，以序号区分（caspase1-14）。
caspase成员都具有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性，通常以酶原形式存在，包括三个结构域即NH2末端结构域、大亚基和小亚基。各结构域之间由天冬氨酸水解酶识别结构分隔。Procaspase 有两个结构特点对其活化至关重要：① NH2末端结构域的序列和长度高度变异，而该结构可能与caspase 所表现的不同功能以及各异的活化机制有关；② 所有procaspase 的各结构域之间具有相同的分割区域，这提示proaspase 可以自身活化或者被具有相同结构特点的酶活化。procaspase 活化时，各结构域之间蛋白连接结构水解，大小亚基结合形成异二聚体。在已知晶体结构的caspase-1和caspase-3活化体中，由异二聚体进一步形成四聚体，当中包含两个催化基团。每个催化结构域中大小亚基紧密相连，共同完成底物结合与催化功能。Caspase 是一种高度特异的蛋白酶，它具有在天冬氨酸之后剪切蛋白的特点。被剪切蛋白质NH2末端至少有四种氨基酸对剪切位置是明确的，这是caspase 具有催化活性的必要保证。对这四种氨基酸的识别在caspase 之间显著不同，导致caspase 成员之间生物功能的差异。但并非所有含有这四种氨基酸结构的蛋白都被活化，这提示caspase 三级结构可能会影响底物识别。
Caspases 可分为启动型caspase( caspase-8～10) 和效应型caspase
(caspase-3、6、7) 两类。以caspase-8为例，凋亡信号与死亡受体Fas 结合后, Fas 的胞内死亡结构域DD 与接头蛋白FADD 结合, 进一步激活caspase-8, 通过自身催化功能, 在局部形成高浓度的启动型caspase, 后者再活化其它效应型caspase, 引起凋亡。
目前已知的caspase 功能有：① 灭活凋亡抑制蛋白 如caspase 激活的脱氧核糖核酸酶 ( caspase-activated deoxyribonuclease, CAD )，正常细胞中CAD 与ICAD 结合不具有催化活性。当发生凋亡时，ICAD 被caspase 灭活并与CAD 分离，此时CAD 即表现出核酸酶活性，使DNA 片段化；同时caspase 可抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2，同
时产生一些可促进凋亡的片断；② 直接作用于细胞结构并使之解体 在核膜下有一层由lamins 物质构成的板层结构，它参与染色质构成。凋亡细胞中lamins 被caspase 裂解，从而使板层结构崩解并导致染色质浓缩；③ 分解与细胞骨架构成相关的蛋白 如PAK2可使细胞结构重组并凋亡；④瓦解核结构成核碎片。
2. 内源性核酸内切酶 正常情况下多种内源性核酸内切酶是以无活性的酶原形式存在胞核内，且多数为Ca 2+/Mg2+依赖的, 但Zn 2+可抑制其活性。凋亡诱导因素可通过启动信号转导，调控胞内某些成分(如Ca 2+) 激活内源性核酸内切酶，活化的内切酶可作用于核小体连接区，使DNA 断裂成核小体倍数大小即180～200bp 的片段。
3. 其它 据报道组织型转谷氨酰胺酶(tissue-type transglutaminase) 与凋亡小体的形成有关, 它通过催化γ谷氨酰与ε赖氨基交联形成稳定的构架, 使内容物保留在凋亡小体内。另外当胞浆Ca 2+增加时, 使定位于胞浆的需钙蛋白酶 ( Calpains )被活化, 参与酶的活化和膜的再塑等凋亡过程
（四）细胞凋亡的基因调控
1. Bcl-2家族 Bcl-2家族的成员是高等动物中生存和死亡信号至关重要的整和因子。该家族可细分成三大类：抗凋亡成员，如Bcl-2和Bcl-XL ，它们能细胞免受凋亡；促凋亡成员，如Bax 和Bak ；以及BH3-only 死亡蛋白。促凋亡和抗凋亡成员间的相互作用定了细胞死亡的阈值。Bcl-2是B 细胞淋巴瘤/白血病2 ( B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2 )基因的缩写形式，它是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因。人的Bcl-2蛋白由229个氨基酸组成，小鼠为236个。应用单克隆抗体定位研究证实，Bcl-2蛋白主要分布在线粒体内膜、细胞膜内表面、内质网和核膜等处。广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种瘤细胞。Bcl-2的高表达能阻抑多种凋亡诱导因素 ( 如:射线、化学药物等 ) 所引发的细胞凋亡，如依赖神经生长因子的神经细胞，当撤除神经生长因子后，细胞会迅速发生凋亡，如果将表达Bcl-2的基因质粒注入细胞中，则可防止神经细胞凋亡。临床研究发现，当淋巴细胞性白血病病人外周淋巴细胞有20％以上呈Bcl-2阳性时，其预后不佳，因为Bcl-2的过高表达，可导致肿瘤细胞对射线和抗癌药物的耐受性增强，不易发生凋亡。
目前认为Bcl-2抗凋亡的主要机制是：① 直接抗氧化；② 抑制线粒体释放
促凋亡的蛋白质，如细胞色素C 和凋亡诱导因子 ( AIF )；③ 抑制促凋亡性调节蛋白Bax 和Bak 的细胞毒作用；④ 抑制凋亡蛋白酶 ( caspases ) 的激活；⑤ 维持细胞钙稳态。
2. P53 野生型P53 ( wtP53 ) 基因具有诱导细胞凋亡的功能。野生型P53基因编码的p53蛋白是一种DNA 结合蛋白，它编码的p53蛋白在细胞周期的G1期发挥检查点 ( checkpoint ) 的功能，负责检查染色体DNA 是否有损伤，一旦发现有缺陷的DNA ，它通过刺激CDI 的表达阻滞细胞周期，并启动DNA 修复；如果修复失败，P53则启动细胞凋亡, 把可能演变为癌的细胞消灭在萌芽状态，因此P53有“分子警察”( Molecular Policeman ) 的美誉。P53突变型则不具有促进细胞凋亡的作用，甚至有报道称P53突变型能驱动细胞周期。
3．其它 C-myc 是一种癌基因。其蛋白具有双向的调节作用。C-myc 蛋白作为重要的转录调节因子，既可激活介导细胞增殖的基因诱导细胞增殖，也可激活介导细胞调亡的基因而诱导凋亡，细胞何去何主要取决于细胞接受何种信号以及细胞所处的生长环境，如在c-myc 基因表达后，如果没有足够的生长因子持续作用细胞就发生凋亡；反之细胞就处于增殖状态。
（五）吞噬细胞对凋亡细胞的识别与吞噬
正在凋亡的细胞以及凋亡小体的最终结局是被邻近的吞噬细胞或正常细胞迅速识别和吞噬，进而被吞噬细胞内的溶酶体酶彻底消灭（见图8-4）。这是机体保持正常生理功能的需要。如果吞噬细胞的内涵物外泄，就会引起炎症反应和次级损伤。同时，如果凋亡细胞的核小体释放出来，还会刺激正常活细胞合成DNA 和免疫球蛋白，这可能是某些系统性红斑狼疮病人血中有核小体DNA 、抗核抗体以及炎性自身抗体产生的原因。
巨噬细胞是“专职”的吞噬凋亡细胞和凋亡小体的细胞群。除此之外，各种肿瘤细胞甚至是正常细胞如上皮细胞也有此功能。体外研究表明，吞噬细胞上至少有3类受体，可对凋亡细胞进行识别。而凋亡细胞上也有相应的死亡标记，表明其“可食性”。
1. 吞噬细胞凝集素(Lectin)的作用 细胞相互作用的机制之一是一个细胞表面的糖类可与另一个细胞表面的凝集素结合，这种结合作用可被凝集素所识别的单糖所抑制。凋亡细胞中细胞表面糖蛋白失去唾液酸侧链时，原来处于隐蔽状态
的N- 乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖和半乳糖等单糖暴露出来，从而可与吞噬细胞表面的植物凝集素结合并发生相互作用。
2. 血小板反应蛋白(TSP)介导吞噬 吞噬细胞分泌的血小板反应蛋白可介导巨噬细胞上的victronectin 受体对凋亡细胞的吞噬。TSP 是一个多功能的三聚体式的并含有RGD 序列的粘附糖蛋白。许多细胞都能分泌TSP ，它与血小板凝集、肿瘤转移、胚胎发生等细胞间和细胞与基质的相互作用有关。TSP 由巨噬细胞合成并分泌入外周血，TSP 结合到 CD36等上在巨噬细胞表面形成粘连复合物，并在巨噬细胞表面和凋亡的中性粒细胞之间形成分子桥，介导巨噬细胞对凋亡细胞的清除。
3．磷脂酰丝氨酸受体的作用 正常血细胞膜上的磷脂是不对称分布，外层为中性磷脂如鞘磷脂与磷脂酰胆碱，内层为磷脂酰丝氨酸(PS)。当细胞凋亡时，这种磷脂的不对称分布被破坏，暴露内层的相关成份，从而导致这些细胞被巨噬细胞上的磷脂酰丝氨酸受体识别和吞噬。
以上介绍了吞噬细胞参与凋亡细胞的识别和吞噬三类分子，对于不同识别机制的选择和在吞噬识别过程中的相互作用了解甚少。在吞噬识别中，一类吞噬细胞中的不同个体可能使用了不同的识别机制，或者不同的吞噬细胞使用了相同的吞噬识别机制。搞清吞噬细胞清除凋亡细胞的机制，通过给药促进特异的吞噬清除功能，具有潜在的医疗价值。
三、细胞凋亡调控异常与疾病
细胞凋亡有重要的生理和病理意义。适度的凋亡具有以下作用：①确保正常生长发育 清除多余和/或失去功能的细胞，在组织器官成熟过程中发挥重要作用，如人胚胎肢芽发育过程中指 ( 趾 ) 间组织，通过细胞凋亡而被逐渐消除，形成指 ( 趾 ) 间隙；②维持内环境稳定 细胞凋亡可清除受损、突变或衰老的细胞，以维持内环境稳态，预防疾病发生或满足生理的需要, 如清除了针对自身抗原的T 淋巴细胞，以维持免疫系统功能的稳定。③发挥积极的防御功能 当感染病毒时，受感染的细胞发生凋亡，使DNA 发生降解，整合于其中的病毒DNA 随之被破坏而阻止了病毒的复制。
因此适度适时的细胞凋亡是维持细胞群体数量稳态的重要手段，如果凋亡失调将影响正常的生长、发育、促进衰老和导致各种疾病。凋亡失调包括细胞凋亡
不足或/和凋亡过度。
(一) 细胞凋亡不足
这类疾病包括肿瘤、病毒感染性疾病、自身免疫病等。其共同特点是细胞凋亡相对不足，细胞群体稳态被破坏，导致病变细胞异常增多, 病变组织器官体积增大，功能异常。
1．细胞凋亡不足与肿瘤
(1) 细胞凋亡不足与肿瘤的发生 目前认为，肿瘤发生与细胞凋亡不足密切相关，主要与下列基因有关：① Bcl-2基因 是细胞凋亡抑制基因，研究表明Bcl-2基因在滤泡性B 细胞淋巴瘤、神经母细胞瘤、白血病、前列腺癌和结肠癌等癌组织中高表达，且与预后不良相关；② P53基因：是目前最受关注的抑癌基因，已有研究表明在多数癌组织中P53基因突变或缺失 ( 如在肺非小细胞肺癌P53基因的突变率为50%以上 ) , 导致细胞凋亡减弱，使肿瘤的发生率明显增加。
(2) 细胞凋亡不足与肿瘤的发展 当发生癌前病变和肿瘤时，细胞增殖与凋亡失衡，使细胞净增长率提高，具体表现为: ① 细胞增殖增强, 细胞凋亡减弱；② 细胞增殖并不增强, 但细胞凋亡显著减弱。临床评估肿瘤的发展和预后等应统筹考虑细胞增殖与凋亡两个方面，但遇到的主要障碍是细胞凋亡很难被准确定量检测，因为凋亡发展快，且不留痕迹。
(3) 细胞凋亡不足与肿瘤的转移 当环境变得不适宜细胞生长时，正常细胞就会发生凋亡。肿瘤细胞尤其是转移性肿瘤细胞失去上述特性，便可移行到远离起源组织的地方定居存活形成转移灶。已知一些癌细胞对生理性刺激诱导的凋亡反应低下；根据瘤细胞的异型性和分化程度, 皮肤基底细胞癌和Bowen 瘤应属高度恶性的肿瘤，但却表现为细胞生长缓慢、侵袭力弱和极少发生转移，研究证实这些组织中的细胞凋亡非常明显。因此推测细胞凋亡降低与肿瘤的浸润和转移相关，但目前尚缺乏有力的证据。
2. 细胞凋亡不足与病毒感染性疾病 病毒感染中，病毒和宿主通过调控细胞凋亡的速率以利于自身生存。宿主利用细胞凋亡介导感染细胞的自杀，而结束病毒的繁殖, 如HIV 感染的CD 4+ 淋巴细胞；而病毒在逃避宿主防御机制时逐渐形成抑制感染细胞凋亡的程序。病毒及其产物抗凋亡的可能机制为：① 灭活p53
p53是G1/S期交界处检查点的主要物质，它可阻止有突变基因组等的细胞进入S 期，并可诱导细胞发生凋亡，如SV40的T 抗原、腺病毒的E1B55kD 蛋白和E1B19kD 蛋白等都可结合p53，并阻断其转录活性；② 高表达Bcl-2或Bcl-2样蛋白 腺病毒E1B 蛋白能直接阻断凋亡, 其基因结构与Bcl-2部分同源。EB 病毒 ( Epstein-Barr Virus，EB ) 的基因BHRF1等基因序列和功能与Bcl-2 有不同程度的类似，可使淋巴细胞时永生化。临床发现EB 病毒与人类Burkitt 淋巴瘤和鼻咽癌等有关。据报道EB 病毒的产物潜伏膜蛋白 ( latent membrane protein,LMP-1 )能特异性地上调Bcl-2，防止B 细胞凋亡; ③ 灭活ICE 痘病毒产生ICE 的抑制物, 如牛痘病毒基因CrmA 产物作为ICE 家族特异性抑制剂可抑制多种刺激诱导的凋亡，这是感染病毒细胞逃避凋亡的机制之一。
3. 细胞凋亡不足与自身免疫病 自身免疫病的特征是自身抗原受到自身抗体或致敏T 淋巴细胞的攻击，造成自身组织器官损伤和破坏。如系统性红斑狼疮、多发性硬化症、胰岛素依赖性糖尿病、慢性甲状腺炎和系膜增殖性肾小球肾炎等。它可能与免疫系统在发育过程中未能将针对自身抗原的免疫细胞以细胞凋亡的方式有效清除相关。
(二) 细胞凋亡过度
这类疾病包括免疫缺陷疾病、心血管疾病和神经元退行性疾病等。其共同特点是细胞凋亡过度，细胞死大于生，细胞群体的稳态被破坏，导致细胞异常减少或组织器官体积变小，功能异常。
1．细胞凋亡过度与AIDS
艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症 ( acquired immunodeficiency syndrome，AIDS )，它是由人类免疫缺陷病毒 ( HIV ) 感染引起的一种传染性疾病，其关键的发病机制是CD 4+淋巴细胞被选择性的破坏，由于CD 4+ 淋巴细胞数显著减少而导致相关免疫功能缺陷。HIV 导致CD 4+ 淋巴细胞凋亡与下列因素有关：
(1) gp120糖蛋白的表达 HIV 感染可刺激宿主细胞膜表达gp 120糖蛋白，gp 120可与表面存在其受体的淋巴细胞的CD 4+分子结合后可触发CD 4+ 淋巴细胞调亡。
(2) 合胞体的形成 受HIV 感染的大部分CD 4+ 淋巴细胞逐步融合形成合胞体（ syncytia ）或多核巨细胞，合胞体在形成过程中或形成后均可发生凋亡而解体。
(3) Fas基因表达的上调 HIV 感染可引起CD 4+ 淋巴细胞的Fas 基因表达上调，使其对Fas 介导的凋亡敏感性升高。
(4) T 细胞的激活 HIV 感染使CD 4+ 淋巴细胞处于激活状态。正常情况下被激活的细胞会迅速发生增殖反应，但在HIV 感染时，被激活的CD 4+ 淋巴细胞不但不增殖，反而发生凋亡。这与HIV 的侵袭引起淋巴细胞生长因子的生成减少有关，即激活的CD 4+淋巴细胞由于处于非生理环境而发生凋亡。
(5) 细胞因子的分泌 受HIV 感染的巨噬细胞分泌TNF 增多，TNF 可通过与TNFR-1 结合启动死亡程序，也可刺激CD 4+ 淋巴细胞产生大量氧自由基而触发细胞凋亡。
(6) Tat蛋白的产生 受HIV 感染的细胞可产生tat 蛋白，这种蛋白可自由通过细胞膜，当Tat 蛋白进入CD 4+ 淋巴细胞后，可诱导细胞产生氧自由基，增强Fas 抗原表达而提高其对细胞凋亡的易感性。
(7) 在HIV 慢性感染阶段，受感染的CD 4+ 淋巴细胞可作为效应细胞诱导未受感染的CD 4+ 淋巴细胞凋亡。这是慢性HIV 感染时CD 4+ 淋巴细胞数量减少的原因。
总之，HIV 感染通过多因素和多途径诱导CD 4+ 淋巴细胞凋亡，使CD 4+ T 淋巴细胞大量减少，它虽然可导致相关免疫功能缺陷，但也具有一定的保护意义，因为凋亡可使宿主细胞的DNA 发生降解，使整合于其中的病毒DNA 被破坏，这样可有效地终止病毒的复制和表达，但细胞凋亡在HIV 感染中的有限的保护作用不足以补偿它对整个免疫系统的打击。因此在积极抗病毒治疗的同时，如何阻止免疫细胞的凋亡是AIDS 病人免疫重建的关键所在。
2．细胞凋亡过度与心脏疾病 心肌缺血或缺血-再灌注损伤和心力衰竭与细胞凋亡有关。近期研究显示心肌细胞损伤不但有坏死，也有凋亡。缺血-再灌注损伤细胞凋亡有如下特点：① 缺血早期以细胞凋亡为主，晚期以细胞坏死为主；② 在梗死灶的中央通常以细胞坏死为主，周边部分以细胞凋亡为主；③ 轻度缺血以细胞凋亡为主，重度缺血通常以细胞坏死为主；④ 在一定时间范围内缺血-再灌注损伤时发生的细胞凋亡比同时间的单纯缺血更严重；⑤ 急性严重的心肌缺血以心肌坏死为主，而慢性轻度的心肌缺血则以细胞凋亡为主。
此类疾病引起细胞凋亡的机制可能与下列因素有关：①体内实验证明，应用
SOD 可显著减少缺血-再灌注引起的心肌细胞凋亡，提示与氧化应激有关；② 缺血或缺氧可引起心肌细胞死亡受体Fas 显著上调，使其可能通过与FasL 反应而导致细胞凋亡；③缺氧可增加P53基因的转录，因此认为缺血所致凋亡可能与P53基因的激活有关。
另外在心力衰竭发生发展过程中出现的许多病理因素，如压力或容量负荷过重、氧化应激、缺血和缺氧等都可诱导心肌细胞凋亡，这提示细胞凋亡可能是心力衰竭发生发展的重要原因之一。如在压力负荷过重引起的心力衰竭动物模型观察到心肌细胞数量减少，研究证实它是细胞凋亡过度所致；同时临床证实心衰病人心肌标本的凋亡指数 ( 即发生凋亡的细胞核数/100个细胞核 ) 可高达35.5％(对照0.2％-0.4％) ；另外研究表明阻断诱导心肌细胞凋亡的信号有助于阻遏凋亡，防止心肌细胞数量的减少。这些说明心力衰竭时心肌细胞数量的减少是因凋亡过度所致。
3. 细胞凋亡与神经退行性疾病 细胞凋亡过度可致阿尔茨海默氏病 ( Alzheimer，s disease， ( Parkinson，s disease，PD) 等。其中AD 的研究最为广泛，AD 又称早老性痴呆，它的发病机制主要是细胞凋亡所致神经元丧失。其发病机制可能与下列因素有关：①Fas 抗原的介导：AD 病人死后大脑组织发现有β-淀粉样物质沉积的老年斑及有许多Fas 阳性细胞(其中主要是星形神经细胞) ，但大多数抗原阳性细胞的胶原纤维酸性蛋白(GFAP)呈阳性，Fas 抗原介导该星形神经细胞凋亡，其机制可能与GFAP 的下调密切相关；②P53基因的活化：在转基因小鼠中观察到沉积β-淀粉样物质的神经元和P53活化的关系，发现伴随神经元核内片段有P53的表达，在AD 病人颞部皮质P53表达量高于正常，这说明了P53活化并参与AD 病人神经胶质细胞凋亡过程；③c-Jun 和c-foc 及其编码蛋白的作用：在培养的海马细胞中加入β-淀粉样物质后可表达Jun 蛋白，其蛋白可诱导海马细胞凋亡，同时发现AD 病人海马细胞c-foc 过度表达，这些说明c-Jun 和c-foc 在AD 的病理过程中发挥重要的作用；④APP695基因突变的作用：β-淀粉样物质的前体是正常的APP695，在AD 病人神经胶质细胞可见APP695的错义突变，后者可能通过细胞膜内侧的G 蛋白介导参与凋亡；⑤低亲和力神经生长因子受体(P75NGFR ) 高表达： P75NGFR 是TNF 家族成员之一。研究显示P75NGFR 在AD 中高度表达，且表达P75NGFR 的神经细胞对β-淀粉样物
质致损的敏感性显著提高，这说明P75NGFR 与神经细胞凋亡有关：⑥NF-κB 的活化：已有研究显示β-淀粉样物质可导致NF-κB 活化，若用抗氧化剂如维生素E ，以清除氧自由基，可阻止该过程。同时研究发现采用钙拮抗剂尼莫地平可抑制胞内游离钙浓度的上升，并阻断细胞凋亡，延缓神经元的死亡，改善AD 的症状。因此推测在AD 中β-淀粉样物质可通过产生活性氧而活化NF-κB ，后者作为一种转录因子直接或间接地参与AD 细胞的凋亡。。
另外还有凋亡不足和过度共存的现象，人类组织器官通常由不同种类的细胞构成如心脏的主要细胞是心肌细胞和心肌间质细胞，血管则以内皮细胞和平滑肌细胞为主。由于细胞类型的差异，在致病因素的作用下，有些细胞表现为凋亡不足，另一些可表现为凋亡过度，因此在同一疾病或病理过程中两种情况也可同时并存。如动脉粥样硬化其内皮细胞凋亡过度，而平滑肌细胞则是凋亡不足。
四、调控细胞凋亡与疾病的防治
调控细胞凋亡的速率可防治各种疾病，目前人们正针对凋亡发生的各个环节探索各种防治方法。
1．合理利用凋亡相关因素 凋亡诱导因素是凋亡的始动环节，人们正尝试将这类因素直接用于治疗一些因细胞凋亡不足或过度而引起的疾病。例如低剂量照射、使用外源性TNF 、高温、激素受体阻断剂和某些生长因子或激素的撤除，也可通过给细胞转染Bcl-2等来调控细胞凋亡。
2．干预凋亡信号转导 Fas/FasL信号系统是重要的凋亡信号转导通路之一，理论上凡能调节和抑制Fas 和FasL 的因素均能用于凋亡有关疾病的治疗，如利用阿霉素刺激肿瘤细胞在其细胞膜上表达Fas/FasL，从而诱导凋亡。另外研究表明调节和抑制线粒体介导的凋亡通路可防止细胞凋亡。如免疫抑制剂环胞霉素A ( cyclosporin A ) 具有阻抑ΔΨm 下降和防止PTP 开放的作用，从而防止细胞凋亡的发生。
3．调节凋亡相关基因 运用分子生物学手段，人为地控制凋亡相关基因的表达以控制凋亡过程，可以达到防治疾病的目的。如利用各种载体将抑癌基因导入肿瘤细胞内，从而诱导肿瘤细胞凋亡。人们可通过反义寡核苷酸特异地与凋亡相关基因互补来抑制相应基因的表达。反义DNA 是人工合成的与靶mRNA 某些
区段互补的DNA 片段，它与靶mRNA 结合形成DNA-mRNA 杂交链，抑制或封闭相应基因的表达。如运用反义Bcl-2寡核苷酸来抑制Bcl-2过表达的B 淋巴细胞癌的生长或提高肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，使肿瘤细胞凋亡明显增多。
4. 控制凋亡相关的酶 核酸内切酶和caspases 是调控细胞凋亡最为关键的酶，若能抑制它们的活性，细胞凋亡过程必然受阻。如Caspase 酶基因转入白血病细胞并使其高表达，可加速白血病细胞发生凋亡；或通过使用 Caspases 抑制剂可明显减少心肌细胞凋亡，从而缩小心肌梗死面积和改善心肌功能。使用含锌药物可抑制内源性核酸内切酶的活性，从而治疗某些与细胞凋亡过度有关的疾病，如AD 和AIDS 等。
(杨惠玲)
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图8-1 细胞周期及调节
图8－3 CDK
的灭活
图8-4 细胞死亡过程的形态学变化
总字数：23,521 图：4 表：2
第八章 细胞增殖和凋亡异常与疾病
第一节 细胞增殖异常与疾病
一、细胞周期的概述
二、细胞周期的调控
三、细胞周期调控异常与疾病
四、调控细胞周期与疾病的防治
第二节 细胞凋亡异常与疾病
一、细胞凋亡的概述
二、细胞凋亡的调控
三、细胞凋亡调控异常与疾病
四、调控细胞凋亡与疾病的防治
第八章 细胞增殖和凋亡异常与疾病
多细胞生物从组织到器官的结构形成和功能执行取决于细胞的数量和质量。正常情况下，细胞通过分裂增加细胞的数量，通过细胞分化(cell differentiation)形成特定形态、结构和生理功能的子代细胞；通过凋亡参与胚胎的发育和形态的造就，清除体内无能的、有害的、突变的或受损的细胞，以保证细胞的数量和质量。细胞的增殖、分化和凋亡始终贯穿于生命的全过程，它们相互伴随，相互关联，在胚胎发育和机体的稳态调节中发挥重要的作用。它们既受细胞外信号的影响，又依靠细胞内的级联反应进行调控，使细胞的增殖、分化或凋亡有序地进行，如果其中的任一环节发生障碍，可使机体内特定的细胞、组织和器官的结构、功能和代谢异常，导致疾病的发生。本章节主要讨论细胞增殖和凋亡异常与疾病。
第一节 细胞增殖异常与疾病
细胞增殖(cell proliferation) 是指细胞分裂和再生的过程，细胞通过分裂进行增殖，使遗传信息传给子代，保持物种的延续性和数量增多。细胞增殖是通过细胞周期来实现的，细胞周期是多阶段和多因素参与的有序的调节过程。
一、 细胞周期的概述
细胞周期(cell cycle) 或称细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束到下一次分裂终了的过程或间隔时间。依不同时相特点细胞周期分为四个阶段，即G1期(first gap phase，DNA 合成前期) 、S 期(synthetic phase，DNA 合成期) 、G2期(second gap phase ，DNA 合成后期) 和M 期(mitotic phase ，有丝分裂期) 。其中最关键的是S 期，此期细胞进行DNA 倍增和染色体复制。但并非所有细胞均处于增殖状态，根据细胞的增殖特性可将其分为三种：
(1)周期性细胞：也称连续分裂细胞。这些细胞按G 1→S →G2→M 四个阶段循环，连续运转。如表皮细胞和骨髓细胞等，它们担负着组织生长和修复任务。周期性细胞始终处于增殖和死亡的动态平衡中，不断地增殖以补充衰老脱落或死亡的细胞，这种更新称为稳态更新(steady-state renewing)。
(2)G0期细胞：也称休眠细胞。这些细胞可暂时脱离细胞周期，不进行增殖，需要适当刺激方可重新进入细胞周期，如肝和肾细胞等。G0期细胞在遭遇损伤
或应激等刺激后可返回细胞周期，进行细胞增殖，这种更新称为条件性更新 (conditional renewing)。
(3)终端分化细胞：也称不分裂细胞。一般情况下这些细胞不可逆地脱离细胞周期、丧失增殖能力并具一定生理功能，如神经细胞和心肌细胞等。但最近有迹象表明这些细胞在特定的条件下可返回细胞周期，并进行增殖。
细胞周期的特点：①单向性：即细胞只能沿G 1→S →G2→M 方向推进而不能逆行；②阶段性：各期细胞形态和代谢特点有明显差异，细胞可因某种原因而在某时相停滞下来，待生长条件适合后细胞又可重新活跃到下一时相；③检查点：各时相交叉处存在着检查点 ( checkpoint )，决定细胞下一步的增殖趋向；④细胞微环境：细胞周期是否顺利推进与细胞外信号和条件等密切相关。
二、细胞周期的调控
在多细胞生物体内，各类细胞周期存在一个非常严密的调控系统，使各类细胞可依机体的需要进行增殖或处于静止状态。细胞周期通过细胞内某些物质的合成、降解或活化来控制，还受细胞内外的各种信号的种类强度和持续时间的影响。
(一) 细胞周期自身调控
细胞周期的运行主要是通过细胞周期素或称周期蛋白(cyclin)随细胞周期不同时相进行合成与降解，通过周期素依赖性激酶(cyclin dependent kinase, CDK) 有序地磷酸化和去磷酸化来调节，同时可由CDK 抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitor, CDI)时相变化，检查点对DNA 损伤及复制和纺锤体组装作出反应加以调控等来实现(图8-1) 。
1．Cyclin ：已发现哺乳动物细胞中至少有8种cyclin ，共14个成员，即cyclinA 、cyclinB1-2、cyclinC 、cyclinD1-3、cyclinE 、cyclinF 、cyclinG1-2、cyclinH 、cyclinI 、cyclinK 和cyclinT1-2。分为三大类，即G 1期、S 期和G2/M期细胞cyclin ，各成员分别在相应期高表达（图8-2）。Cyclin 作为调节亚基，需要与催化亚基CDK 形成复合物，激活相应的CDK 和加强CDK 对特定底物的作用，驱动该期前行（表8-1）。
表8-1哺乳动物细胞主要的 Cyclin-CDK 复合物及其相关蛋白
Cyclins 相关CDKS 细胞周期作用 相关蛋白 底物
A CDK1，CDK2 S ﹢G2→M P107﹢E2F ，P21，PCNA Rb B(B1，B2) CDK1（cdc2） G2→M P21, PCNA Rb D(D1-3) CDK4(2，5，6) G1 Rb,P21,P27,P15-16,PCNA Rb E CDK2 G1﹢G1→S P107﹢E2F ，P21,PCNA Rb H CDK7 G1,S,G2,M - CDK1,4,6
Cyclin 在细胞周期中自始至终是以恒定的速度产生，有丝分裂时消失是因为降解大于合成，在间期时积累是由于合成大于降解。在各类细胞中CDK 表达的分子浓度在细胞周期各阶段是稳定的，由于cyclin 的周期性波动，以致CDK 出现周期性的活性变化。
另外，增殖细胞核抗原周期相关蛋白，它不与CDK 结合，而作为DNA 聚合酶的附属蛋白，促进DNA 聚合酶延伸DNA ，在S 期浓度最高，故常作为S 期标志物之一。
2．CDK ：是一组丝氨酸/苏氨酸(serine/threonine，Ser/Thr)蛋白激酶，各成员有不同程度的同源性，故称CDK 家族，已发现CDK 家族有9个成员CDKl-9。 CDK 激活依赖于与cyclin 的结合和其分子中某些氨基酸残基的磷酸化状态。含催化亚基的CDK 需要cyclin 提供调节亚基才能显示活性，只有cyclin 浓度升高达到阈值时，才能与相应的CDK 结合形成cyclin/CDK复合体，这时CDK 才能被激活；CDK 分子中含有活化部位和抑制部位，只有前者处于磷酸化和后者处于去磷酸化状态，CDK 才显活性。CDK 的活性还受其上游的CDK 活化激酶(CDK-activating kinase, CAK)的影响。CAK 正是通过使CDK 分子中的活化部位的氨基酸残基磷酸化来参与调控CDK 的活性。
CDK 的灭活，除了泛素( ubiquitin)介导的蛋白水解体系外，CDI 也可特异性抑制CDK 的活性(图8-3) 。
3．CDI ：是CDK 的抑制物，分子量较小，哺乳类细胞的CDI 主要包括Ink4 (1nhibitors of kinase4)和Kip(kinase inhibitory protein，Kip) 或称Cip(cdk-interacting
protein1) 或Wafl(wild-type P53 activated fragment1)等。①Ink 是一组CDK4的抑制蛋白，分子量在15 ~ 20KD ，含有一个重复的结构域ankyrin ，可特异性地与CDK4/6结合，防止其与cyclin 再结合或降低cyclin/CDK复合物的稳定性，以抑制其激酶活性。Ink4的成员包括P16Ink4a 、P15 Ink4b、P18 Ink4c 、P19 Ink4d 。其中研究较多的为P16Ink4a ，在S 期达高峰，是G1/S限制点负调控机制的重要组成部分。② Kip 是一组CDK 的抑制蛋白，N 端含有一个保守的80个氨基酸序列，可经非共价键与cyclin/CDK复合物结合，形成三元体或四元体抑制CDK 。Kip 的成员包括P21kipl 、P27kip1和P57kip2，它们在N-末端具有高度的结构和功能相似性，可特异性抑制几种cyclinD/CDK的蛋白酶活性；但其C-末端还具有各不相同的功能区。其中研究得较多的是P21kipl 、P27kip1。P21kipl 是作用较强，作用谱较广的一种CDI 。它主要调控细胞周期确保遗传物质精确地传递给下一代，以消除由于DNA 损伤而引发肿瘤，还参与细胞应激状态的信号转导。调节其合成主要有P53依赖性和P53非依赖性两条途径。P27kip1为停止细胞分裂所必需，在休止细胞内呈高表达，而在增殖细胞内呈低表达。P27kip1与G1后期所形成的cyclinE/CDK2复合物结合，通过C-末端抑制CDK2 (T160 ) 的磷酸化，灭活其活性，阻滞细胞周期。
4．细胞周期检查点：在生物进化过程中，细胞发展出了一套保证细胞周期中DNA 复制和染色体分配质量的检查机制，通常称为细胞周期检查点，这是一类负反馈调节机制。
细胞周期检查点分为三种：①DNA 损伤检查点：位于G/S交界处，如果DNA 受损，则把细胞阻滞在G1期，先进行DNA 修复，然后才能复制；②DNA 复制检查点：位于S/G2交界处，负责检查DNA 复制进度；③纺锤体组装检查点：通过检查有功能的纺锤体形成，管理染色体的正确分配。细胞周期中存在的这些检查点，可对细胞周期中前一事件(如DNA 复制或DNA 完整性和损伤) 作出反应，例如发生细胞周期阻滞，以保证细胞增殖按质完成。因此，细胞周期中某一检查点失灵、检查点的组成部件受损或检查点控制回路的调节障碍与疾病和衰老等密切相关。
检查点由三个部分构成：①探测器：负责检测上一期进展的质量问题；②传感器：将探测器所检获的“出了质量问题” 信号下传，如磷酸激酶传递给效应
器；③效应器：由效应器去中断细胞周期进程并启动修复机制。细胞周期反应CDK 既是细胞周期转折的主要调节因子，也是细胞周期检查点的效应器。因此，细胞周期中某一检查点失灵、检查点的组成部件受损或检查点控制回路的调节障碍与肿瘤和衰老等密切相关。
(二) 细胞外信号对细胞周期的调控
细胞外信号包括细胞因子、激素、基质和营养等，可分为增殖和抑制信号。 增殖信号如大多数肽类生长因子等可促使G0期细胞进入细胞周期。这些因子与细胞膜上的受体结合，启动细胞内的信号转导，促进cyclinD 合成，同时下调CDI 的合成，cyclinD 与相应的CDK 结合，使P105Rb 磷酸化而失去抑制E2F 的作用，游离的E2F 激活DNA 合成基因等，使细胞进入G1期，如丝裂原刺激持续存在，细胞继而进入S 期。而MAPK 若被磷酸化，则可抑制cyclin 降解，使细胞停留在M 期。
抑制信号如转化生长因子β (transforming growth factor-β，TGF-β) 在体内外能广泛抑制正常细胞和肿瘤细胞生长，并使细胞阻滞于G1期。TGF-β对细胞周期的调节是下调cyclin 和CDK 等的表达，主要是在G1期抑制CDK4的表达，同时还诱导P21kip l、P27kip1和P15 Ink4b等CDI 产生。
三、细胞周期调控异常与疾病
细胞周期的调控是细胞在对不同信号进行整合后依靠细胞内的级联反应完成的，其任一环节发生异常则可导致细胞增殖过度或缺陷，同时也常常伴有细胞分化异常。本节主要讨论细胞增殖异常与疾病。
(一) 细胞增殖过度
细胞增殖过度可致疾病如肿瘤、肝肺肾纤维化、前列腺肥大、原发性血小板增多症、家族性红细胞增多症、类风湿关节炎、银屑病、肾小管间质性病变、动脉粥样硬化等，其中研究最为深入的是肿瘤。下面以肿瘤为例，探讨肿瘤细胞恶性增殖与细胞周期调控异常的关系。
1．Cyclin 的异常 肿瘤的发生与cyclin(主要是cyclinD 、E) 过量表达有关。CyclinD(又称为Bcl-1) 是公认的原癌基因产物，同时也是生长因子感受器。研究显示在许多肿瘤中CyclinD1呈过表达，其机制为：①基因扩增：这是cyclinD1
过量表达的主要机制，如在B 细胞淋巴瘤、乳腺癌、胃肠癌及食道癌中，扩增程度可高达16倍以上；②染色体倒位：如在人甲状旁腺肿瘤发生倒位inv(11)(p15：q13) ，使cyclinD1基因受控于bcl-1启动子，D1蛋白伴随甲状旁腺素的大量分泌而大量产生；③染色体易位：如在B 细胞淋巴瘤，由于bcl-1断裂点发生t (11:14)(q13：q32) 易位，使cyclinD1基因易受免疫球蛋白重链基因增强子的影响而大量表达。④其它：CyclinD1在许多肿瘤中发现有扩增，尤其在乳腺癌中基因扩增达15％，而蛋白过表达高达45％，基因的扩增与过表达不成比例，提示除了扩增还可能存在其他导致过表达的机制。
CyclinD1对于正常及某些肿瘤的G1期是至关重要的，业已证明过量表达的cyclinD1可使细胞易被转化，但单独却不足以使原代细胞发生转化，需与其他癌基因协同作用，如与ras 协同作用才能转化大鼠肾细胞或大鼠胚胎成纤维细胞，与myc 协同作用能诱导转基因小鼠发生B 淋巴瘤等。另外cyclinD1本身的升高存在一个阈值，超过此阈值，则细胞反而不会进入S 期。
2. CDK的增多 肿瘤细胞中常见CDK4和CDK6的过表达。其中CDK4可能是TGF －β介导细胞增殖抑制的靶蛋白。用TGF-β处理人角化细胞时可抑制CDK4的mRNA 表达；用TGF -β处理水貂肺上皮细胞(MVILU)时可引起CDK4蛋白的减少。高浓度的CDK4可对抗p15的作用；在诱导细胞分化过程中，常有CDK4表达的下调，而CDK4持续高表达则抑制细胞分化的进行。
3. CDI 表达不足和突变 真核细胞的细胞周期由cyclin 依次激活相应的CDK 所推动。作为CDK 的抑制物，CDI 的变化直接影响CDK 的活性，由此影响细胞周期的进行。CDI 基因是肿瘤抑制基因，在肿瘤中CDI 基因有不同程度的异常，肿瘤细胞呈现CDI 表达不足或突变。
(1) InK4失活： InK4可直接与cyclinD1竞争结合G1期激酶CDK4／CDK6，抑制其对P Rb 的磷酸化作用，使游离的E2F-1与未磷酸化的P105Rb 结合，导致依赖于E2F-1转录的基因不能转录；也可间接地抑制多种生化反应(包括DNA 合成) ，从而抑制细胞周期进展。InK4失活(以缺失为主, 错义突变也较常见) 将导致细胞周期调控紊乱，诱发多种肿瘤。其中研究较多的是p16Ink4a 基因，该基因失活如纯合性缺失、染色体异位、CpG 岛高度甲基化等可与多种肿瘤发生有关，如黑色素瘤、胶质瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌、食管癌、急性白血病、乳腺癌和
直肠癌细胞等。
(2) Kip含量减少：Kip 能抑制多种CDK 的活性，如CDK2/3/4/6等，在细胞分化、细胞周期监控以及肿瘤的发生方面具有极其重要的作用，其中P21kip1、P27kip1的研究较为深入。P21kip1的表达减弱或消失可使抑制细胞增殖的作用减弱，或细胞正常增生转变为过度增生且分化不良，导致肿瘤如肝癌、黑色素瘤和骨肉瘤等的发生。P27kip1的表达降低常与肿瘤发生、分化、分级和预后等有关，P27kip1的表达越低，肿瘤分化越差、分级越高，预后越差。在人类肿瘤中常可以检测到P27kip1的表达降低，如乳腺癌，前列腺癌，肺癌，胃癌，大肠癌，卵巢癌等。
4. 检查点功能障碍 细胞周期主要的检查点是DNA 损伤检查点，分别位于G1/S和G2/M交界处，当它探测到DNA 损伤包括基因组或纺锤体损伤时，就会打断细胞周期进程，正是在检查点的正确调控下，确保细胞周期精确和有序地进行。p53基因是人类肿瘤中突变率最高的基因。在G1/S交界处，P53作为一个DNA 损伤检查点分子，能保证细胞在DNA 损伤后，停顿于G1期，以使在DNA 复制前有充分时间对损伤进行修复。如果DNA 损伤修复失败，P53则过度表达，通过直接激活bax 凋亡基因或下调bcl-2抗凋亡基因表达而诱导凋亡。这样可以消除癌前病变细胞不恰当地进入S 期，否则促进癌症的发生和发展。另外如果P53丢失可使细胞易于产生药物诱导的基因扩增，细胞分裂和降低染色体准确度。正常中心粒的复制开始于G1/S转变期，缺失P53时，一个细胞周期中可产生多个中心粒，最终导致有丝分裂时染色体分离异常，遗传的不稳定性又导致染色体数目和DNA 倍数改变，细胞进一步逃避免疫监视而演变成恶性肿瘤细胞，同时可见肿瘤侵袭性、转移性或化疗抵抗作用等增加。例如Li-Fraumeni 癌症综合征患者很容易在30岁前患各种癌症，就是因为遗传一个突变的p53基因，因而肿瘤高发。
DNA 双链断裂还可在G2/M转变期激活DNA 损伤检查点，阻止细胞进入有丝分裂，以增加修复时间和诱导修复基因转录，完成DNA 断裂损伤的修复。如果失去G2/M检查点的阻滞作用，就会引起染色体端粒附近DNA 序列丢失以及染色体的重排和基因扩增。
(二) 细胞增殖缺陷
增殖缺陷可导致许多疾病，如糖尿病肾病、神经退行性疾病(阿尔茨海默病和帕金森氏病) 和再生障碍性贫血等。糖尿病肾病是糖尿病的慢性肾脏并发症，主要是由于肾小球硬化导致肾功能减退。在糖尿病实验模型中，虽然无G1/S期Cyclin 及CDK2、CDK4的改变，但是研究发现肾小球p27表达增高，如利用p27反义寡核苷酸处理可以促进高糖环境中系膜细胞的增殖。同时研究发现高血糖或糖基化产物促进体内TGF-β1及受体表达，TGF-β1又作用于细胞周期调控蛋白，使pRb 处于低磷酸化状态。总之认为糖尿病肾病与p27过表达和pRb 低磷酸化状态协同作用抑制肾小管上皮细胞、系膜细胞或血管内皮细胞的增殖所致。
此外值得一提的是衰老，衰老是细胞脱离细胞周期并不可逆地丧失增殖能力后进入的一种相对稳定的状态。研究表明衰老细胞中的CDK 及cyclin 均有异常表达，如cyclinD 和cyclinE 的mRNA 水平比休眠细胞高很多倍，但cyclin-CDK 复合物的活性却比休眠细胞低得多；在衰老细胞中缺乏cyclinA 、cyclinB 、CDK4和CDC2的mRNA 及其产物；同时有研究表明衰老细胞中，虽然CDK2总磷酸化水平不变，但cyclinD/E-CDK中的磷酸化水平却下降，从而导致细胞停滞于G1期；另外在衰老细胞中CDI 如P16Ink4、P15Ink4和P21kip1的过表达，能抑制G1期cyclin-CDK 复合物的活性。总之，就目前的研究进展而言，衰老是多因素综合作用的结果。至于在衰老时cyclin 、CDK 和CDI 的异常表达的原因以及其促进衰老的机制尚未阐明。
四、调控细胞周期与疾病的防治
细胞周期及其调控好比一台高度自动化的机器，一经启动就按编好的程序有序地进行。如细胞自动程序、检查机制或信息传递通路等任一环节出现故障，都可使细胞周期失控，导致各种异常。其中最常见的是肿瘤，因此以肿瘤为例探讨调控细胞周期与疾病的防治。
1．合理利用增殖相关信号 EGF作为生长信号在乳腺癌尤其是非激素依赖型乳腺癌的发病机制中有着十分重要的意义。该信号可通过与受体结合激活受体酪氨酸激酶系统，经过Ras 和Akt 等途径激活NF-кβ, 提高CDK2激酶活性和使cyclinD1过表达，促肿瘤细胞的增殖，通过降低EGF 含量或采用抗EGFR 的单抗阻抑EGF 与EGFR 结合可使细胞增殖减弱。另外，当神经细胞受损时，通过输
注外源性神经生长因子可促使神经细胞的修复。
2. 抑制cyclin 或和CDK 的表达和活性 体外内实验证实，向肿瘤细胞注射抗cyclinD1抗体或反义寡核苷酸可在一定程度上抑制肺癌细胞由G1向S 期过渡，并逆转转化细胞的形态。 CDK 抑制剂Flavopiridol 是一种作用谱较广的CDK 抑制剂，在纳摩尔浓度水平可抑制CDK1、CDK2、CDK4和CDK6，从而使细胞停滞于G1/S和G2/M。
3．提高CDI 的表达和活性 CDI 基因是肿瘤抑制基因，在肿瘤中CDI 基因和蛋白有不同程度的异常，如将外源p27转染人星形瘤细胞、乳腺癌和鼻咽癌细胞，能够抑制其生长，逆转恶性表型，减少非整倍体细胞，同时使G2/M细胞增多；如将p21cDNA 转染人甲状腺、脑、肺和直肠癌等多种瘤细胞，可抑制其生长和增强其对化疗的敏感性；如采用TGF-β或cAMP 处理骨髓瘤细胞系、电离辐射处理成纤维细胞瘤或1，25-二羟维生素D3处理Hela 细胞系均可使p27kip1 的表达量明显增加，因此增加CDI 的量和提高CDI 的活性，通过修复缺陷的细胞周期调控机制可达到抑瘤作用。
4. 修复或利用缺陷的细胞周期检查点 在多数的肿瘤中可见p53基因的异常，通过转染野生型p53(wt p53) 修复缺陷的细胞周期检查点，可使肿瘤细胞的恶性表型部分逆转。同时在肿瘤治疗中，尤其是G1/S期和G2/M期DNA 损伤关卡均缺陷的肿瘤，可利用丧失G2/M阻滞作用的特性提高治疗效果。电离辐射可引起含wt p53基因的人类肿瘤细胞G1期和G2期阻滞；含突变型p53(mt p53) 基因的肿瘤细胞则只有G2期阻滞，应用药物如咖啡因缩短瘤细胞G2期则可以增加含mt p53基因的肿瘤细胞放射敏感性。此外大多数肿瘤p53基因是突变的，这些细胞G1/S期和G2/M期DNA 损伤关卡都已丧失，而肿瘤周围正常组织仍含有wt p53，如果同时应用缩短G2期的药物可使常规放化疗能够选择性地杀伤肿瘤细胞而减少对正常组织的不良作用。
第二节 细胞凋亡异常与疾病
一、细胞凋亡的概述
凋亡一词源于希腊文，原意为“花瓣或树叶的枯落”。现认为细胞凋亡 ( apoptosis ) 是指由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过
程，是程序性细胞死亡 ( Programmed cell death，PCD )的形式之一。它是病理学家Kerr 等人在1972年提出的一个不同于坏死的细胞死亡新概念，它们之间在许多方面存在显著差异 ( 见表8-2 ，图8-4) 。
表8-2细胞凋亡与坏死的比较
坏死 凋亡
1. 性质 病理性, 非特异性 生理性或病理性, 特异性
2. 诱导因素 强烈刺激, 随机发生 较弱刺激, 非随机发生
3. 生化特点 被动过程, 无新蛋白合成, 不耗能 主动过程, 有新蛋白合成，耗能
4. 形态变化 细胞肿胀, 细胞结构全面溶解破坏 细胞皱缩, 核固缩，细胞结构完整
5.DNA 电泳 弥散性降解, 电泳呈均一DNA 片状 DNA 片段化, 电泳呈梯状条带
6. 炎症反应 溶酶体破裂, 局部炎症反应 溶酶体相对完整, 局部无炎症反应
7. 凋亡小体 无 有
8. 基因调控 无 有
细胞凋亡过程可分为三个阶段：①诱导期 凋亡相关因素的作用及其启动的相关信号转导，细胞凋亡的相关因素包括诱导性因素(射线、高温、TNF 、细菌和病毒等) 和抑制性因素(IL-2、NGF 、ACTH 等) ；②效应期 相关基因接受死亡信号后按预定程序启动合成执行凋亡所需的各种酶类等，引起核酸内切酶 和caspase 家族的级联反应；③降解期 底物降解如核酸内切酶破坏多种基因，Caspase 导致细胞结构的解体等，引起细胞凋亡。
1. 细胞凋亡的形态学改变
细胞发生凋亡的早期，其表面的微绒毛消失，并与胞外基质或周围细胞分离。随后胞浆脱水，胞膜空泡化 ( blebbing )，细胞体积缩小，出现固缩( condensation )。内质网不断扩张并与胞膜融合，形成膜表面的芽状突起，称为出芽 ( budding )。晚期核质高度浓缩融合成团，染色质集中分布在核膜的边缘，呈新月形或马蹄形分布，称为染色质边集 ( margination )。但线粒体和溶酶体的形态结构变化不大。胞膜皱缩内陷，分割包裹胞浆或和核碎片，形成泡状小体称为凋亡小体( apoptosis ，这是凋亡细胞特征性的形态学改变（见图8-4）。
2．细胞凋亡的生化改变
细胞凋亡过程中可出现各种生化改变如内源性核酸内切酶激活、Caspase 的激活和DNA 的片段化断裂等，其中后者尤为重要。
DNA 的片段化是细胞凋亡主要特征。它是细胞凋亡诱导性因素通过激活内源性核酸内切酶，并攻击核小体之间的连接区以致发生断裂而形成180～200bp 的片段。这些片段在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征性的“梯”状 ( 1adder pattern ) 条带，这是判断凋亡发生的客观指标之一。同时也可见 Caspase 的激活，它是引起细胞凋亡形态学改变的主要原因之一。
二、细胞凋亡的调控
(一) 凋亡信号
1．生理性凋亡信号
(1) 某些激素和细胞因子的直接作用 糖皮质激素是淋巴细胞凋亡的典型信号；甲状腺素在蝌蚪转变为青蛙的器官凋亡性退化中起重要作用；TNF 可诱导多种细胞发生凋亡；某些兴奋性神经递质也能诱导某些神经元凋亡，如谷氨酸可诱导皮质神经元等发生凋亡。
(2) 某些激素和细胞因子的间接作用 细胞增殖需要从其它细胞获得足够的增殖信号，当其缺乏时，自杀基因 ( killer gene ) 可被激活并引发凋亡。如睾丸组织发育不良使睾丸酮不足，可致前列腺上皮细胞发生凋亡；腺垂体分泌的促肾上腺皮质激素不足可促进肾上腺皮质细胞凋亡等。
2．病理性凋亡信号
一般认为能对细胞造成伤害的许多因素都可诱发凋亡，如生物及化学毒素、病毒感染、射线、应激和化疗药等，甚至营养因素的缺乏和过度的功能负荷都能诱导凋亡，如心肌细胞负荷过重导致心肌细胞凋亡。但上述有害因素超过一定的剂量范围时则可直接引起细胞坏死。另外并不是所有的有害因素都引起凋亡，有些反而抑制凋亡，如各种化学促癌物、某些病毒(如EB 病毒、人类乳头状瘤病毒 ) 等。故认为能否诱导细胞凋亡可能与有害因素的种类、强度和持续的时间等相关。病理性凋亡信号可经下列环节诱导细胞凋亡。
(1) 氧化应激的作用 γ射线和紫外线通过辐射直接分解水分子产生羟自由基(OH) ；损伤因素(如感染、毒素等) 通过活化巨噬细胞使活性氧生成增多，并.
通过多种途径诱导凋亡，如启动膜脂质的过氧化使Ca 2+进入细胞增多；活性氧通过对DNA 的损伤，使ADP 核糖转移酶活化促进凋亡；或直接激活某些死亡基因程序等。
(2)死亡受体的激活 死亡受体是一组TNF 受体基因超家族的成员，包括Fas 、TNFR1和死亡受体3-5(death receptors, DR3、4、5) 等。它们是一组膜蛋白，与相应配体(凋亡信号) 结合后即触发凋亡过程。这些配体型凋亡信号可以是生理性的，也可以是病理性的，如Fas 配体、TNF 、DR3-5配体等。
(3)线粒体结构和功能的改变 凋亡早期可见线粒体跨膜电位(△ψm ) 的明显下降，其出现早于凋亡的生化和形态学异常。△ψm 下降的原因可能与线粒体通透性转换孔(permeability transition pore，PTP) 的改变相关， PTP 的异常可影响线粒体膜通透性(permeability transition ，PT) ，导致线粒体的能量代谢障碍等而诱发凋亡。
另外Ca 2+是参与多种蛋白质、磷脂和核酸分解酶的激活因子，特别是核酸内切酶，它是凋亡过程DNA 断裂成片段的执行者。化学毒物、细菌及病毒和氧化应激等通过干扰细胞Ca 2+通道及转运系统引起钙稳态失衡，从而诱导凋亡。
（二）细胞凋亡信号的转导
1．死亡受体介导的凋亡通路 “死亡受体通路”是由胞外TNF 超家族的死亡配体如TNF-ａ、FasL 、TWEAK 和TRAIL 引发的。这些配体和相关的细胞表面死亡受体如Fas 、TNFR 、DR3-5结合，使受体三聚化并活化，三聚化的死亡受体通过DD （death domain ）域募集衔接蛋白如TRADD 和/或FADD 。衔接蛋白通过死亡效应域（death effecter domain, DED）与procaspase-8形成死亡诱导信号复合物（death-inducing signaling complex, DISC）。procaspase-8具有弱的催化活性，在DISC 中局部浓度高，可发生自我剪接并活化，然后释放到胞浆并启动caspase-8的级联反应，激活下游的效应caspase 如caspase-3、6和-7，导致细胞凋亡；活化的caspase-8同时能激活Bcl-2家族的促凋亡因子Bid ( binding interface database) ，形成一种截短的Bid （ truncated Bid, tBid），后者转移到线粒体，破坏线粒体膜的通透性，从而诱导Cyto-C 释放进入胞浆，进而把死亡受体通路和线粒体通路联系起来，有效地扩大了凋亡信号的作用。
目前研究的较多的是Fas 蛋白，Fas 蛋白是细胞膜上的跨膜蛋白，属于TNFR
家族。作为膜受体的Fas 蛋白可与T 淋巴细胞表面的Fas 配体结合，也可与抗Fas 的抗体结合，从而启动细胞凋亡，其相关的信号转导通路为：①Fas 配体或抗Fas 抗体与Fas 蛋白结合，引起神经鞘磷脂酶的活性上升，使神经鞘磷脂分解产生神经酰胺并作为第二信使激活相应的蛋白激酶，从而诱导细胞凋亡；②抗Fas 抗体或TNF 与Fas 蛋白结合后可激活ICE ( 1L-1 β converting enzyme ) 样的caspase ，后者可降解H1组蛋白，使染色体松弛，DNA 链舒展而暴露出核酸内切酶的酶切位点，使DNA 链易被切割；③Fas 蛋白被激活后也可以通过Ca 2﹢信号系统传递死亡信息而导致细胞凋亡。
2．线粒体介导的凋亡通路 线粒体途径是众多细胞凋亡信号转导途径中最重要的途径之一。该通路涉及一个CED-4/CED-3样的“凋亡体”，还需要位于线粒体的促凋亡蛋白的参与，它主要是由死亡受体非依赖的凋亡诱导信号（如射线，化疗药、微生物、细胞因子和生长因子缺乏等）启动的。一般认为氧化应激所致的损伤和钙稳态失衡等可作用于线粒体通透性转换孔，导致线粒体膜通透性的增高，促使线粒体释放凋亡启动因子 (Cyto-C、AIF 、Apaf-1) 、Smac/Diablo ( second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pI ) 和procaspase-3等入胞浆，并通过下列机制导致细胞凋亡：①Cyto-C 在dATP 存在的情况下，与凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)结合，使Apaf-1暴露出CARD 结构域 ( caspase activation and recruitment domain )，并与procaspase-9的CARD 结合形成凋亡的复合体( apoptosome )，导致procaspase-9激活，后者通过级联反应激活下游的procaspase-3、6、7等，这些蛋白酶通过多个途径作用于细胞骨架蛋白、DNA 修复调节因子、细胞周期调节蛋白等，也包括Bcl-2家族的某些成员，导致细胞DNA 修复功能丧失、核酸内切酶激活、DNA 片断化，失去正常功能而凋亡。②AIF 通过促进线粒体释放细胞色素C 而增强凋亡的信号，并可快速激活核酸内切酶；③Smac/Diablo可能通过阻断凋亡抑制蛋白 ( inhibitors of apoptosis protein, IAPs ) 的作用，参与细胞凋亡的调控。IAPs 为一组具有抑制凋亡作用的蛋白，主要抑制caspase-3，7，9而抑制细胞的凋亡。
另有报道提及内质网可以介导凋亡通路，内质网中过多蛋白的积累或钙平衡的破坏，可以引起内质网压力增高导致细胞凋亡。一般情况下凋亡刺激可以激活三种凋亡通路的一种，且以前两种为主。
（三）细胞凋亡的执行
1. caspases
天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶（cystein-containing aspartate-specific
protease ，Caspase ）又称半胱天冬酶是研究得最清楚的细胞凋亡执行者。最先发现caspase 是ICE ，即caspase-1，随后又发现了一系列的caspase ，统称为caspases ，以序号区分（caspase1-14）。
caspase成员都具有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性，通常以酶原形式存在，包括三个结构域即NH2末端结构域、大亚基和小亚基。各结构域之间由天冬氨酸水解酶识别结构分隔。Procaspase 有两个结构特点对其活化至关重要：① NH2末端结构域的序列和长度高度变异，而该结构可能与caspase 所表现的不同功能以及各异的活化机制有关；② 所有procaspase 的各结构域之间具有相同的分割区域，这提示proaspase 可以自身活化或者被具有相同结构特点的酶活化。procaspase 活化时，各结构域之间蛋白连接结构水解，大小亚基结合形成异二聚体。在已知晶体结构的caspase-1和caspase-3活化体中，由异二聚体进一步形成四聚体，当中包含两个催化基团。每个催化结构域中大小亚基紧密相连，共同完成底物结合与催化功能。Caspase 是一种高度特异的蛋白酶，它具有在天冬氨酸之后剪切蛋白的特点。被剪切蛋白质NH2末端至少有四种氨基酸对剪切位置是明确的，这是caspase 具有催化活性的必要保证。对这四种氨基酸的识别在caspase 之间显著不同，导致caspase 成员之间生物功能的差异。但并非所有含有这四种氨基酸结构的蛋白都被活化，这提示caspase 三级结构可能会影响底物识别。
Caspases 可分为启动型caspase( caspase-8～10) 和效应型caspase
(caspase-3、6、7) 两类。以caspase-8为例，凋亡信号与死亡受体Fas 结合后, Fas 的胞内死亡结构域DD 与接头蛋白FADD 结合, 进一步激活caspase-8, 通过自身催化功能, 在局部形成高浓度的启动型caspase, 后者再活化其它效应型caspase, 引起凋亡。
目前已知的caspase 功能有：① 灭活凋亡抑制蛋白 如caspase 激活的脱氧核糖核酸酶 ( caspase-activated deoxyribonuclease, CAD )，正常细胞中CAD 与ICAD 结合不具有催化活性。当发生凋亡时，ICAD 被caspase 灭活并与CAD 分离，此时CAD 即表现出核酸酶活性，使DNA 片段化；同时caspase 可抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2，同
时产生一些可促进凋亡的片断；② 直接作用于细胞结构并使之解体 在核膜下有一层由lamins 物质构成的板层结构，它参与染色质构成。凋亡细胞中lamins 被caspase 裂解，从而使板层结构崩解并导致染色质浓缩；③ 分解与细胞骨架构成相关的蛋白 如PAK2可使细胞结构重组并凋亡；④瓦解核结构成核碎片。
2. 内源性核酸内切酶 正常情况下多种内源性核酸内切酶是以无活性的酶原形式存在胞核内，且多数为Ca 2+/Mg2+依赖的, 但Zn 2+可抑制其活性。凋亡诱导因素可通过启动信号转导，调控胞内某些成分(如Ca 2+) 激活内源性核酸内切酶，活化的内切酶可作用于核小体连接区，使DNA 断裂成核小体倍数大小即180～200bp 的片段。
3. 其它 据报道组织型转谷氨酰胺酶(tissue-type transglutaminase) 与凋亡小体的形成有关, 它通过催化γ谷氨酰与ε赖氨基交联形成稳定的构架, 使内容物保留在凋亡小体内。另外当胞浆Ca 2+增加时, 使定位于胞浆的需钙蛋白酶 ( Calpains )被活化, 参与酶的活化和膜的再塑等凋亡过程
（四）细胞凋亡的基因调控
1. Bcl-2家族 Bcl-2家族的成员是高等动物中生存和死亡信号至关重要的整和因子。该家族可细分成三大类：抗凋亡成员，如Bcl-2和Bcl-XL ，它们能细胞免受凋亡；促凋亡成员，如Bax 和Bak ；以及BH3-only 死亡蛋白。促凋亡和抗凋亡成员间的相互作用定了细胞死亡的阈值。Bcl-2是B 细胞淋巴瘤/白血病2 ( B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2 )基因的缩写形式，它是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因。人的Bcl-2蛋白由229个氨基酸组成，小鼠为236个。应用单克隆抗体定位研究证实，Bcl-2蛋白主要分布在线粒体内膜、细胞膜内表面、内质网和核膜等处。广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种瘤细胞。Bcl-2的高表达能阻抑多种凋亡诱导因素 ( 如:射线、化学药物等 ) 所引发的细胞凋亡，如依赖神经生长因子的神经细胞，当撤除神经生长因子后，细胞会迅速发生凋亡，如果将表达Bcl-2的基因质粒注入细胞中，则可防止神经细胞凋亡。临床研究发现，当淋巴细胞性白血病病人外周淋巴细胞有20％以上呈Bcl-2阳性时，其预后不佳，因为Bcl-2的过高表达，可导致肿瘤细胞对射线和抗癌药物的耐受性增强，不易发生凋亡。
目前认为Bcl-2抗凋亡的主要机制是：① 直接抗氧化；② 抑制线粒体释放
促凋亡的蛋白质，如细胞色素C 和凋亡诱导因子 ( AIF )；③ 抑制促凋亡性调节蛋白Bax 和Bak 的细胞毒作用；④ 抑制凋亡蛋白酶 ( caspases ) 的激活；⑤ 维持细胞钙稳态。
2. P53 野生型P53 ( wtP53 ) 基因具有诱导细胞凋亡的功能。野生型P53基因编码的p53蛋白是一种DNA 结合蛋白，它编码的p53蛋白在细胞周期的G1期发挥检查点 ( checkpoint ) 的功能，负责检查染色体DNA 是否有损伤，一旦发现有缺陷的DNA ，它通过刺激CDI 的表达阻滞细胞周期，并启动DNA 修复；如果修复失败，P53则启动细胞凋亡, 把可能演变为癌的细胞消灭在萌芽状态，因此P53有“分子警察”( Molecular Policeman ) 的美誉。P53突变型则不具有促进细胞凋亡的作用，甚至有报道称P53突变型能驱动细胞周期。
3．其它 C-myc 是一种癌基因。其蛋白具有双向的调节作用。C-myc 蛋白作为重要的转录调节因子，既可激活介导细胞增殖的基因诱导细胞增殖，也可激活介导细胞调亡的基因而诱导凋亡，细胞何去何主要取决于细胞接受何种信号以及细胞所处的生长环境，如在c-myc 基因表达后，如果没有足够的生长因子持续作用细胞就发生凋亡；反之细胞就处于增殖状态。
（五）吞噬细胞对凋亡细胞的识别与吞噬
正在凋亡的细胞以及凋亡小体的最终结局是被邻近的吞噬细胞或正常细胞迅速识别和吞噬，进而被吞噬细胞内的溶酶体酶彻底消灭（见图8-4）。这是机体保持正常生理功能的需要。如果吞噬细胞的内涵物外泄，就会引起炎症反应和次级损伤。同时，如果凋亡细胞的核小体释放出来，还会刺激正常活细胞合成DNA 和免疫球蛋白，这可能是某些系统性红斑狼疮病人血中有核小体DNA 、抗核抗体以及炎性自身抗体产生的原因。
巨噬细胞是“专职”的吞噬凋亡细胞和凋亡小体的细胞群。除此之外，各种肿瘤细胞甚至是正常细胞如上皮细胞也有此功能。体外研究表明，吞噬细胞上至少有3类受体，可对凋亡细胞进行识别。而凋亡细胞上也有相应的死亡标记，表明其“可食性”。
1. 吞噬细胞凝集素(Lectin)的作用 细胞相互作用的机制之一是一个细胞表面的糖类可与另一个细胞表面的凝集素结合，这种结合作用可被凝集素所识别的单糖所抑制。凋亡细胞中细胞表面糖蛋白失去唾液酸侧链时，原来处于隐蔽状态
的N- 乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖和半乳糖等单糖暴露出来，从而可与吞噬细胞表面的植物凝集素结合并发生相互作用。
2. 血小板反应蛋白(TSP)介导吞噬 吞噬细胞分泌的血小板反应蛋白可介导巨噬细胞上的victronectin 受体对凋亡细胞的吞噬。TSP 是一个多功能的三聚体式的并含有RGD 序列的粘附糖蛋白。许多细胞都能分泌TSP ，它与血小板凝集、肿瘤转移、胚胎发生等细胞间和细胞与基质的相互作用有关。TSP 由巨噬细胞合成并分泌入外周血，TSP 结合到 CD36等上在巨噬细胞表面形成粘连复合物，并在巨噬细胞表面和凋亡的中性粒细胞之间形成分子桥，介导巨噬细胞对凋亡细胞的清除。
3．磷脂酰丝氨酸受体的作用 正常血细胞膜上的磷脂是不对称分布，外层为中性磷脂如鞘磷脂与磷脂酰胆碱，内层为磷脂酰丝氨酸(PS)。当细胞凋亡时，这种磷脂的不对称分布被破坏，暴露内层的相关成份，从而导致这些细胞被巨噬细胞上的磷脂酰丝氨酸受体识别和吞噬。
以上介绍了吞噬细胞参与凋亡细胞的识别和吞噬三类分子，对于不同识别机制的选择和在吞噬识别过程中的相互作用了解甚少。在吞噬识别中，一类吞噬细胞中的不同个体可能使用了不同的识别机制，或者不同的吞噬细胞使用了相同的吞噬识别机制。搞清吞噬细胞清除凋亡细胞的机制，通过给药促进特异的吞噬清除功能，具有潜在的医疗价值。
三、细胞凋亡调控异常与疾病
细胞凋亡有重要的生理和病理意义。适度的凋亡具有以下作用：①确保正常生长发育 清除多余和/或失去功能的细胞，在组织器官成熟过程中发挥重要作用，如人胚胎肢芽发育过程中指 ( 趾 ) 间组织，通过细胞凋亡而被逐渐消除，形成指 ( 趾 ) 间隙；②维持内环境稳定 细胞凋亡可清除受损、突变或衰老的细胞，以维持内环境稳态，预防疾病发生或满足生理的需要, 如清除了针对自身抗原的T 淋巴细胞，以维持免疫系统功能的稳定。③发挥积极的防御功能 当感染病毒时，受感染的细胞发生凋亡，使DNA 发生降解，整合于其中的病毒DNA 随之被破坏而阻止了病毒的复制。
因此适度适时的细胞凋亡是维持细胞群体数量稳态的重要手段，如果凋亡失调将影响正常的生长、发育、促进衰老和导致各种疾病。凋亡失调包括细胞凋亡
不足或/和凋亡过度。
(一) 细胞凋亡不足
这类疾病包括肿瘤、病毒感染性疾病、自身免疫病等。其共同特点是细胞凋亡相对不足，细胞群体稳态被破坏，导致病变细胞异常增多, 病变组织器官体积增大，功能异常。
1．细胞凋亡不足与肿瘤
(1) 细胞凋亡不足与肿瘤的发生 目前认为，肿瘤发生与细胞凋亡不足密切相关，主要与下列基因有关：① Bcl-2基因 是细胞凋亡抑制基因，研究表明Bcl-2基因在滤泡性B 细胞淋巴瘤、神经母细胞瘤、白血病、前列腺癌和结肠癌等癌组织中高表达，且与预后不良相关；② P53基因：是目前最受关注的抑癌基因，已有研究表明在多数癌组织中P53基因突变或缺失 ( 如在肺非小细胞肺癌P53基因的突变率为50%以上 ) , 导致细胞凋亡减弱，使肿瘤的发生率明显增加。
(2) 细胞凋亡不足与肿瘤的发展 当发生癌前病变和肿瘤时，细胞增殖与凋亡失衡，使细胞净增长率提高，具体表现为: ① 细胞增殖增强, 细胞凋亡减弱；② 细胞增殖并不增强, 但细胞凋亡显著减弱。临床评估肿瘤的发展和预后等应统筹考虑细胞增殖与凋亡两个方面，但遇到的主要障碍是细胞凋亡很难被准确定量检测，因为凋亡发展快，且不留痕迹。
(3) 细胞凋亡不足与肿瘤的转移 当环境变得不适宜细胞生长时，正常细胞就会发生凋亡。肿瘤细胞尤其是转移性肿瘤细胞失去上述特性，便可移行到远离起源组织的地方定居存活形成转移灶。已知一些癌细胞对生理性刺激诱导的凋亡反应低下；根据瘤细胞的异型性和分化程度, 皮肤基底细胞癌和Bowen 瘤应属高度恶性的肿瘤，但却表现为细胞生长缓慢、侵袭力弱和极少发生转移，研究证实这些组织中的细胞凋亡非常明显。因此推测细胞凋亡降低与肿瘤的浸润和转移相关，但目前尚缺乏有力的证据。
2. 细胞凋亡不足与病毒感染性疾病 病毒感染中，病毒和宿主通过调控细胞凋亡的速率以利于自身生存。宿主利用细胞凋亡介导感染细胞的自杀，而结束病毒的繁殖, 如HIV 感染的CD 4+ 淋巴细胞；而病毒在逃避宿主防御机制时逐渐形成抑制感染细胞凋亡的程序。病毒及其产物抗凋亡的可能机制为：① 灭活p53
p53是G1/S期交界处检查点的主要物质，它可阻止有突变基因组等的细胞进入S 期，并可诱导细胞发生凋亡，如SV40的T 抗原、腺病毒的E1B55kD 蛋白和E1B19kD 蛋白等都可结合p53，并阻断其转录活性；② 高表达Bcl-2或Bcl-2样蛋白 腺病毒E1B 蛋白能直接阻断凋亡, 其基因结构与Bcl-2部分同源。EB 病毒 ( Epstein-Barr Virus，EB ) 的基因BHRF1等基因序列和功能与Bcl-2 有不同程度的类似，可使淋巴细胞时永生化。临床发现EB 病毒与人类Burkitt 淋巴瘤和鼻咽癌等有关。据报道EB 病毒的产物潜伏膜蛋白 ( latent membrane protein,LMP-1 )能特异性地上调Bcl-2，防止B 细胞凋亡; ③ 灭活ICE 痘病毒产生ICE 的抑制物, 如牛痘病毒基因CrmA 产物作为ICE 家族特异性抑制剂可抑制多种刺激诱导的凋亡，这是感染病毒细胞逃避凋亡的机制之一。
3. 细胞凋亡不足与自身免疫病 自身免疫病的特征是自身抗原受到自身抗体或致敏T 淋巴细胞的攻击，造成自身组织器官损伤和破坏。如系统性红斑狼疮、多发性硬化症、胰岛素依赖性糖尿病、慢性甲状腺炎和系膜增殖性肾小球肾炎等。它可能与免疫系统在发育过程中未能将针对自身抗原的免疫细胞以细胞凋亡的方式有效清除相关。
(二) 细胞凋亡过度
这类疾病包括免疫缺陷疾病、心血管疾病和神经元退行性疾病等。其共同特点是细胞凋亡过度，细胞死大于生，细胞群体的稳态被破坏，导致细胞异常减少或组织器官体积变小，功能异常。
1．细胞凋亡过度与AIDS
艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症 ( acquired immunodeficiency syndrome，AIDS )，它是由人类免疫缺陷病毒 ( HIV ) 感染引起的一种传染性疾病，其关键的发病机制是CD 4+淋巴细胞被选择性的破坏，由于CD 4+ 淋巴细胞数显著减少而导致相关免疫功能缺陷。HIV 导致CD 4+ 淋巴细胞凋亡与下列因素有关：
(1) gp120糖蛋白的表达 HIV 感染可刺激宿主细胞膜表达gp 120糖蛋白，gp 120可与表面存在其受体的淋巴细胞的CD 4+分子结合后可触发CD 4+ 淋巴细胞调亡。
(2) 合胞体的形成 受HIV 感染的大部分CD 4+ 淋巴细胞逐步融合形成合胞体（ syncytia ）或多核巨细胞，合胞体在形成过程中或形成后均可发生凋亡而解体。
(3) Fas基因表达的上调 HIV 感染可引起CD 4+ 淋巴细胞的Fas 基因表达上调，使其对Fas 介导的凋亡敏感性升高。
(4) T 细胞的激活 HIV 感染使CD 4+ 淋巴细胞处于激活状态。正常情况下被激活的细胞会迅速发生增殖反应，但在HIV 感染时，被激活的CD 4+ 淋巴细胞不但不增殖，反而发生凋亡。这与HIV 的侵袭引起淋巴细胞生长因子的生成减少有关，即激活的CD 4+淋巴细胞由于处于非生理环境而发生凋亡。
(5) 细胞因子的分泌 受HIV 感染的巨噬细胞分泌TNF 增多，TNF 可通过与TNFR-1 结合启动死亡程序，也可刺激CD 4+ 淋巴细胞产生大量氧自由基而触发细胞凋亡。
(6) Tat蛋白的产生 受HIV 感染的细胞可产生tat 蛋白，这种蛋白可自由通过细胞膜，当Tat 蛋白进入CD 4+ 淋巴细胞后，可诱导细胞产生氧自由基，增强Fas 抗原表达而提高其对细胞凋亡的易感性。
(7) 在HIV 慢性感染阶段，受感染的CD 4+ 淋巴细胞可作为效应细胞诱导未受感染的CD 4+ 淋巴细胞凋亡。这是慢性HIV 感染时CD 4+ 淋巴细胞数量减少的原因。
总之，HIV 感染通过多因素和多途径诱导CD 4+ 淋巴细胞凋亡，使CD 4+ T 淋巴细胞大量减少，它虽然可导致相关免疫功能缺陷，但也具有一定的保护意义，因为凋亡可使宿主细胞的DNA 发生降解，使整合于其中的病毒DNA 被破坏，这样可有效地终止病毒的复制和表达，但细胞凋亡在HIV 感染中的有限的保护作用不足以补偿它对整个免疫系统的打击。因此在积极抗病毒治疗的同时，如何阻止免疫细胞的凋亡是AIDS 病人免疫重建的关键所在。
2．细胞凋亡过度与心脏疾病 心肌缺血或缺血-再灌注损伤和心力衰竭与细胞凋亡有关。近期研究显示心肌细胞损伤不但有坏死，也有凋亡。缺血-再灌注损伤细胞凋亡有如下特点：① 缺血早期以细胞凋亡为主，晚期以细胞坏死为主；② 在梗死灶的中央通常以细胞坏死为主，周边部分以细胞凋亡为主；③ 轻度缺血以细胞凋亡为主，重度缺血通常以细胞坏死为主；④ 在一定时间范围内缺血-再灌注损伤时发生的细胞凋亡比同时间的单纯缺血更严重；⑤ 急性严重的心肌缺血以心肌坏死为主，而慢性轻度的心肌缺血则以细胞凋亡为主。
此类疾病引起细胞凋亡的机制可能与下列因素有关：①体内实验证明，应用
SOD 可显著减少缺血-再灌注引起的心肌细胞凋亡，提示与氧化应激有关；② 缺血或缺氧可引起心肌细胞死亡受体Fas 显著上调，使其可能通过与FasL 反应而导致细胞凋亡；③缺氧可增加P53基因的转录，因此认为缺血所致凋亡可能与P53基因的激活有关。
另外在心力衰竭发生发展过程中出现的许多病理因素，如压力或容量负荷过重、氧化应激、缺血和缺氧等都可诱导心肌细胞凋亡，这提示细胞凋亡可能是心力衰竭发生发展的重要原因之一。如在压力负荷过重引起的心力衰竭动物模型观察到心肌细胞数量减少，研究证实它是细胞凋亡过度所致；同时临床证实心衰病人心肌标本的凋亡指数 ( 即发生凋亡的细胞核数/100个细胞核 ) 可高达35.5％(对照0.2％-0.4％) ；另外研究表明阻断诱导心肌细胞凋亡的信号有助于阻遏凋亡，防止心肌细胞数量的减少。这些说明心力衰竭时心肌细胞数量的减少是因凋亡过度所致。
3. 细胞凋亡与神经退行性疾病 细胞凋亡过度可致阿尔茨海默氏病 ( Alzheimer，s disease， ( Parkinson，s disease，PD) 等。其中AD 的研究最为广泛，AD 又称早老性痴呆，它的发病机制主要是细胞凋亡所致神经元丧失。其发病机制可能与下列因素有关：①Fas 抗原的介导：AD 病人死后大脑组织发现有β-淀粉样物质沉积的老年斑及有许多Fas 阳性细胞(其中主要是星形神经细胞) ，但大多数抗原阳性细胞的胶原纤维酸性蛋白(GFAP)呈阳性，Fas 抗原介导该星形神经细胞凋亡，其机制可能与GFAP 的下调密切相关；②P53基因的活化：在转基因小鼠中观察到沉积β-淀粉样物质的神经元和P53活化的关系，发现伴随神经元核内片段有P53的表达，在AD 病人颞部皮质P53表达量高于正常，这说明了P53活化并参与AD 病人神经胶质细胞凋亡过程；③c-Jun 和c-foc 及其编码蛋白的作用：在培养的海马细胞中加入β-淀粉样物质后可表达Jun 蛋白，其蛋白可诱导海马细胞凋亡，同时发现AD 病人海马细胞c-foc 过度表达，这些说明c-Jun 和c-foc 在AD 的病理过程中发挥重要的作用；④APP695基因突变的作用：β-淀粉样物质的前体是正常的APP695，在AD 病人神经胶质细胞可见APP695的错义突变，后者可能通过细胞膜内侧的G 蛋白介导参与凋亡；⑤低亲和力神经生长因子受体(P75NGFR ) 高表达： P75NGFR 是TNF 家族成员之一。研究显示P75NGFR 在AD 中高度表达，且表达P75NGFR 的神经细胞对β-淀粉样物
质致损的敏感性显著提高，这说明P75NGFR 与神经细胞凋亡有关：⑥NF-κB 的活化：已有研究显示β-淀粉样物质可导致NF-κB 活化，若用抗氧化剂如维生素E ，以清除氧自由基，可阻止该过程。同时研究发现采用钙拮抗剂尼莫地平可抑制胞内游离钙浓度的上升，并阻断细胞凋亡，延缓神经元的死亡，改善AD 的症状。因此推测在AD 中β-淀粉样物质可通过产生活性氧而活化NF-κB ，后者作为一种转录因子直接或间接地参与AD 细胞的凋亡。。
另外还有凋亡不足和过度共存的现象，人类组织器官通常由不同种类的细胞构成如心脏的主要细胞是心肌细胞和心肌间质细胞，血管则以内皮细胞和平滑肌细胞为主。由于细胞类型的差异，在致病因素的作用下，有些细胞表现为凋亡不足，另一些可表现为凋亡过度，因此在同一疾病或病理过程中两种情况也可同时并存。如动脉粥样硬化其内皮细胞凋亡过度，而平滑肌细胞则是凋亡不足。
四、调控细胞凋亡与疾病的防治
调控细胞凋亡的速率可防治各种疾病，目前人们正针对凋亡发生的各个环节探索各种防治方法。
1．合理利用凋亡相关因素 凋亡诱导因素是凋亡的始动环节，人们正尝试将这类因素直接用于治疗一些因细胞凋亡不足或过度而引起的疾病。例如低剂量照射、使用外源性TNF 、高温、激素受体阻断剂和某些生长因子或激素的撤除，也可通过给细胞转染Bcl-2等来调控细胞凋亡。
2．干预凋亡信号转导 Fas/FasL信号系统是重要的凋亡信号转导通路之一，理论上凡能调节和抑制Fas 和FasL 的因素均能用于凋亡有关疾病的治疗，如利用阿霉素刺激肿瘤细胞在其细胞膜上表达Fas/FasL，从而诱导凋亡。另外研究表明调节和抑制线粒体介导的凋亡通路可防止细胞凋亡。如免疫抑制剂环胞霉素A ( cyclosporin A ) 具有阻抑ΔΨm 下降和防止PTP 开放的作用，从而防止细胞凋亡的发生。
3．调节凋亡相关基因 运用分子生物学手段，人为地控制凋亡相关基因的表达以控制凋亡过程，可以达到防治疾病的目的。如利用各种载体将抑癌基因导入肿瘤细胞内，从而诱导肿瘤细胞凋亡。人们可通过反义寡核苷酸特异地与凋亡相关基因互补来抑制相应基因的表达。反义DNA 是人工合成的与靶mRNA 某些
区段互补的DNA 片段，它与靶mRNA 结合形成DNA-mRNA 杂交链，抑制或封闭相应基因的表达。如运用反义Bcl-2寡核苷酸来抑制Bcl-2过表达的B 淋巴细胞癌的生长或提高肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，使肿瘤细胞凋亡明显增多。
4. 控制凋亡相关的酶 核酸内切酶和caspases 是调控细胞凋亡最为关键的酶，若能抑制它们的活性，细胞凋亡过程必然受阻。如Caspase 酶基因转入白血病细胞并使其高表达，可加速白血病细胞发生凋亡；或通过使用 Caspases 抑制剂可明显减少心肌细胞凋亡，从而缩小心肌梗死面积和改善心肌功能。使用含锌药物可抑制内源性核酸内切酶的活性，从而治疗某些与细胞凋亡过度有关的疾病，如AD 和AIDS 等。
(杨惠玲)
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图8-1 细胞周期及调节
图8－3 CDK
的灭活
图8-4 细胞死亡过程的形态学变化