呼吸道感染人腺病毒的分离培养和型别鉴定

第47卷第5期2013年10月哈尔滨医科大学学报

JOUＲNALOF HAＲBINMEDICAL UNIVEＲSITYNo．5Vol．47，

Oct．，2013

385

基础研究

呼吸道感染人腺病毒的分离培养和型别鉴定

1

王瑞琨，商

111211*

蕾，王迎晨，金玉霞，齐桂云，黄冬娟，曲章义

（1．哈尔滨医科大学卫生微生物学教研室；2．哈尔滨医科大学附属第二医院检验科，黑龙江哈尔滨150081）［摘要］目的

从临床呼吸道感染样品中分离人腺病毒毒株并进行型别鉴定。方法

将经免疫荧光

检测确认为人腺病毒感染的痰标本经处理后接种宫颈癌HeLa 细胞进行培养，用空斑试验进行病毒分离用PCＲ法扩增腺病毒六邻体高变区基因，对扩增产物和纯化。从纯化后的毒株中提取DNA 作为模板，

进行核酸序列测定，测序结果运用基本局部比对搜索工具以确定其型别。结果哈尔滨地区呼吸道感染患者痰标本中分离到人3型腺病毒一株。［关键词］腺病毒；呼吸道感染；病毒培养；空斑试验；PCＲ［Ｒ373．1中图分类号］

［A 文献标识码］

［1000－1905（2013）05－0385－03文章编号］

从临床样品中分离到

从

其六邻体基因高变区序列同人3型腺病毒六邻体基因的同源性为100%。结论一株人腺病毒毒株，

Isolation ，culture and identification of human adenovirus causing respiratory

tract infection

WANG Ｒui-kun 1，SHANG Lei 1，WANG Ying-chen 1，JIN Yu-xia 1，QI Gui-yun 2，HUANG Dong-juan 1，QU Zhang-yi 1

（1．Department of Hygienic Microbiology ，Harbin Medical University ；2．Department of Clinical Laboratory ，The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University ，Harbin 150081，Chi-na ）

Abstract ：Objective

To isolate the adenovirus from clinical sample taken from a patient with

One

respiratory tract infection and to identify the type of the isolated adenovirus．Methods

adenovirus positive sample from hospitalized patients with respiratory tract infection was seeded onto HeLa cell．Adenovirus strain was isolated and purified from the virus plaque assay．The hypervarible region of hexon gene was amplified by the extracted viral DNA via polymerase chain reaction （PCＲ）．The PCＲproduct was sequenced and the sequence was subjected align-ment and basic local alignment search tool （BLAST ）searching in GenBank．Ｒesultsadenovirus type 3strain USA /ak34_AdV3a2with 100%homogeneity．Conclusion novirus isolated from a clinical sample is identified as human adenovirus type 3．Key words ：adenovirus ；respiratory infection ；virus culture ；plaque assay ；PCＲ

BLAST The ade-search analysis on Hexon gene showed that the adenovirus strain isolated was identical to human

［收稿日期］2013－04－08

［基金项目］国家自然科学基金资助项目（81172725，30771909）；教

育部博士点专项基金（[1**********]）；黑龙江省自然科学基金重点项目（ZJY0701）

［作者简介］王瑞琨（1984－），男，山东聊城人，硕士。*通讯作者：

E-mail ：qurainbow@126．com

386

哈尔滨医科大学学报第47卷

人腺病毒（human adenovirus ，HAdV ）是一群无A G 包膜的双链DNA 病毒，分为1 67个基因型，7个种［1］，人腺病毒严重威胁人类健康，感染人可导致多种疾病，包括急性上、下呼吸道感染、暴发性眼病毒性胃肠炎、移植免疫缺陷疾病、急性出结膜炎、

血性膀胱炎、脑炎及肥胖症等

［2］

继续传代，连传3代，收获病毒液。病毒液，1．2．1．3

空斑试验：准备7瓶细胞生长面积为25

－1

cm 2培养瓶，瓶内为已形成致密细胞层的HeLa 细胞。分别接种病毒浓度为10

、10－2、10－3各两瓶，

一瓶阴性对照（用同体积病毒生长液代替）。每瓶0．5mL ，摇匀，使其布满细胞层；37ħ 吸附1h ；间隔15min 摇动1次，使其充分吸附；加覆盖胶，每瓶5mL ，5%室温下凝固，然后细胞面朝上，置37ħ ，CO 2浓度的培养箱中培养5d 后，加入含中性红溶液（0．1%）的琼脂糖凝胶3mL ，过夜。次日观察空斑形成情况。1．2．1．4

病毒纯化：用弯头毛细吸管挑取大小不同

的单个空斑，分别溶解于1mL 培养液中，混匀，全部接种到6孔培养板的孔中，同时加入细胞悬液进行病毒扩增。细胞病变（CPE ）明显的病毒进行再一次空斑试验，共进行3次空斑挑取实验得到纯化病毒。1．2．2

病毒DNA 提取：选取CPE 最明显的病毒消

10s 离心，步骤按照上海华瞬小量化后9000r /min，

组织/细胞基因组DNA 提取试剂盒说明书操作。1．2．3

PCＲ扩增特异序列：腺病毒六邻体基因序

上游引物（5' 到3' ）：CAGCCAGAGCCT-列引物，

CAAGTT ，下游引物（5' 到3' ）：ATCCCTGAAGC-CAATGTAA ，预计扩增片段长度405bp 。PCＲ反应94ħ 变性1min ，59ħ 退条件：94ħ 预变性5min ，

72ħ 延伸1min ，5火1min ，循环32次后72ħ ，min 。PCＲ产物经1%琼脂糖凝胶电泳后置于凝胶成像系统中观察结果。每次PCＲ扩增均以腺病毒3型标准毒株为阳性对照，以ddH 2O 为阴性对照。1．2．4

PCＲ产物测序：委托北京六合华大基因科

技股份有限公司对PCＲ产物进行序列测定。22．1

结果

病毒的分离与纯化

腺病毒阳性标本接种HeLa 细胞后第3d 出现细胞病变。正常HeLa 细胞对照组培养液清澈，细胞为多边形、多角形，呈上皮形，胞浆清楚（图1A ）。病毒感染组细胞变圆，成团，从瓶壁上脱落后如葡萄6d 后状（图1B ）。细胞层接种病毒后加琼脂覆盖，出现空斑。空斑呈圆形，直径大小在1mm 到3mm 不等（图2）。2．2

DNA 提取及PCＲ扩增

在紫外灯下观察到大小约400bp 的条带，结果与预期产物的大小相符（图3）。

。呼吸道病毒感染

［3］

通常是非特异性的，诊治难度较大4. 1%［4］。

。在儿童急性

下呼吸道感染患者中腺病毒感染阳性率可高达

本实验室对哈尔滨地区常见呼吸道病毒的感染情况进行长期监测，从2008年至今一直在进行临床分离培养和型别鉴定呼吸道感染样品的病毒检测、

工作。2009年8月 2010年10月共检测哈尔滨医科大学附属第二医院呼吸科住院患者样品521例，74例病毒检测阳性，其中6例阳性样品初步确认为腺病毒感染

［5］

。本实验室已经对其中一例腺病毒

［3］

阳性样品（样品号237）进行了病毒分离并确定了病毒型别属于人腺病毒7型其型别。11．11．1．1

材料与方法材料

标本来源：哈尔滨医科大学附属第二医院呼

。而本研究则对另一例

腺病毒阳性样品（样品号306）进行分离鉴定，确定

吸科呼吸道感染住院患者1例检测为腺病毒阳性的痰标本。1．1．2

试剂：小量组织/细胞基因组DNA 提取试剂

1kb 购自上海华舜公司；高保真DNA 聚合酶、盒，

DNA Marker 购自上海捷瑞生物工程有限公司、高纯度dNTP mix ；PCＲ引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；6ˑ safe Buffer （Hai Gene ）；宫颈癌HeLa 细1640（Hyclone 公胞（本实验室保存）；胎牛血清、司）；其他试剂为国产分析纯。1．21．2．11．2．1．1生长。1．2．1．2

病毒培养：用PBS 清洗生长状态良好的

HeLa 细胞，加1mL 处理好的腺病毒阳性痰样品溶37ħ 吸附1 2h （间隔15min 摇晃液至细胞瓶中，

一次），加入2mL 病毒生长液后放37ħ 培养箱培养。每日观察细胞病变情况。病变状态明显后收集

方法

病毒分离和纯化

宫颈癌HeLa 细胞培养：生长良好的HeLa

细胞进行传代，置于CO 2培养箱至75% 90%成片

第5期王瑞琨，等．呼吸道感染人腺病毒的分离培养和型别鉴定

387

5型和7型岁以下儿童急性肺炎，以人腺病毒3型、也最为严重感染最为常见，

［11］

。本实验室前期的工

［3］

作曾成功分离出一株7型腺病毒，其样本来源也是哈尔滨当地医院临床呼吸道感染患者

，而本次分

表明3型和7型人腺病毒离到的为3型人腺病毒，

感染在哈尔滨地区均存在，但目前哈尔滨地区其他型别的腺病毒感染未见报道。哈尔滨地区呼吸道病毒感染中究竟是以人3型腺病毒还是人7型腺病毒是否还有其他的型别未被检出，这还需要进行为主，

图3

增产物

腺病毒六邻体蛋白基因的PCＲ扩增产物

更多的检测和鉴定工作。另外，人3型腺病毒多以感染小儿为主，引起小儿急性肺炎，而本实验室的标本大部分采集于成人，人3型腺病毒感染是否有向需要进一步的病原学调查研究。成人扩大化的趋势，

(本文图1 2见封4页)

［参考文献］

［1］Harrach B ，Benko M ，Both GW ，et al ．Family Adenoviridae．In ：

Andrew MQ ，Michael JA ，Eric BC ，et al．（eds ）Virus Taxono-my ：Classification and Nomenclature of Viruses Ninth Ｒeportof the International Committee on Taxonomy of Viruses ［M ］．San Di-ego ：Elsevier ，2011：125-141．

［2］杨力明，曲章义，侯勇，等．人3型腺病毒六邻体基因重组表达

．哈尔滨医科大学学报，2004，38（3）：质粒的构建及表达［J ］218-220．

［3］宁莉莉，孙颖，齐桂云，等．呼吸道感染人腺病毒的分离及鉴定

［J ］．哈尔滨医科大学学报，2012，46（4）：329-331．

［4］Zhang HY ，Li ZM ，Zhang GL ，et al ．Ｒespiratoryviruses in hospi-talized children with acute lower respiratory tract infections in har-bin ，China ［J ］．Jpn J Infect Dis ，2009，62（6）：458-460．［5］黄冬娟，孙颖，齐桂云，等．哈尔滨地区住院患者呼吸道毒病感

J ］．哈尔滨医科大学学报，2012，46（2）：124-染的病原学研究［127．

［6］ＲeddyVS ，Natchiar SK ，Stewart PL ，et al ．Crystal structure of

human adenovirus at 3．5A resolution ［J ］．Science ，2010，329（5995）：1071-1075．

［7］王鹏，曲章义，张鸿彦，等．人腺病毒六邻体蛋白保守区抗原性

2007，30（3）：135-138．分析［J ］．国际免疫学杂志，［8］

Yuan XH ，Wang YC ，Jin WJ ，et al ．Structure-based high-throughput epitope analysis of hexon proteins in B and C species human adenoviruses （HAdVs ）［J ］．PloS one ，2012，7（3）：e32938．

［9］袁晓辉，曲章义，吴晓敏，等．人3型腺病毒六邻体蛋白同源建

．高等学校化学学报，2009，30（8）：模及其进化轨迹分析［J ］1636-1640．

［10］郑红霞，刘勇，曲章义，等．重组人3型腺病毒六邻体蛋白纯

2005，39（6）：化和抗原性检测［J ］．哈尔滨医科大学学报，471-473．

［11］侯勇，刘佳，郭彩铃，等．人腺病毒3型六邻体基因的克隆与

J ］．中国地方病学杂志，2003，22（3）：245-247．鉴定［

M ：Marker ；1：阴性对照；2：腺病毒阳性对照；3：样本DNA 模版扩

2．3PCＲ产物的核苷酸序列测定及BLAST 分析

该段核酸序列长度为402bp 。BLAST 分析表

明该序列同人3型腺病毒USA /ak34_AdV3a2毒株同源性100%，表明该序列属于人腺病毒3型的六邻体基因。3

讨论

人腺病毒衣壳（Capsid ）为二十面体结构，共由252个壳粒组成，其中240个壳粒为六邻体（Hex-12个为五邻体［6］。腺病毒六邻体蛋白含有型、on ），

组和亚组抗原决定簇，在腺病毒感染中起重要作用，是病毒的主要中和抗原。蛋白氨基酸变化区主

L2和L4区，要在L1、而腺病毒六邻体中99%以上的变异主要集中在于7个高变区HVＲs中，所以腺

病毒型特异性和种特异性定位于这些区域。不同型别的人腺病毒基因序列在保守区的差异较小，而在高变区的差异比较大，所以仅测定腺病毒基因序列但是不能进行保守区能够确认样品中存在腺病毒，分型，测定人腺病毒六邻体蛋白高变区序列则有助于确定分离到的毒株型别。扩增并测定六邻体基因高变区的核酸序列，再通过对测序结果的比对分析就能够确定该腺病毒的型别

［8-10］［7］

。本研究扩增了人

腺病毒的六邻体基因高变区的序列并对扩增产物进行了测定，随后的序列比对结果表明分离的病毒的六邻体序列与腺病毒3型USA /ak34_AdV3a2/2008株的六邻体基因（AFQ34388）同源性为100%，与2006年美国华盛顿海军研究实验室测定的人3型腺病毒参考毒株GB 株六邻体基因（AAW33168）同源性为99．5%，提示分离到的毒株属于人3型腺病毒。

人腺病毒通过呼吸道和消化道感染人体可引起急性腺病毒肺炎、急性胃肠炎、眼角膜炎和急性间质性肾炎等。对免疫缺陷的儿童危害严重，易引起3

第47卷第5期2013年10月哈尔滨医科大学学报

JOUＲNALOF HAＲBINMEDICAL UNIVEＲSITYNo．5Vol．47，

Oct．，2013

385

基础研究

呼吸道感染人腺病毒的分离培养和型别鉴定

1

王瑞琨，商

111211*

蕾，王迎晨，金玉霞，齐桂云，黄冬娟，曲章义

（1．哈尔滨医科大学卫生微生物学教研室；2．哈尔滨医科大学附属第二医院检验科，黑龙江哈尔滨150081）［摘要］目的

从临床呼吸道感染样品中分离人腺病毒毒株并进行型别鉴定。方法

将经免疫荧光

检测确认为人腺病毒感染的痰标本经处理后接种宫颈癌HeLa 细胞进行培养，用空斑试验进行病毒分离用PCＲ法扩增腺病毒六邻体高变区基因，对扩增产物和纯化。从纯化后的毒株中提取DNA 作为模板，

进行核酸序列测定，测序结果运用基本局部比对搜索工具以确定其型别。结果哈尔滨地区呼吸道感染患者痰标本中分离到人3型腺病毒一株。［关键词］腺病毒；呼吸道感染；病毒培养；空斑试验；PCＲ［Ｒ373．1中图分类号］

［A 文献标识码］

［1000－1905（2013）05－0385－03文章编号］

从临床样品中分离到

从

其六邻体基因高变区序列同人3型腺病毒六邻体基因的同源性为100%。结论一株人腺病毒毒株，

Isolation ，culture and identification of human adenovirus causing respiratory

tract infection

WANG Ｒui-kun 1，SHANG Lei 1，WANG Ying-chen 1，JIN Yu-xia 1，QI Gui-yun 2，HUANG Dong-juan 1，QU Zhang-yi 1

（1．Department of Hygienic Microbiology ，Harbin Medical University ；2．Department of Clinical Laboratory ，The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University ，Harbin 150081，Chi-na ）

Abstract ：Objective

To isolate the adenovirus from clinical sample taken from a patient with

One

respiratory tract infection and to identify the type of the isolated adenovirus．Methods

adenovirus positive sample from hospitalized patients with respiratory tract infection was seeded onto HeLa cell．Adenovirus strain was isolated and purified from the virus plaque assay．The hypervarible region of hexon gene was amplified by the extracted viral DNA via polymerase chain reaction （PCＲ）．The PCＲproduct was sequenced and the sequence was subjected align-ment and basic local alignment search tool （BLAST ）searching in GenBank．Ｒesultsadenovirus type 3strain USA /ak34_AdV3a2with 100%homogeneity．Conclusion novirus isolated from a clinical sample is identified as human adenovirus type 3．Key words ：adenovirus ；respiratory infection ；virus culture ；plaque assay ；PCＲ

BLAST The ade-search analysis on Hexon gene showed that the adenovirus strain isolated was identical to human

［收稿日期］2013－04－08

［基金项目］国家自然科学基金资助项目（81172725，30771909）；教

育部博士点专项基金（[1**********]）；黑龙江省自然科学基金重点项目（ZJY0701）

［作者简介］王瑞琨（1984－），男，山东聊城人，硕士。*通讯作者：

E-mail ：qurainbow@126．com

386

哈尔滨医科大学学报第47卷

人腺病毒（human adenovirus ，HAdV ）是一群无A G 包膜的双链DNA 病毒，分为1 67个基因型，7个种［1］，人腺病毒严重威胁人类健康，感染人可导致多种疾病，包括急性上、下呼吸道感染、暴发性眼病毒性胃肠炎、移植免疫缺陷疾病、急性出结膜炎、

血性膀胱炎、脑炎及肥胖症等

［2］

继续传代，连传3代，收获病毒液。病毒液，1．2．1．3

空斑试验：准备7瓶细胞生长面积为25

－1

cm 2培养瓶，瓶内为已形成致密细胞层的HeLa 细胞。分别接种病毒浓度为10

、10－2、10－3各两瓶，

一瓶阴性对照（用同体积病毒生长液代替）。每瓶0．5mL ，摇匀，使其布满细胞层；37ħ 吸附1h ；间隔15min 摇动1次，使其充分吸附；加覆盖胶，每瓶5mL ，5%室温下凝固，然后细胞面朝上，置37ħ ，CO 2浓度的培养箱中培养5d 后，加入含中性红溶液（0．1%）的琼脂糖凝胶3mL ，过夜。次日观察空斑形成情况。1．2．1．4

病毒纯化：用弯头毛细吸管挑取大小不同

的单个空斑，分别溶解于1mL 培养液中，混匀，全部接种到6孔培养板的孔中，同时加入细胞悬液进行病毒扩增。细胞病变（CPE ）明显的病毒进行再一次空斑试验，共进行3次空斑挑取实验得到纯化病毒。1．2．2

病毒DNA 提取：选取CPE 最明显的病毒消

10s 离心，步骤按照上海华瞬小量化后9000r /min，

组织/细胞基因组DNA 提取试剂盒说明书操作。1．2．3

PCＲ扩增特异序列：腺病毒六邻体基因序

上游引物（5' 到3' ）：CAGCCAGAGCCT-列引物，

CAAGTT ，下游引物（5' 到3' ）：ATCCCTGAAGC-CAATGTAA ，预计扩增片段长度405bp 。PCＲ反应94ħ 变性1min ，59ħ 退条件：94ħ 预变性5min ，

72ħ 延伸1min ，5火1min ，循环32次后72ħ ，min 。PCＲ产物经1%琼脂糖凝胶电泳后置于凝胶成像系统中观察结果。每次PCＲ扩增均以腺病毒3型标准毒株为阳性对照，以ddH 2O 为阴性对照。1．2．4

PCＲ产物测序：委托北京六合华大基因科

技股份有限公司对PCＲ产物进行序列测定。22．1

结果

病毒的分离与纯化

腺病毒阳性标本接种HeLa 细胞后第3d 出现细胞病变。正常HeLa 细胞对照组培养液清澈，细胞为多边形、多角形，呈上皮形，胞浆清楚（图1A ）。病毒感染组细胞变圆，成团，从瓶壁上脱落后如葡萄6d 后状（图1B ）。细胞层接种病毒后加琼脂覆盖，出现空斑。空斑呈圆形，直径大小在1mm 到3mm 不等（图2）。2．2

DNA 提取及PCＲ扩增

在紫外灯下观察到大小约400bp 的条带，结果与预期产物的大小相符（图3）。

。呼吸道病毒感染

［3］

通常是非特异性的，诊治难度较大4. 1%［4］。

。在儿童急性

下呼吸道感染患者中腺病毒感染阳性率可高达

本实验室对哈尔滨地区常见呼吸道病毒的感染情况进行长期监测，从2008年至今一直在进行临床分离培养和型别鉴定呼吸道感染样品的病毒检测、

工作。2009年8月 2010年10月共检测哈尔滨医科大学附属第二医院呼吸科住院患者样品521例，74例病毒检测阳性，其中6例阳性样品初步确认为腺病毒感染

［5］

。本实验室已经对其中一例腺病毒

［3］

阳性样品（样品号237）进行了病毒分离并确定了病毒型别属于人腺病毒7型其型别。11．11．1．1

材料与方法材料

标本来源：哈尔滨医科大学附属第二医院呼

。而本研究则对另一例

腺病毒阳性样品（样品号306）进行分离鉴定，确定

吸科呼吸道感染住院患者1例检测为腺病毒阳性的痰标本。1．1．2

试剂：小量组织/细胞基因组DNA 提取试剂

1kb 购自上海华舜公司；高保真DNA 聚合酶、盒，

DNA Marker 购自上海捷瑞生物工程有限公司、高纯度dNTP mix ；PCＲ引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；6ˑ safe Buffer （Hai Gene ）；宫颈癌HeLa 细1640（Hyclone 公胞（本实验室保存）；胎牛血清、司）；其他试剂为国产分析纯。1．21．2．11．2．1．1生长。1．2．1．2

病毒培养：用PBS 清洗生长状态良好的

HeLa 细胞，加1mL 处理好的腺病毒阳性痰样品溶37ħ 吸附1 2h （间隔15min 摇晃液至细胞瓶中，

一次），加入2mL 病毒生长液后放37ħ 培养箱培养。每日观察细胞病变情况。病变状态明显后收集

方法

病毒分离和纯化

宫颈癌HeLa 细胞培养：生长良好的HeLa

细胞进行传代，置于CO 2培养箱至75% 90%成片

第5期王瑞琨，等．呼吸道感染人腺病毒的分离培养和型别鉴定

387

5型和7型岁以下儿童急性肺炎，以人腺病毒3型、也最为严重感染最为常见，

［11］

。本实验室前期的工

［3］

作曾成功分离出一株7型腺病毒，其样本来源也是哈尔滨当地医院临床呼吸道感染患者

，而本次分

表明3型和7型人腺病毒离到的为3型人腺病毒，

感染在哈尔滨地区均存在，但目前哈尔滨地区其他型别的腺病毒感染未见报道。哈尔滨地区呼吸道病毒感染中究竟是以人3型腺病毒还是人7型腺病毒是否还有其他的型别未被检出，这还需要进行为主，

图3

增产物

腺病毒六邻体蛋白基因的PCＲ扩增产物

更多的检测和鉴定工作。另外，人3型腺病毒多以感染小儿为主，引起小儿急性肺炎，而本实验室的标本大部分采集于成人，人3型腺病毒感染是否有向需要进一步的病原学调查研究。成人扩大化的趋势，

(本文图1 2见封4页)

［参考文献］

［1］Harrach B ，Benko M ，Both GW ，et al ．Family Adenoviridae．In ：

Andrew MQ ，Michael JA ，Eric BC ，et al．（eds ）Virus Taxono-my ：Classification and Nomenclature of Viruses Ninth Ｒeportof the International Committee on Taxonomy of Viruses ［M ］．San Di-ego ：Elsevier ，2011：125-141．

［2］杨力明，曲章义，侯勇，等．人3型腺病毒六邻体基因重组表达

．哈尔滨医科大学学报，2004，38（3）：质粒的构建及表达［J ］218-220．

［3］宁莉莉，孙颖，齐桂云，等．呼吸道感染人腺病毒的分离及鉴定

［J ］．哈尔滨医科大学学报，2012，46（4）：329-331．

［4］Zhang HY ，Li ZM ，Zhang GL ，et al ．Ｒespiratoryviruses in hospi-talized children with acute lower respiratory tract infections in har-bin ，China ［J ］．Jpn J Infect Dis ，2009，62（6）：458-460．［5］黄冬娟，孙颖，齐桂云，等．哈尔滨地区住院患者呼吸道毒病感

J ］．哈尔滨医科大学学报，2012，46（2）：124-染的病原学研究［127．

［6］ＲeddyVS ，Natchiar SK ，Stewart PL ，et al ．Crystal structure of

human adenovirus at 3．5A resolution ［J ］．Science ，2010，329（5995）：1071-1075．

［7］王鹏，曲章义，张鸿彦，等．人腺病毒六邻体蛋白保守区抗原性

2007，30（3）：135-138．分析［J ］．国际免疫学杂志，［8］

Yuan XH ，Wang YC ，Jin WJ ，et al ．Structure-based high-throughput epitope analysis of hexon proteins in B and C species human adenoviruses （HAdVs ）［J ］．PloS one ，2012，7（3）：e32938．

［9］袁晓辉，曲章义，吴晓敏，等．人3型腺病毒六邻体蛋白同源建

．高等学校化学学报，2009，30（8）：模及其进化轨迹分析［J ］1636-1640．

［10］郑红霞，刘勇，曲章义，等．重组人3型腺病毒六邻体蛋白纯

2005，39（6）：化和抗原性检测［J ］．哈尔滨医科大学学报，471-473．

［11］侯勇，刘佳，郭彩铃，等．人腺病毒3型六邻体基因的克隆与

J ］．中国地方病学杂志，2003，22（3）：245-247．鉴定［

M ：Marker ；1：阴性对照；2：腺病毒阳性对照；3：样本DNA 模版扩

2．3PCＲ产物的核苷酸序列测定及BLAST 分析

该段核酸序列长度为402bp 。BLAST 分析表

明该序列同人3型腺病毒USA /ak34_AdV3a2毒株同源性100%，表明该序列属于人腺病毒3型的六邻体基因。3

讨论

人腺病毒衣壳（Capsid ）为二十面体结构，共由252个壳粒组成，其中240个壳粒为六邻体（Hex-12个为五邻体［6］。腺病毒六邻体蛋白含有型、on ），

组和亚组抗原决定簇，在腺病毒感染中起重要作用，是病毒的主要中和抗原。蛋白氨基酸变化区主

L2和L4区，要在L1、而腺病毒六邻体中99%以上的变异主要集中在于7个高变区HVＲs中，所以腺

病毒型特异性和种特异性定位于这些区域。不同型别的人腺病毒基因序列在保守区的差异较小，而在高变区的差异比较大，所以仅测定腺病毒基因序列但是不能进行保守区能够确认样品中存在腺病毒，分型，测定人腺病毒六邻体蛋白高变区序列则有助于确定分离到的毒株型别。扩增并测定六邻体基因高变区的核酸序列，再通过对测序结果的比对分析就能够确定该腺病毒的型别

［8-10］［7］

。本研究扩增了人

腺病毒的六邻体基因高变区的序列并对扩增产物进行了测定，随后的序列比对结果表明分离的病毒的六邻体序列与腺病毒3型USA /ak34_AdV3a2/2008株的六邻体基因（AFQ34388）同源性为100%，与2006年美国华盛顿海军研究实验室测定的人3型腺病毒参考毒株GB 株六邻体基因（AAW33168）同源性为99．5%，提示分离到的毒株属于人3型腺病毒。

人腺病毒通过呼吸道和消化道感染人体可引起急性腺病毒肺炎、急性胃肠炎、眼角膜炎和急性间质性肾炎等。对免疫缺陷的儿童危害严重，易引起3