高效液相色谱同时检测生物样本中8种单胺类神经递质

第37卷分析化学(FE NX I HUAXUE )  研究报告第3期                        

2009

年3月Chinese Journal of Analytical Che m istry 330~334

高效液相色谱同时检测生物样本中8种单胺类神经递质

赵焕英11,

2 段春礼 范春香 刘琦 张韬 杨慧

2111131(首都医科大学神经科学研究所, 北京市神经再生修复重点实验室, 教育部神经变性病重点实验室, 北京100069) (首都医科大学医学实验与测试中心, 北京100069)

摘 要 建立一种快速、准确测定生物样品中左旋多巴(L 2DOP A ) 、去甲肾上腺素(NE ) 、肾上腺素(E ) 、多巴柯(DOP AC ) 、多巴胺(DA ) 、52羟吲哚乙酸(52H I A A ) 、高香草酸(HVA ) 及52羟色胺(52HT ) 8种递质含量的高效液相色谱2电化学检测方法。使8种物质在25m in 于单一流动相、单流速、单通道检测器情况下达到良好的分离效果。采用ES A MD 2150色谱柱(150mm ×3. 2mm, 3μm ) , 流动相为50mmol/L柠檬酸、50mmol/L无水乙酸钠、0. 5mmol/L12庚烷磺酸钠、0. 5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、5mmol/L三乙胺, pH 3. 5, 在甲醇浓度为5%~10%, 流速0. 3~0. 5mL /min, 柱温为30℃时, 都能使8种物质很好分离, 其中在甲醇浓度8%, 流速0. 4mL /min, 检测到前5种物质线性范围为0. 005~10n mol/L;后3种0. 001~10n mol/L,8种物质相关系数在0. 994~0. 999之间, 检出限在pmol/L水平; 回收率在80. 3%~102. 1%之间, 相对偏差在1. 4%~4. 8%之间。且对样本处理和保存方法进行了探讨。

关键词 单胺类神经递质, 高效液相色谱, 电化学检测

1 引 言

:(NE ) 、肾上腺素(E ) 和多巴胺(DA ) ; 吲哚胺:5′2羟色胺(5, 准确, 对研究这类递质的生理功能、与递质代谢有关疾病如帕金森病(P D ) 的诊断和药物治疗等基础研究及临床诊断具有重要意义[1]。此类物质的测定方法, 国内外均有报道

等[2], 但能用同样的方法一次处理样品同时测定多种神经递质及其代谢产物的方法报道不多。常见的检, 但这些方法样品处理都较复杂, 成本高[4]测方法主要有电化学检测法、生物法、高效液相色谱荧光检测法和毛细管电泳法、气相色谱、放射示踪[2~5], 对仪器设备的要求较高, 而且费时。本实验旨在建立一种简单、快速、回收率高的样品制备方法, 且可在简单配置HP LC 2EC D 仪上同时测定多种单胺类物质及其代谢产物。并应用于小鼠抑郁模型、大鼠P D 模型研究, 脐带干细胞诱导单胺能神经细胞的检测中。2 实验部分

2. 1 仪器与试剂

Coul oche m Ⅲ型色谱仪(美国ES A 公司) , 包括582型色谱泵、5300型电化学检测器、5011型石墨碳电极、参比电极为金属板、手动进样器、Scientific s oft w are Ezchr o m elite 分析软件; 0. 45μm 滤膜及抽滤器(M ill pore ) ; B i ofuge 28RS 高速冷冻离心机(Heraens ) ; AS3120A 超声去气仪(Aut o Science ) ; Soni p rep 150样品超声破碎仪(S ANY O ) ; 0. 2μm G HP 耐酸样品处理器(P ALL ) ; Pellet Pestile 电动匀浆仪(K ontes ) 。

标准品L 2DOP A 、NE 、E 、DOP AC 、DA 、52H I A A 、HVA 、52HT 及甲醇(色谱纯, Sig ma 公司) ; 水为超纯水(M illi 2Q ) 。标准品溶液配置:0. 01%L 2半胱氨酸, 0. 01mol/LHCl O 4, 0. 5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(Na 2E DT A ) 。所配标准品避光冷存, 使用时逐级稀释至所需浓度。

2. 2 样品的提取和净化

将动物快速断头, 取脑, 置于冰上剥离所要组织部位; 称重后加入组织裂解液(0. 01%L 2半胱氨酸, 0. 2mmol/LHCl O 4, 0. 5mmol/LNa 2EDT A ) , 置1. 5mL 离心管中充分匀浆, 然后再超生破碎两次, 离心 2008208226收稿; 2008210208接受

本文系国家重点基础研究发展计划(973No . 2006CB500706) 、国家自然基金项目(No . 30670655) 和北京市教育委员会科技发展计划面上项目(K M[1**********]2)

3E 2mail:[email protected] . com

第3期赵焕英等:高效液相色谱同时检测生物样本中8种单胺类神经递质

  33115m in (14000r/min, 4℃) ; 取上清液置另一离心管中, 重复离心一次, 再次取上清液, -80℃保存。测样品时, 将样品冰上融化后再次离心后过0. 2μm 的耐酸过滤器。然后取20μL 进样。

细胞的处理可选在不同时间收集细胞或培养上清液, 经上述裂解液短暂超声后离心萃取递质。样品经HCl O 4处理后呈强酸性, 有些色谱柱不能耐受强酸性范围, 为了保护色谱柱, 可加入一半样品体积的钾盐沉淀(20mmol/L柠檬酸钾, 300mmol/LK 2HP O 4, 2mmol/LNa 2E DT A ) , 冰预10m in 后离心(同前) , 取上清液再进样。

2. 3 色谱条件

采用ES A MD 2150色谱柱(150mm ×3. 2mm , 2. 0μm ) , 日本资生堂C 18预柱(10mm ×3mm , 3μm ) 。流动相为5%~10%甲醇(色谱纯) , 50mmol/L柠檬酸、50mmol/L无水乙酸钠、0. 5mmol/L12庚烷基磺酸钠、0. 5mmol/LNa 2E DT A 、5mmol/L三乙胺。流速:0. 3~0. 5mL /min, 柱温:30℃, 进样量:20μL, pH:3. 5。

3 结果与讨论

3. 1 色谱条件的选择和优化

单胺的色谱分离多用3种较适宜的缓冲体系:柠檬酸缓冲体系(柠檬酸2乙酸盐、柠檬酸2柠檬酸三

[4~7]钠盐) 、单氯乙酸和磷酸盐缓冲体系, 且以第一种为最佳。50~100mmol/L,浓

度太高易析出结晶导致管线堵塞, 增加洗脱难度; , 50mmol/L;流动相中有机系一般可选乙腈或甲醇, , 。单胺类递质及代谢产物有碱性NE 、E 、DA 、L 2DOP A 、52, 12乙酸钠缓冲液, 并加入适量甲醇, 8种单胺。优化流动相时发现甲醇浓度、离子对浓度、缓冲液pH 值、温度及柱压等色谱分离, 前三者为主要因素。为稳定pH 及防止样品峰拖尾加入5mmol/L三乙胺。在流速恒定情况下, 适度增加甲醇的浓度; 或固定甲醇浓度, 适当增加流速, 都可缩短分离时间, 但都不影响色谱峰的相对位置, 且都对先洗脱的3种物质出峰时间影响不大, 对后5种影响大。通过3%、5%、8%、10%和15%(V /V) 等不同浓度甲醇作对比实验表明, 在流动相中加入5%~10%较适宜。考虑色谱柱较长(150mm ) , 内径小(3. 2mm ) , 柱颗粒小(3μm ) , 及附加的预柱作用, 都会造成柱压高。本实验选择流速为0. 4~0. 6mL /min 。另外作者换成C 18柱(150mm ×4. 6mm , 5μm ) 时, 流速1mL /min, 在8%甲醇流动相中8种物质的分离时间为15m in 。pH 值升高, 碱性神经递质保留时间增加, 而酸性代谢物减少; 加入离子对试剂, 可延长碱性物质的保留时间, 使它们从溶剂峰或相互干扰的其它色谱峰中分离出来, 以改善分离效果。通过实验验证pH 3. 5时, 各种物质可很好地分离, 发现离子对对后5种物质的出峰时间影响也很大, 因加入的离子对非常微量, 称量易不准确, 所以每批配出的流动相测出的递质保留时间会稍有些变化, 但不影响分离度。

8种物质在色谱柱上依次洗脱顺序为:L 2DOP A 、NE 、E 、DOP AC 、DA 、52H I A A 、HVA 和52HT, 流速0. 4mL /min, 8%甲醇浓度时保留时间分别为2. 4、3. 5、4. 8、7. 0、10. 1、13. 0、18. 6和26. 5m in (图1a 浓度依次为1、0. 5、0. 5、0. 5、0. 5、0. 1、0. 2和0. 1n mol/L) ; 流速0. 5mL /min, 10%甲醇浓度时可在21m in 分离完(图1b, 浓度依次比图2中递减1/3) 。

3. 2 线性范围、精密度分析、检出限及回收率

将标准品定量混合并用标准品溶液稀释得到一浓度系列, 取20μL 进样, 对上述系列浓度各测定3次后, 取其峰面积的平均值, 以浓度Y 对峰面积X 回归, 各种物质的线性范围如表1, 相关系数都在01994~0. 999之间。当S /N=3时, 检出限达pmol/L水平。取混合标样, 在含8%甲醇流动相下, 以014mL /min 固定流速连续进样6次, 保留时间RS D 为0. 24%~0. 68%; 峰面积RS D 为0. 08%~0143%, 重现性好。将处理后的1份样品分成5份, 其中1份作本底量, 另外4份分别添加已知量的8种标准液。分别测出8种物质在各样品中的含量, 再根据检测本底量计算出8种物质的回收率及标准偏差。

  332分析化学第37卷

图1 8种物质的标准品在含8%甲醇流动相, 流速0. 4mL /min 时(a ) 和含10%甲醇流动相, 流速0. 5mL /min 时(b ) 的高效液相色谱图Fig . 1 Chr omat ogra m s of eight standard sa mp les at fl ow rate of 0. 4mL /min and 8%methanol (a ) and at fl ow

rate of 0. 5mL /min and 10%methanol (b )

L 2DOP A:L 2D ihydr oxyphenylalanine; NE:Norep inephrine; E:Eoubeogrube; DOP AC:3, 42Hydr oxyphenylacitic acid; DA:

32Hydr oxytyra m ine hydr ochl oride; 52H I A A:52Hydr oxy 232indoleacetic acid; HVA:42Hydr oxy 232methoxyacetic acid; 52HT:

52Hydr oxytrya m ine . 表1 线性关系、相关系数及标准加入回收率

Table 1 L inear equati ons, correlati on coefficients and recoveries of eight monoa m ine neur 物质

Neur otran s m itter

L 2DOP A 线性方程L inear equati on Y =7. 37×10-4Χ-42. 51

Y =5. 55×10Χ+2. 90

Y =4. Y =4. 46Χ-40. 72

Y =6. 37×10-4Χ-44. 21

Y =4. 66×10Χ-3. 74

Y =4. 98×10-4Χ-22. 22

Y =4. 73×10Χ+13. 04-4-444-4相关系数(r ) Correlati on coefficient 0. 0. 99900. 99900. 99940. 99980. 9999L inear () ×-35555111检出限on it 23332. 50. 050. 90. 8(%) 102. 191. 288. 595. 696. 490. 880. 383. 7相对标准偏差RS D (%, n =5) 1. 92. 32. 41. 41. 92. 64. 83. 0NE E DOP AC DA 52H I A A HVA 52HT ×10~10×10-3~10×10-3~10×10-3~10×10-3~10×10-3~10-3-3

3. 3 样品处理条件的选择

由于单胺类神经递质自身的不稳定性, 生物结构的相似性以及样本自身的内源性干扰物影响, 而且其在样品中含量极微, 因此选择有效地样品预处理方法是成功地应用高效液相色谱法测定生物样品中神经递质的关键。氧化铝吸附、液2液萃取和经典的离子交换柱分离至今仍是预处理含这类化合物的生物样本的常用手段。但前两种方法不仅步骤繁多, 且不能完全除去干扰物质

离子交换或Sephadex 柱前处理法, 回收率低[9][8], 而后者采用经典的

[6, 7, 10]。另外, 这些纯化措施都有一定的选择性, 不可能对多种有单胺类递质及其代谢产物同时分离测定。从组织样品提取单胺类递质的蛋白变性剂文献报道

酸性正丁醇、10%三氯乙酸、0. 1mol/LHCl 、0. 1mol/LHCl O 4、0. 2mol/L和0. 4mol/LHCl O 4, 或用两种以上。实验选用0. 05~0. 6mol/LHCl O 4检测递质提取效果, 最终确定0. 2mol/LHCl O 4较为合适。因HCl O 4浓度过高会引起递质氧化分解; 过低又不足沉淀蛋白, 从而会引起后续检测中柱压过高甚至造成色谱柱堵塞。同时添加0. 01%L 2半胱氨酸以减少样品中52H I A A 氧化, 0.

5mmol/LNa 2E DT A 可络合由不同系统带入的金属离子, 减少溶质被氧化破坏的程度。实验中注意操作技巧:(1) 组织匀浆后, 进行适度超声破碎可减少由研磨程度不均引起递质含量的提取差异; (2) 样本离心分两个阶段, 首次4℃离心15m in (14000r/min ) 后, 取样品于新离心管-80℃冻存, 样品中仍会含有一些小的蛋白分子、脂类分子、核酸分子等, 这些物质经盐离子或有机溶剂冷冻孵育后才能沉淀。样品测试前取出融化后再次离心, 几乎所有的大分子都会沉淀下来。这时样品可直接上样。若不冻存也可连续两次离心后, 采用耐酸GHP 0. 2μm 滤器过滤处理也能净化样品。因色谱柱ES A MD 2150是耐强酸柱(pH 范围为1~12) , 故样品可不用钾盐中和直接上样检测, 对于不耐酸色谱柱, 样品可经钾盐沉淀过量酸处理。但实验证实经钾盐处理后, 递质回收率会相应降低。

第3期赵焕英等:

高效液相色谱同时检测生物样本中8种单胺类神经递质  333

3. 4 样品保存时间的确定

文献[11]报道标准品用流动相稀释虽干扰峰小, 但易降解, 而采用HCl O 4稀释有助于样品稳定。本研究经过验证标准品无论用流动相还是用HCl O 4稀释在48h 内都会发生降解, 故实验采用在0. 01mol/LHCl O 4中加入0. 01%L 2半胱氨酸、50mmol/LNa 2EDT A 更有助于标品的稳定, 同时减少了金属离子对检测的干扰。实验证实标准品在48h 之内, 峰面积RS D%

实验对样品的保存及降解情况作了统计, 制备的样品在48h 之内无论存放4℃还是-80℃, 其递质含量变化不大, 72h 后递质变化有统计意义。因此制备好的样品在3d 内检测比较准确。

3. 5 样品测定实例结果图

将以上建立的测试方法, 应用在S D 大鼠P D 模型、快速老化小鼠(S AMP8) P D 模型及培养的细胞、血液和透析液的检测中, 峰型都很稳定, 几乎无杂质干扰峰。如图2a 从给予生理盐水S AMP8小鼠的纹体中提取各递质分析结果; 图2b 从给予62羟多巴处理的S AMP8P D 模型小鼠的纹体中提取各递质分析结果。由检测图可看出, 经改进的样本提取方法能很好地去除蛋白, 几乎没有干扰峰的出现, 且基线分

[5, 8]离好。而现有文献大多没有能同时检测这8种递质, 最多检测到7种, 而且组织检测图或基线分离

[7][5]不好, 或杂质峰多, 文献[8, 11]测试方法中进样杂峰太多, 使得出峰在前的、E 检测不到, 而大

[6]多同时检测多种物质时需用多通道检测器, , , 一流动相、单流速

、图2 正常S AM P8小鼠尾壳核(a ) 和S AM P8小鼠尾壳核(b ) 中8种单胺类神经递质色谱图

Fig . 2 Chr omat ogra m of eight monoa m ine neur otrans m itters in dorsal caudate puta men of nor mal

S AMP8mouse (a ) and S AMP8P D mouse (b )

References

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4 Chen Ben 2M ei (陈本美) , Xia L ing 2W ei (夏令伟) , L iang Shao 2Xian (梁绍先) . Chines J. A nal . Che m. (分析化学) , 1999, 27(3) :249~253

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  334分析化学第37

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11 Ruan Guo 2Hong (阮国洪) , Zheng L i 2Xing (郑力行) , W u Q iang 2En (吴强恩) , Zhou Zhi 2Jun (周志俊) . Journal of

Hygiene Research (卫生研究) , 2006, 35(2) :146~149

A M ethod for S i m ult aneous D etecti on of 8K i n ds of M onoam i n e

Neurotran s m itter i n B i olog i ca l Sam ples Usi n g H i gh Perfo mance

L i qu i d Chroma tography w ith Electrochem i ca l D etecti on

ZHAO Huan 2Ying , DUAN Chun 2L i , F AN Chun 2Xiang , L I U Q i , ZHANG Tao , Y ANG Hui

11, 2111131(B eijing Institute for N euroscience, Capital M edical U niversity; B eijing Center for N eural Regeneration and Repair ;

Key L aboratory for N eurodegenerative D isease of the M inistry of Education, B eijing 100069)

2(M edical Experi m ent and Test center , Capital M edical U niversity, B eijing 100069)

Abstract  A si m p le, rap id and sensitive HP LC 2ECD method was t o monoa m ine neur o 2trans m itters and its metabolites, eight neur otrans m itters (L 2DOP A ) , Nor 2ep inephrine (NE ) ; Eoubeogrube (e ) ; 3, 4) ; 32Hydr oxytyra m ine hydr o 2chl oride (DA ) ; 52Hydr 2; 42Hydr oxy 232methoxyacetic acid (HVA ) ; 52Hydr oxytrya m detected under the sa me mobile phase, fl ow rate and mono 2channel detect or in m . analytes were separated on a ES A MD 2150column (150mm ×3. 2mm , 3μm ) . The mobile phase (pH 3. 5) , consisted of methanol 2water phase (containing 50mmol/Lcitric acid, 50mmol/Lanhydr ous s odiu m acetate, 0. 5mmol/L12octanesulfonic acid s odium salt, 0. 5mmol/LNa 2EDT A , 5mmol/LTriethyla m ine, 5%-10%methanol ) the colu mn te mperature was kep t at 30℃. The eight trans m itters can be separated at a fl ow rate of 0. 3-0. 5mL /min using 8%methanol with a fl ow rate of 014mL /min . The first five components were observed be linear over a concentrati on range of 0. 005-10nmol/L,and the foll owed three components 0. 001-10n mol/L.The l ow li m it of detecti on was the level of pmol/L.The correlati on coefficients of these compounds were 0. 994-0. 999, the recoveries were 80. 3%-102. 1%, the RS D s were 1. 42%-4. 85%.The p retreat m ent of sa mp les was als o studied . Keywords  Catechola m ines, high perf or mance liquid chr omat ography, electr oche m ical detecti on

(Received 26August 2008; accep ted 8Oct ober 2008)

“第十二届国际电分析化学会议”的通知

  经中国科学院批准, 并受中国化学会委托, 第十二届国际电分析化学会议由中国科学院长春应用化学研究所电分析化学国家重点实验室承办。会议将于2009年8月12日至15日在长春应用化学研究所举办。会议将特邀国际著名电分析化学家参加, 会议语言为英语。欢迎参加, 如提出报告, 请交电子版英文摘要一份。

论文截止日期:2009年5月15日。

联系人:张柏林 电话/传真:0431-85262430, E mail:[email protected] . jl . cn

地址:吉林省长春市人民大街5625号,  邮编:130022

欢迎登录htt p://isec . ciac . jl . cn 了解会议详细信息

第37卷分析化学(FE NX I HUAXUE )  研究报告第3期                        

2009

年3月Chinese Journal of Analytical Che m istry 330~334

高效液相色谱同时检测生物样本中8种单胺类神经递质

赵焕英11,

2 段春礼 范春香 刘琦 张韬 杨慧

2111131(首都医科大学神经科学研究所, 北京市神经再生修复重点实验室, 教育部神经变性病重点实验室, 北京100069) (首都医科大学医学实验与测试中心, 北京100069)

摘 要 建立一种快速、准确测定生物样品中左旋多巴(L 2DOP A ) 、去甲肾上腺素(NE ) 、肾上腺素(E ) 、多巴柯(DOP AC ) 、多巴胺(DA ) 、52羟吲哚乙酸(52H I A A ) 、高香草酸(HVA ) 及52羟色胺(52HT ) 8种递质含量的高效液相色谱2电化学检测方法。使8种物质在25m in 于单一流动相、单流速、单通道检测器情况下达到良好的分离效果。采用ES A MD 2150色谱柱(150mm ×3. 2mm, 3μm ) , 流动相为50mmol/L柠檬酸、50mmol/L无水乙酸钠、0. 5mmol/L12庚烷磺酸钠、0. 5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、5mmol/L三乙胺, pH 3. 5, 在甲醇浓度为5%~10%, 流速0. 3~0. 5mL /min, 柱温为30℃时, 都能使8种物质很好分离, 其中在甲醇浓度8%, 流速0. 4mL /min, 检测到前5种物质线性范围为0. 005~10n mol/L;后3种0. 001~10n mol/L,8种物质相关系数在0. 994~0. 999之间, 检出限在pmol/L水平; 回收率在80. 3%~102. 1%之间, 相对偏差在1. 4%~4. 8%之间。且对样本处理和保存方法进行了探讨。

关键词 单胺类神经递质, 高效液相色谱, 电化学检测

1 引 言

:(NE ) 、肾上腺素(E ) 和多巴胺(DA ) ; 吲哚胺:5′2羟色胺(5, 准确, 对研究这类递质的生理功能、与递质代谢有关疾病如帕金森病(P D ) 的诊断和药物治疗等基础研究及临床诊断具有重要意义[1]。此类物质的测定方法, 国内外均有报道

等[2], 但能用同样的方法一次处理样品同时测定多种神经递质及其代谢产物的方法报道不多。常见的检, 但这些方法样品处理都较复杂, 成本高[4]测方法主要有电化学检测法、生物法、高效液相色谱荧光检测法和毛细管电泳法、气相色谱、放射示踪[2~5], 对仪器设备的要求较高, 而且费时。本实验旨在建立一种简单、快速、回收率高的样品制备方法, 且可在简单配置HP LC 2EC D 仪上同时测定多种单胺类物质及其代谢产物。并应用于小鼠抑郁模型、大鼠P D 模型研究, 脐带干细胞诱导单胺能神经细胞的检测中。2 实验部分

2. 1 仪器与试剂

Coul oche m Ⅲ型色谱仪(美国ES A 公司) , 包括582型色谱泵、5300型电化学检测器、5011型石墨碳电极、参比电极为金属板、手动进样器、Scientific s oft w are Ezchr o m elite 分析软件; 0. 45μm 滤膜及抽滤器(M ill pore ) ; B i ofuge 28RS 高速冷冻离心机(Heraens ) ; AS3120A 超声去气仪(Aut o Science ) ; Soni p rep 150样品超声破碎仪(S ANY O ) ; 0. 2μm G HP 耐酸样品处理器(P ALL ) ; Pellet Pestile 电动匀浆仪(K ontes ) 。

标准品L 2DOP A 、NE 、E 、DOP AC 、DA 、52H I A A 、HVA 、52HT 及甲醇(色谱纯, Sig ma 公司) ; 水为超纯水(M illi 2Q ) 。标准品溶液配置:0. 01%L 2半胱氨酸, 0. 01mol/LHCl O 4, 0. 5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(Na 2E DT A ) 。所配标准品避光冷存, 使用时逐级稀释至所需浓度。

2. 2 样品的提取和净化

将动物快速断头, 取脑, 置于冰上剥离所要组织部位; 称重后加入组织裂解液(0. 01%L 2半胱氨酸, 0. 2mmol/LHCl O 4, 0. 5mmol/LNa 2EDT A ) , 置1. 5mL 离心管中充分匀浆, 然后再超生破碎两次, 离心 2008208226收稿; 2008210208接受

本文系国家重点基础研究发展计划(973No . 2006CB500706) 、国家自然基金项目(No . 30670655) 和北京市教育委员会科技发展计划面上项目(K M[1**********]2)

3E 2mail:[email protected] . com

第3期赵焕英等:高效液相色谱同时检测生物样本中8种单胺类神经递质

  33115m in (14000r/min, 4℃) ; 取上清液置另一离心管中, 重复离心一次, 再次取上清液, -80℃保存。测样品时, 将样品冰上融化后再次离心后过0. 2μm 的耐酸过滤器。然后取20μL 进样。

细胞的处理可选在不同时间收集细胞或培养上清液, 经上述裂解液短暂超声后离心萃取递质。样品经HCl O 4处理后呈强酸性, 有些色谱柱不能耐受强酸性范围, 为了保护色谱柱, 可加入一半样品体积的钾盐沉淀(20mmol/L柠檬酸钾, 300mmol/LK 2HP O 4, 2mmol/LNa 2E DT A ) , 冰预10m in 后离心(同前) , 取上清液再进样。

2. 3 色谱条件

采用ES A MD 2150色谱柱(150mm ×3. 2mm , 2. 0μm ) , 日本资生堂C 18预柱(10mm ×3mm , 3μm ) 。流动相为5%~10%甲醇(色谱纯) , 50mmol/L柠檬酸、50mmol/L无水乙酸钠、0. 5mmol/L12庚烷基磺酸钠、0. 5mmol/LNa 2E DT A 、5mmol/L三乙胺。流速:0. 3~0. 5mL /min, 柱温:30℃, 进样量:20μL, pH:3. 5。

3 结果与讨论

3. 1 色谱条件的选择和优化

单胺的色谱分离多用3种较适宜的缓冲体系:柠檬酸缓冲体系(柠檬酸2乙酸盐、柠檬酸2柠檬酸三

[4~7]钠盐) 、单氯乙酸和磷酸盐缓冲体系, 且以第一种为最佳。50~100mmol/L,浓

度太高易析出结晶导致管线堵塞, 增加洗脱难度; , 50mmol/L;流动相中有机系一般可选乙腈或甲醇, , 。单胺类递质及代谢产物有碱性NE 、E 、DA 、L 2DOP A 、52, 12乙酸钠缓冲液, 并加入适量甲醇, 8种单胺。优化流动相时发现甲醇浓度、离子对浓度、缓冲液pH 值、温度及柱压等色谱分离, 前三者为主要因素。为稳定pH 及防止样品峰拖尾加入5mmol/L三乙胺。在流速恒定情况下, 适度增加甲醇的浓度; 或固定甲醇浓度, 适当增加流速, 都可缩短分离时间, 但都不影响色谱峰的相对位置, 且都对先洗脱的3种物质出峰时间影响不大, 对后5种影响大。通过3%、5%、8%、10%和15%(V /V) 等不同浓度甲醇作对比实验表明, 在流动相中加入5%~10%较适宜。考虑色谱柱较长(150mm ) , 内径小(3. 2mm ) , 柱颗粒小(3μm ) , 及附加的预柱作用, 都会造成柱压高。本实验选择流速为0. 4~0. 6mL /min 。另外作者换成C 18柱(150mm ×4. 6mm , 5μm ) 时, 流速1mL /min, 在8%甲醇流动相中8种物质的分离时间为15m in 。pH 值升高, 碱性神经递质保留时间增加, 而酸性代谢物减少; 加入离子对试剂, 可延长碱性物质的保留时间, 使它们从溶剂峰或相互干扰的其它色谱峰中分离出来, 以改善分离效果。通过实验验证pH 3. 5时, 各种物质可很好地分离, 发现离子对对后5种物质的出峰时间影响也很大, 因加入的离子对非常微量, 称量易不准确, 所以每批配出的流动相测出的递质保留时间会稍有些变化, 但不影响分离度。

8种物质在色谱柱上依次洗脱顺序为:L 2DOP A 、NE 、E 、DOP AC 、DA 、52H I A A 、HVA 和52HT, 流速0. 4mL /min, 8%甲醇浓度时保留时间分别为2. 4、3. 5、4. 8、7. 0、10. 1、13. 0、18. 6和26. 5m in (图1a 浓度依次为1、0. 5、0. 5、0. 5、0. 5、0. 1、0. 2和0. 1n mol/L) ; 流速0. 5mL /min, 10%甲醇浓度时可在21m in 分离完(图1b, 浓度依次比图2中递减1/3) 。

3. 2 线性范围、精密度分析、检出限及回收率

将标准品定量混合并用标准品溶液稀释得到一浓度系列, 取20μL 进样, 对上述系列浓度各测定3次后, 取其峰面积的平均值, 以浓度Y 对峰面积X 回归, 各种物质的线性范围如表1, 相关系数都在01994~0. 999之间。当S /N=3时, 检出限达pmol/L水平。取混合标样, 在含8%甲醇流动相下, 以014mL /min 固定流速连续进样6次, 保留时间RS D 为0. 24%~0. 68%; 峰面积RS D 为0. 08%~0143%, 重现性好。将处理后的1份样品分成5份, 其中1份作本底量, 另外4份分别添加已知量的8种标准液。分别测出8种物质在各样品中的含量, 再根据检测本底量计算出8种物质的回收率及标准偏差。

  332分析化学第37卷

图1 8种物质的标准品在含8%甲醇流动相, 流速0. 4mL /min 时(a ) 和含10%甲醇流动相, 流速0. 5mL /min 时(b ) 的高效液相色谱图Fig . 1 Chr omat ogra m s of eight standard sa mp les at fl ow rate of 0. 4mL /min and 8%methanol (a ) and at fl ow

rate of 0. 5mL /min and 10%methanol (b )

L 2DOP A:L 2D ihydr oxyphenylalanine; NE:Norep inephrine; E:Eoubeogrube; DOP AC:3, 42Hydr oxyphenylacitic acid; DA:

32Hydr oxytyra m ine hydr ochl oride; 52H I A A:52Hydr oxy 232indoleacetic acid; HVA:42Hydr oxy 232methoxyacetic acid; 52HT:

52Hydr oxytrya m ine . 表1 线性关系、相关系数及标准加入回收率

Table 1 L inear equati ons, correlati on coefficients and recoveries of eight monoa m ine neur 物质

Neur otran s m itter

L 2DOP A 线性方程L inear equati on Y =7. 37×10-4Χ-42. 51

Y =5. 55×10Χ+2. 90

Y =4. Y =4. 46Χ-40. 72

Y =6. 37×10-4Χ-44. 21

Y =4. 66×10Χ-3. 74

Y =4. 98×10-4Χ-22. 22

Y =4. 73×10Χ+13. 04-4-444-4相关系数(r ) Correlati on coefficient 0. 0. 99900. 99900. 99940. 99980. 9999L inear () ×-35555111检出限on it 23332. 50. 050. 90. 8(%) 102. 191. 288. 595. 696. 490. 880. 383. 7相对标准偏差RS D (%, n =5) 1. 92. 32. 41. 41. 92. 64. 83. 0NE E DOP AC DA 52H I A A HVA 52HT ×10~10×10-3~10×10-3~10×10-3~10×10-3~10×10-3~10-3-3

3. 3 样品处理条件的选择

由于单胺类神经递质自身的不稳定性, 生物结构的相似性以及样本自身的内源性干扰物影响, 而且其在样品中含量极微, 因此选择有效地样品预处理方法是成功地应用高效液相色谱法测定生物样品中神经递质的关键。氧化铝吸附、液2液萃取和经典的离子交换柱分离至今仍是预处理含这类化合物的生物样本的常用手段。但前两种方法不仅步骤繁多, 且不能完全除去干扰物质

离子交换或Sephadex 柱前处理法, 回收率低[9][8], 而后者采用经典的

[6, 7, 10]。另外, 这些纯化措施都有一定的选择性, 不可能对多种有单胺类递质及其代谢产物同时分离测定。从组织样品提取单胺类递质的蛋白变性剂文献报道

酸性正丁醇、10%三氯乙酸、0. 1mol/LHCl 、0. 1mol/LHCl O 4、0. 2mol/L和0. 4mol/LHCl O 4, 或用两种以上。实验选用0. 05~0. 6mol/LHCl O 4检测递质提取效果, 最终确定0. 2mol/LHCl O 4较为合适。因HCl O 4浓度过高会引起递质氧化分解; 过低又不足沉淀蛋白, 从而会引起后续检测中柱压过高甚至造成色谱柱堵塞。同时添加0. 01%L 2半胱氨酸以减少样品中52H I A A 氧化, 0.

5mmol/LNa 2E DT A 可络合由不同系统带入的金属离子, 减少溶质被氧化破坏的程度。实验中注意操作技巧:(1) 组织匀浆后, 进行适度超声破碎可减少由研磨程度不均引起递质含量的提取差异; (2) 样本离心分两个阶段, 首次4℃离心15m in (14000r/min ) 后, 取样品于新离心管-80℃冻存, 样品中仍会含有一些小的蛋白分子、脂类分子、核酸分子等, 这些物质经盐离子或有机溶剂冷冻孵育后才能沉淀。样品测试前取出融化后再次离心, 几乎所有的大分子都会沉淀下来。这时样品可直接上样。若不冻存也可连续两次离心后, 采用耐酸GHP 0. 2μm 滤器过滤处理也能净化样品。因色谱柱ES A MD 2150是耐强酸柱(pH 范围为1~12) , 故样品可不用钾盐中和直接上样检测, 对于不耐酸色谱柱, 样品可经钾盐沉淀过量酸处理。但实验证实经钾盐处理后, 递质回收率会相应降低。

第3期赵焕英等:

高效液相色谱同时检测生物样本中8种单胺类神经递质  333

3. 4 样品保存时间的确定

文献[11]报道标准品用流动相稀释虽干扰峰小, 但易降解, 而采用HCl O 4稀释有助于样品稳定。本研究经过验证标准品无论用流动相还是用HCl O 4稀释在48h 内都会发生降解, 故实验采用在0. 01mol/LHCl O 4中加入0. 01%L 2半胱氨酸、50mmol/LNa 2EDT A 更有助于标品的稳定, 同时减少了金属离子对检测的干扰。实验证实标准品在48h 之内, 峰面积RS D%

实验对样品的保存及降解情况作了统计, 制备的样品在48h 之内无论存放4℃还是-80℃, 其递质含量变化不大, 72h 后递质变化有统计意义。因此制备好的样品在3d 内检测比较准确。

3. 5 样品测定实例结果图

将以上建立的测试方法, 应用在S D 大鼠P D 模型、快速老化小鼠(S AMP8) P D 模型及培养的细胞、血液和透析液的检测中, 峰型都很稳定, 几乎无杂质干扰峰。如图2a 从给予生理盐水S AMP8小鼠的纹体中提取各递质分析结果; 图2b 从给予62羟多巴处理的S AMP8P D 模型小鼠的纹体中提取各递质分析结果。由检测图可看出, 经改进的样本提取方法能很好地去除蛋白, 几乎没有干扰峰的出现, 且基线分

[5, 8]离好。而现有文献大多没有能同时检测这8种递质, 最多检测到7种, 而且组织检测图或基线分离

[7][5]不好, 或杂质峰多, 文献[8, 11]测试方法中进样杂峰太多, 使得出峰在前的、E 检测不到, 而大

[6]多同时检测多种物质时需用多通道检测器, , , 一流动相、单流速

、图2 正常S AM P8小鼠尾壳核(a ) 和S AM P8小鼠尾壳核(b ) 中8种单胺类神经递质色谱图

Fig . 2 Chr omat ogra m of eight monoa m ine neur otrans m itters in dorsal caudate puta men of nor mal

S AMP8mouse (a ) and S AMP8P D mouse (b )

References

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A M ethod for S i m ult aneous D etecti on of 8K i n ds of M onoam i n e

Neurotran s m itter i n B i olog i ca l Sam ples Usi n g H i gh Perfo mance

L i qu i d Chroma tography w ith Electrochem i ca l D etecti on

ZHAO Huan 2Ying , DUAN Chun 2L i , F AN Chun 2Xiang , L I U Q i , ZHANG Tao , Y ANG Hui

11, 2111131(B eijing Institute for N euroscience, Capital M edical U niversity; B eijing Center for N eural Regeneration and Repair ;

Key L aboratory for N eurodegenerative D isease of the M inistry of Education, B eijing 100069)

2(M edical Experi m ent and Test center , Capital M edical U niversity, B eijing 100069)

Abstract  A si m p le, rap id and sensitive HP LC 2ECD method was t o monoa m ine neur o 2trans m itters and its metabolites, eight neur otrans m itters (L 2DOP A ) , Nor 2ep inephrine (NE ) ; Eoubeogrube (e ) ; 3, 4) ; 32Hydr oxytyra m ine hydr o 2chl oride (DA ) ; 52Hydr 2; 42Hydr oxy 232methoxyacetic acid (HVA ) ; 52Hydr oxytrya m detected under the sa me mobile phase, fl ow rate and mono 2channel detect or in m . analytes were separated on a ES A MD 2150column (150mm ×3. 2mm , 3μm ) . The mobile phase (pH 3. 5) , consisted of methanol 2water phase (containing 50mmol/Lcitric acid, 50mmol/Lanhydr ous s odiu m acetate, 0. 5mmol/L12octanesulfonic acid s odium salt, 0. 5mmol/LNa 2EDT A , 5mmol/LTriethyla m ine, 5%-10%methanol ) the colu mn te mperature was kep t at 30℃. The eight trans m itters can be separated at a fl ow rate of 0. 3-0. 5mL /min using 8%methanol with a fl ow rate of 014mL /min . The first five components were observed be linear over a concentrati on range of 0. 005-10nmol/L,and the foll owed three components 0. 001-10n mol/L.The l ow li m it of detecti on was the level of pmol/L.The correlati on coefficients of these compounds were 0. 994-0. 999, the recoveries were 80. 3%-102. 1%, the RS D s were 1. 42%-4. 85%.The p retreat m ent of sa mp les was als o studied . Keywords  Catechola m ines, high perf or mance liquid chr omat ography, electr oche m ical detecti on

(Received 26August 2008; accep ted 8Oct ober 2008)

“第十二届国际电分析化学会议”的通知

  经中国科学院批准, 并受中国化学会委托, 第十二届国际电分析化学会议由中国科学院长春应用化学研究所电分析化学国家重点实验室承办。会议将于2009年8月12日至15日在长春应用化学研究所举办。会议将特邀国际著名电分析化学家参加, 会议语言为英语。欢迎参加, 如提出报告, 请交电子版英文摘要一份。

论文截止日期:2009年5月15日。

联系人:张柏林 电话/传真:0431-85262430, E mail:[email protected] . jl . cn

地址:吉林省长春市人民大街5625号,  邮编:130022

欢迎登录htt p://isec . ciac . jl . cn 了解会议详细信息


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