中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(6):125～128
单核细胞增生李斯特菌的检测技术
韩 斌 刘战民 高海燕 尹京苑
(上海大学生命科学学院 上海 200444)
3
摘要 单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一类人畜共患的食源性致病菌。近年来其检测技术取得了迅猛的发展,对目前使用的基于培养、免疫学和分子生物学技术的三大类单核细胞增生李斯特菌检测方法进行了综述,同时也对单核细胞增生李斯特菌检测的新策略进行了展望。
关键词 食源性致病菌 单核细胞增生李斯特菌 中图分类号 Q819
单核细胞增生李斯特菌简称“,种李斯特菌:绵羊李斯特菌L.iuanuiiL.innocua,威尔斯李斯特菌L.welshimeri,西尔李斯特菌L.seeligeri,格氏李斯特菌L.grayi,默氏李斯特菌L.murrayi中唯一能引起人类疾病的菌
[1]
溶血实验和动物实验等,鉴定为李斯特菌后进一步进行血清分型。国际上的检测方法大部分都是由USDA2FSIS(theUS
DepartmentofAgriculture2FoodSafetyandInspectionService)、FDA(theFederalDrugAdministration)和NGFIS(theNetherlandsGovernmentFoodInspectionService)的方法发展而来的,根据检测食品样品的不同
。它广泛分布于自然界中,肉类、蛋类、
禽类、海产品、乳制品和蔬菜中均有其存在。它能引起人、畜的李斯特菌病,感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多,特别对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人危害严重
[2]
选用不同的选择性培养基进行增菌培养。
平板培养法灵敏度高,成本低,可以给出定性和定量的结果。但检测过程中,制备培养基、计算菌落数量和鉴定菌落的生化特性都耗时耗力,并且培养方法的成功依赖于样本中细菌的数量和状况、培养基的灵敏度、孵化条件和分离培养基的选择性,不适合当前食品快速检测的需求。因此这类方法趋向与其它方法进行结合,并在自动化和系统化的方向上发展,如生化复合试剂盒APIListeria等的一些快速检测试剂盒也是由此发展而来的。
目前我国常用的检验方法主要有国标法(GB4789.
3021994)和APIListeria法,这两种方法都需要增菌和
。孕妇感染后,如果治疗不当,
[3]
会引发菌血症导致早产、死婴食品中四大致病菌之一。
。国内外对单增李斯
特菌均给予高度重视,WHO将其列为20世纪90年代 根据检测原理,食品中单增李斯特菌的检测方法大致可以分为三类:平板培养法、免疫学方法和分子生物学方法。这三类检测方法各有利弊,并且仍在不断地改进和完善中,建立简便快捷、灵敏度好、特异性高的单增李斯特菌检测技术成为众多研究者的共同期望。
1 平板培养法
平板培养法是检测食源性致病菌的最传统的方法。这种方法采用选择性培养基对目标菌进行增菌培养,然后进行生化鉴定,包括增菌、分离和鉴定三个环节
[4]
分纯。API法较国标法在验证实验方面快速简便,仅需要1天,而国标法则需要3～14天
[5]
。程洁等
[6]
对改
良的FDA法、NGFIS法、SN法(行标法)和国标法4种选择性增菌和分离方法进行比较,结果表明对于人工污染的样品(生猪肉、虾和牛奶),各种增菌方法的检测灵敏度都较高,均能检出样品中
。对于食品中单增李斯特菌的检测主要是将培养
收稿日期:2008202214 修回日期:2008203207
3通讯作者,电子信箱:[email protected]
126
牛奶),则以改良的FDA法更佳。
中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.62008
在自动酶联荧光免疫检测系统(VIDAS)上应用。 Sewell等
4
5[8]
2 免疫学方法
免疫学方法是基于抗体、抗原的天然密切关系,只需少许样品纯化就可以精确检出抗原,不易受基质影响,并且可以提供实时信息。目前已有的检测方法诸如酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、酶联荧光分析法
(ELFA)、同位素标记抗体法(放射免疫)及其它多种方
将自然食品样本中的单增李斯特菌增
菌至10～10cfu/ml后用VIDAS检测,阳性结果检出率为97%,假阴性、假阳性检出率分别为1.9%,3.0%,阳性结果的检出时间从5d减至3d,并且该结果被2个独立的实验室所证明
[4]
。翁文川等
[9]
联用VIDAS法和
APIListeria法,充分利用VIDAS的快速筛选性和APIListeria的最终确定性检验及分类食品中李斯特氏菌
法,如乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散及免疫色谱技术等。这些方法具有操作简便、快速的特点,但共同的缺点是灵敏度低,特异性较差,而且检测反应所需的试剂价格昂贵,目前在国内很少推广。
2.1 酶联免疫吸附剂测定(enzymelinked
immunosorbentassay,ELISA)
属,结果可以检验并判断出李斯特菌属中的所有菌种,鉴定周期从原来的10d缩减至5d,阴性结果的判断也从原来的72h缩减至48h。
3 ,(聚合酶链反应)和DNAmicroarray)等方法都得到了广泛应用。
3.1 PCR检测方法
ELISA的表面并保持其免疫活性,在测定时,,,根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。它有几种不同的衍生方法,包括直接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA。
1992年Bessesen等用淋巴细胞杂交瘤技术制备出能稳定分泌单增李斯特菌特异性克隆抗体的细胞株EM2
7GI,应用该抗体建立的ELISA法能于20～24h内检测出8～10cfu/ml(g),并且对单增李斯特菌具有较高的特异
单增李斯特菌的PCR检测技术是根据特异性检测标记设计引物进行PCR扩增,然后根据检测样品中能否扩增到单增李斯特菌种特异性检测标记作为判断的标准。目前己知的单增李斯特菌的特异性标记为基因组序列中的特异性序列等
[3,10]
[3]
(16S/23S中间的保守区域)
和特异毒力基因序列(hlyA,iap,inlA,inlB和actA)
。
由于传统的PCR方法存在一些缺陷,比如琼脂凝胶的分析费时费力且易受主观因素影响,不能区分样品中死亡的单增李斯特菌等,目前研究者们已对PCR检测技术进行了多种改进。一些研究者将PCR和寡核苷酸探针结合起来,先进行PCR,然后用互补于特异基因的寡核苷酸探针检测PCR产物。Ingianni等
[11]
性
[5]
。Chemboro等用夹心ELISA方法检测单增李斯
[7]
特菌,在纯培养中检测限可达10cfu/ml,检测时间为
30min。两种抗体分别为单增李斯特菌特异性抗体,HRP2抗体,但是只适合于液体食品样品并且成本昂贵。
夹心ELISA方法也被应用于TLVIA(TECRAListeria
VisualImmunoassay)和Listeria2Tek快速检测试剂盒。竞
在不
经过增菌的情况下检测出186种食品中的单增李斯特菌,检测限为50～100cells/g,加入选择性培养基增菌以后检测限可以达到2～10cells/g,检测时间在1～2d。为免除凝胶电泳,有些研究者采用基于荧光能量共振转移(FRET)的PCR,这种方法直接测定PCR反应后的荧光信号来分析DNA产物。Koo等
4
[12]
争ELISA由于不容易受基质影响具有较高的特异性,但由于成本高,灵敏度低,还没有直接用于检测。 ELISA方法的缺点是容易受污染,灵敏度受抗体吸附能力的影响,其主要问题是如何制备高特异性的抗体。目前大多数的抗体主要针对李斯特菌属的细菌,单增李斯特菌种特异性的抗体很少。
2.2 酶联荧光分析法(enzymelinkedfluorescent
assay,ELFA)
用这种方法检
3
测hlyA基因,检测限达到500cfu/ml的纯培养和10～
10cfu/25g的脱脂奶,DNA纯化后的检测时间在2.5h
左右。为了检出的样品中的活菌,RNA可以作为活体的一个标志代替DNA进行检测,而反转录PCR(RT2
PCR)使这一方法成为可能。RT2PCR先将RNA反转
ELFA通过将荧光标记物联结到抗体可以得到更高的灵敏度,同时去除了ELISA过程中的色度反应而缩短了反应时间,该法的缺点是成本较高。目前主要
录成cDNA,再用PCR进行扩增,对其产物的分析可以
2008,28(6)
韩 斌等:单核细胞增生李斯特菌的检测技术
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得出样品中细菌的数量。Klei等用RT2PCR检测接种于牛肉中的活单增李斯特菌个数,经过2h培养增菌,检测限可达3cfu/g。为了可以同时检出多种致病菌,多重PCR应运而生,在同一PCR反应体系中加入两对或两对以上的引物。Bhagwat等
EscherichiacoliO157∶H7。Dunbar等
[13]
[3]
苷酸探针按照一定序列固定在固相支持介质上组成的,并采用荧光标记的方法来提高探针2目标DNA杂交的检测灵敏度。 Sergeev等
[19]
研制了一种能够检测4种弧形杆菌
采用多重PCR
属、6种李斯特菌、16种金黄色葡萄球菌肠毒素和6种产气荚膜梭菌毒素的DNA芯片,其中单增李斯特菌纯培养的检测限为200cfu/g。DNA芯片尽管可以同时检测多种致病菌,但它仍然需要增菌培养和PCR反应以提高检测的灵敏度和特异性。
可以同时检测L.monocytogenes,Staphylococcusaureus和
[14]
采用生物素标
和
记通用引物扩增23SrRNA基因片段,可以同时检出L.
monocytogenes,
E.
coli,
Salmonella
typhimurium
Campylobacterjejuni,在增菌和纯化后检测时间仅需30
～40min,但所需试剂价格十分昂贵。 徐德顺等
[15]
4 展 望
平板培养法、较而,由于PCR测准确性高
(105
对实时荧光定量PCR法、常规PCR法
及细菌培养法检测单增李斯特菌的灵敏度与特异性进行了比较,结果表明实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达19cfu/ml,高于传统PCR且有很高的特异性,诺克李斯特菌等10,。
3.
2 id
2based
amca。而PCR检测技术。目前已报道的单增李斯特菌PCR检测标记有10多种,但是越来越多的研究表明,现有的检测标记都是通过比较繁琐和长时间的研究工作而获得的,其数量少、特异性有限,已成为开发和推广快速检测技术的瓶颈。 迄今,大多数研究者仍沿用这些早期提供的检测标记,并且没有对其进行系统的对比研究,因此在其特异性的描述上说法不一。当然,由于那时致病菌的基因组测序工作尚未完全展开,所以这些检测标记是在没有整个基因组序列信息的情况下经过个别基因的鉴定和免疫分析而获得的,不可能将整个基因组同其它细菌的基因组进行系统地对比分析来确定其特异性。然而,目前已有590种(株)细菌、41种(株)真菌、49种
(株)古细菌和36种(株)类病毒全基因组序列完成测
NASBA是一种恒温的体外扩增方法,它包括3种酶(逆转录酶、核糖核酸酶H和RNA聚合酶T7)和两种目标序列的特异性寡核苷酸引物(其中具有噬菌体
T7的启动子序列),它们共同作用于90min内可以将目
标RNA或DNA序列扩增超过10倍。在该方法中,
mRNA作为靶序列比rRNA或全部RNA更能预测出细
8
胞的生存能力。NASBA技术的主要优势在于:产物积累的速度快(尤其是RNA);不需要专门的设备(如定温循环机)。用NASBA方法扩增RNA对发现具有致病基因表达能力的细菌的检测十分有利,这类细菌会对健康造成直接的危害。 Uyttendaele等
[16]
将16srRNA作为检测目标用于
定工作,整个病原菌的基因图谱也在日益完善,这就为新标记的发掘及与所报道的标记间的对比分析提供了足够的信息资源。Liu等
[20]
禽类、肉蛋和海产品等食品的检测,在NASBA之前进行增菌以后检测限可小于10cfu/25g,与改良的FDA方法结果一致,检测时间只需3d。Blais等
[17]
通过生物信息学和微生物
[21]
将hlyA
基因组相结合的方法在金黄色葡萄球菌中成功地发掘了种特异性分子检测标记,Ou等
在对沙门菌基因组
比较分析的基础上成功地设计多重PCR引物,快速准确地鉴定了甲型副伤寒沙门菌,这种分子检测标记发掘的新策略将有助于单增李斯特菌和其它致病菌分子检测标记的研发。
的mRNA作为扩增目标用于乳制品和蛋粉的检测,检测限可以始终保持500cfu/反应,为了达到用于直接检测的灵敏度,用选择性培养基增菌48h后可使检测限达到0.2cfu/g,正确率为92.6%。Nadal等的作用。
3.3 DNA芯片
[18]
又提出
目标mRNA二级结构在NASBA引物设计上有着重要
参考文献
[1]张晓峰,李爱云,方维焕,等.多重聚合酶链反应鉴别单核细
胞增生李斯特菌的研究.中华检验医学杂志,2003,26(2):
DNA芯片是由许多对目标DNA有特异性的寡核
128
93～95
中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.62008
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AdvanceontheDetectionAssaysofListeriamonocytogenes
HANBin LIUZhan2min GAOHai2yan YINJing2yuan
(DepartmentofLifeSciences,ShanghaiUniversity,Shanghai 200444,China)
Abstract Listeriamonocytogenes(L.monocytogenes)isanimportanthumanfoodbornepathogenresponsible
forlisteriosis.ItisoneofthehottopicsinfoodsafetyareaonhowtodetectL.monocytogenesrapidlyandeffectively.Inrecentyears,itsdetectionassayshavearapiddevelopment.Thepurposeistosummarizetheculture2dependentenrichment,immunoassay2basedandnucleicacid2basedmethodsfordetectionofL.monocytogenesatpresent.Lastly,thereviewintroducedthenewstrategyofdetectionassays.
Keywords Foodbornepathogen Listeriamonocytogenes Detectionassay
中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(6):125～128
单核细胞增生李斯特菌的检测技术
韩 斌 刘战民 高海燕 尹京苑
(上海大学生命科学学院 上海 200444)
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摘要 单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一类人畜共患的食源性致病菌。近年来其检测技术取得了迅猛的发展,对目前使用的基于培养、免疫学和分子生物学技术的三大类单核细胞增生李斯特菌检测方法进行了综述,同时也对单核细胞增生李斯特菌检测的新策略进行了展望。
关键词 食源性致病菌 单核细胞增生李斯特菌 中图分类号 Q819
单核细胞增生李斯特菌简称“,种李斯特菌:绵羊李斯特菌L.iuanuiiL.innocua,威尔斯李斯特菌L.welshimeri,西尔李斯特菌L.seeligeri,格氏李斯特菌L.grayi,默氏李斯特菌L.murrayi中唯一能引起人类疾病的菌
[1]
溶血实验和动物实验等,鉴定为李斯特菌后进一步进行血清分型。国际上的检测方法大部分都是由USDA2FSIS(theUS
DepartmentofAgriculture2FoodSafetyandInspectionService)、FDA(theFederalDrugAdministration)和NGFIS(theNetherlandsGovernmentFoodInspectionService)的方法发展而来的,根据检测食品样品的不同
。它广泛分布于自然界中,肉类、蛋类、
禽类、海产品、乳制品和蔬菜中均有其存在。它能引起人、畜的李斯特菌病,感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多,特别对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人危害严重
[2]
选用不同的选择性培养基进行增菌培养。
平板培养法灵敏度高,成本低,可以给出定性和定量的结果。但检测过程中,制备培养基、计算菌落数量和鉴定菌落的生化特性都耗时耗力,并且培养方法的成功依赖于样本中细菌的数量和状况、培养基的灵敏度、孵化条件和分离培养基的选择性,不适合当前食品快速检测的需求。因此这类方法趋向与其它方法进行结合,并在自动化和系统化的方向上发展,如生化复合试剂盒APIListeria等的一些快速检测试剂盒也是由此发展而来的。
目前我国常用的检验方法主要有国标法(GB4789.
3021994)和APIListeria法,这两种方法都需要增菌和
。孕妇感染后,如果治疗不当,
[3]
会引发菌血症导致早产、死婴食品中四大致病菌之一。
。国内外对单增李斯
特菌均给予高度重视,WHO将其列为20世纪90年代 根据检测原理,食品中单增李斯特菌的检测方法大致可以分为三类:平板培养法、免疫学方法和分子生物学方法。这三类检测方法各有利弊,并且仍在不断地改进和完善中,建立简便快捷、灵敏度好、特异性高的单增李斯特菌检测技术成为众多研究者的共同期望。
1 平板培养法
平板培养法是检测食源性致病菌的最传统的方法。这种方法采用选择性培养基对目标菌进行增菌培养,然后进行生化鉴定,包括增菌、分离和鉴定三个环节
[4]
分纯。API法较国标法在验证实验方面快速简便,仅需要1天,而国标法则需要3～14天
[5]
。程洁等
[6]
对改
良的FDA法、NGFIS法、SN法(行标法)和国标法4种选择性增菌和分离方法进行比较,结果表明对于人工污染的样品(生猪肉、虾和牛奶),各种增菌方法的检测灵敏度都较高,均能检出样品中
。对于食品中单增李斯特菌的检测主要是将培养
收稿日期:2008202214 修回日期:2008203207
3通讯作者,电子信箱:[email protected]
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牛奶),则以改良的FDA法更佳。
中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.62008
在自动酶联荧光免疫检测系统(VIDAS)上应用。 Sewell等
4
5[8]
2 免疫学方法
免疫学方法是基于抗体、抗原的天然密切关系,只需少许样品纯化就可以精确检出抗原,不易受基质影响,并且可以提供实时信息。目前已有的检测方法诸如酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、酶联荧光分析法
(ELFA)、同位素标记抗体法(放射免疫)及其它多种方
将自然食品样本中的单增李斯特菌增
菌至10～10cfu/ml后用VIDAS检测,阳性结果检出率为97%,假阴性、假阳性检出率分别为1.9%,3.0%,阳性结果的检出时间从5d减至3d,并且该结果被2个独立的实验室所证明
[4]
。翁文川等
[9]
联用VIDAS法和
APIListeria法,充分利用VIDAS的快速筛选性和APIListeria的最终确定性检验及分类食品中李斯特氏菌
法,如乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散及免疫色谱技术等。这些方法具有操作简便、快速的特点,但共同的缺点是灵敏度低,特异性较差,而且检测反应所需的试剂价格昂贵,目前在国内很少推广。
2.1 酶联免疫吸附剂测定(enzymelinked
immunosorbentassay,ELISA)
属,结果可以检验并判断出李斯特菌属中的所有菌种,鉴定周期从原来的10d缩减至5d,阴性结果的判断也从原来的72h缩减至48h。
3 ,(聚合酶链反应)和DNAmicroarray)等方法都得到了广泛应用。
3.1 PCR检测方法
ELISA的表面并保持其免疫活性,在测定时,,,根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。它有几种不同的衍生方法,包括直接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA。
1992年Bessesen等用淋巴细胞杂交瘤技术制备出能稳定分泌单增李斯特菌特异性克隆抗体的细胞株EM2
7GI,应用该抗体建立的ELISA法能于20～24h内检测出8～10cfu/ml(g),并且对单增李斯特菌具有较高的特异
单增李斯特菌的PCR检测技术是根据特异性检测标记设计引物进行PCR扩增,然后根据检测样品中能否扩增到单增李斯特菌种特异性检测标记作为判断的标准。目前己知的单增李斯特菌的特异性标记为基因组序列中的特异性序列等
[3,10]
[3]
(16S/23S中间的保守区域)
和特异毒力基因序列(hlyA,iap,inlA,inlB和actA)
。
由于传统的PCR方法存在一些缺陷,比如琼脂凝胶的分析费时费力且易受主观因素影响,不能区分样品中死亡的单增李斯特菌等,目前研究者们已对PCR检测技术进行了多种改进。一些研究者将PCR和寡核苷酸探针结合起来,先进行PCR,然后用互补于特异基因的寡核苷酸探针检测PCR产物。Ingianni等
[11]
性
[5]
。Chemboro等用夹心ELISA方法检测单增李斯
[7]
特菌,在纯培养中检测限可达10cfu/ml,检测时间为
30min。两种抗体分别为单增李斯特菌特异性抗体,HRP2抗体,但是只适合于液体食品样品并且成本昂贵。
夹心ELISA方法也被应用于TLVIA(TECRAListeria
VisualImmunoassay)和Listeria2Tek快速检测试剂盒。竞
在不
经过增菌的情况下检测出186种食品中的单增李斯特菌,检测限为50～100cells/g,加入选择性培养基增菌以后检测限可以达到2～10cells/g,检测时间在1～2d。为免除凝胶电泳,有些研究者采用基于荧光能量共振转移(FRET)的PCR,这种方法直接测定PCR反应后的荧光信号来分析DNA产物。Koo等
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[12]
争ELISA由于不容易受基质影响具有较高的特异性,但由于成本高,灵敏度低,还没有直接用于检测。 ELISA方法的缺点是容易受污染,灵敏度受抗体吸附能力的影响,其主要问题是如何制备高特异性的抗体。目前大多数的抗体主要针对李斯特菌属的细菌,单增李斯特菌种特异性的抗体很少。
2.2 酶联荧光分析法(enzymelinkedfluorescent
assay,ELFA)
用这种方法检
3
测hlyA基因,检测限达到500cfu/ml的纯培养和10～
10cfu/25g的脱脂奶,DNA纯化后的检测时间在2.5h
左右。为了检出的样品中的活菌,RNA可以作为活体的一个标志代替DNA进行检测,而反转录PCR(RT2
PCR)使这一方法成为可能。RT2PCR先将RNA反转
ELFA通过将荧光标记物联结到抗体可以得到更高的灵敏度,同时去除了ELISA过程中的色度反应而缩短了反应时间,该法的缺点是成本较高。目前主要
录成cDNA,再用PCR进行扩增,对其产物的分析可以
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韩 斌等:单核细胞增生李斯特菌的检测技术
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得出样品中细菌的数量。Klei等用RT2PCR检测接种于牛肉中的活单增李斯特菌个数,经过2h培养增菌,检测限可达3cfu/g。为了可以同时检出多种致病菌,多重PCR应运而生,在同一PCR反应体系中加入两对或两对以上的引物。Bhagwat等
EscherichiacoliO157∶H7。Dunbar等
[13]
[3]
苷酸探针按照一定序列固定在固相支持介质上组成的,并采用荧光标记的方法来提高探针2目标DNA杂交的检测灵敏度。 Sergeev等
[19]
研制了一种能够检测4种弧形杆菌
采用多重PCR
属、6种李斯特菌、16种金黄色葡萄球菌肠毒素和6种产气荚膜梭菌毒素的DNA芯片,其中单增李斯特菌纯培养的检测限为200cfu/g。DNA芯片尽管可以同时检测多种致病菌,但它仍然需要增菌培养和PCR反应以提高检测的灵敏度和特异性。
可以同时检测L.monocytogenes,Staphylococcusaureus和
[14]
采用生物素标
和
记通用引物扩增23SrRNA基因片段,可以同时检出L.
monocytogenes,
E.
coli,
Salmonella
typhimurium
Campylobacterjejuni,在增菌和纯化后检测时间仅需30
～40min,但所需试剂价格十分昂贵。 徐德顺等
[15]
4 展 望
平板培养法、较而,由于PCR测准确性高
(105
对实时荧光定量PCR法、常规PCR法
及细菌培养法检测单增李斯特菌的灵敏度与特异性进行了比较,结果表明实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达19cfu/ml,高于传统PCR且有很高的特异性,诺克李斯特菌等10,。
3.
2 id
2based
amca。而PCR检测技术。目前已报道的单增李斯特菌PCR检测标记有10多种,但是越来越多的研究表明,现有的检测标记都是通过比较繁琐和长时间的研究工作而获得的,其数量少、特异性有限,已成为开发和推广快速检测技术的瓶颈。 迄今,大多数研究者仍沿用这些早期提供的检测标记,并且没有对其进行系统的对比研究,因此在其特异性的描述上说法不一。当然,由于那时致病菌的基因组测序工作尚未完全展开,所以这些检测标记是在没有整个基因组序列信息的情况下经过个别基因的鉴定和免疫分析而获得的,不可能将整个基因组同其它细菌的基因组进行系统地对比分析来确定其特异性。然而,目前已有590种(株)细菌、41种(株)真菌、49种
(株)古细菌和36种(株)类病毒全基因组序列完成测
NASBA是一种恒温的体外扩增方法,它包括3种酶(逆转录酶、核糖核酸酶H和RNA聚合酶T7)和两种目标序列的特异性寡核苷酸引物(其中具有噬菌体
T7的启动子序列),它们共同作用于90min内可以将目
标RNA或DNA序列扩增超过10倍。在该方法中,
mRNA作为靶序列比rRNA或全部RNA更能预测出细
8
胞的生存能力。NASBA技术的主要优势在于:产物积累的速度快(尤其是RNA);不需要专门的设备(如定温循环机)。用NASBA方法扩增RNA对发现具有致病基因表达能力的细菌的检测十分有利,这类细菌会对健康造成直接的危害。 Uyttendaele等
[16]
将16srRNA作为检测目标用于
定工作,整个病原菌的基因图谱也在日益完善,这就为新标记的发掘及与所报道的标记间的对比分析提供了足够的信息资源。Liu等
[20]
禽类、肉蛋和海产品等食品的检测,在NASBA之前进行增菌以后检测限可小于10cfu/25g,与改良的FDA方法结果一致,检测时间只需3d。Blais等
[17]
通过生物信息学和微生物
[21]
将hlyA
基因组相结合的方法在金黄色葡萄球菌中成功地发掘了种特异性分子检测标记,Ou等
在对沙门菌基因组
比较分析的基础上成功地设计多重PCR引物,快速准确地鉴定了甲型副伤寒沙门菌,这种分子检测标记发掘的新策略将有助于单增李斯特菌和其它致病菌分子检测标记的研发。
的mRNA作为扩增目标用于乳制品和蛋粉的检测,检测限可以始终保持500cfu/反应,为了达到用于直接检测的灵敏度,用选择性培养基增菌48h后可使检测限达到0.2cfu/g,正确率为92.6%。Nadal等的作用。
3.3 DNA芯片
[18]
又提出
目标mRNA二级结构在NASBA引物设计上有着重要
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HANBin LIUZhan2min GAOHai2yan YINJing2yuan
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Abstract Listeriamonocytogenes(L.monocytogenes)isanimportanthumanfoodbornepathogenresponsible
forlisteriosis.ItisoneofthehottopicsinfoodsafetyareaonhowtodetectL.monocytogenesrapidlyandeffectively.Inrecentyears,itsdetectionassayshavearapiddevelopment.Thepurposeistosummarizetheculture2dependentenrichment,immunoassay2basedandnucleicacid2basedmethodsfordetectionofL.monocytogenesatpresent.Lastly,thereviewintroducedthenewstrategyofdetectionassays.
Keywords Foodbornepathogen Listeriamonocytogenes Detectionassay