・论 著・
正交法优化葛根超临界提取工艺研究
王龙虎, 叶秀珠, 宋彦廷, 刘雪松, 陈 勇
1
2
1
1
1
【摘要】 目的 研究超临界萃取工艺提取葛根浸膏的新技术。方法 采用正交试验法, 以葛根素的提取率为技术指
标, 考察原料、温度、压力、CO 2流量萃取时间和共溶剂用量等工艺条件对提取效果的影响。结果 确定如下超临界提取葛根的优选条:原料葛根粉碎到平均粒度(0. 20mm) , 加入(1:1, w/w)共溶剂乙醇, 在50℃和25mPa 下, 以15L/h 流量的CO 2萃取3h, 葛根素的提取率达到1. 85%, 高于文献报道的微波提取方法。结论 乙醇辅助超临界提取葛根方法具有快速、高效和浸膏杂质少的优点。
【关键词】 葛根; 葛根素; 高效液相色谱; 超临界流体萃取
【中图分类号】 R284. 2 【文献标识码】 A 【文章编号】 1681-2476(2007) 04-0300-03
Study on pr ocess for super cr itical fluid extr action of Radix Puer ar iae by or thog ２onal exper iments
WA NG Long -hu, Y E Xiu -zhu, SONG Y an -ting, et a l. College of Pha rma ceutical Sciences, Zhejia ng University, Hangzhou 310027, China
【Abstr act 】 Objective To investigate supercritical fluid extraction(SFE) of Radix Puerariae. Methods Condi ２tions for the supercritical CO 2extraction were studied by orthogonal experimental design according to the content of puerarin in the extract. Results The optimum conditions for SFE of Radix Puerariae were found as 50℃, 25mPa, using the ethanol as the modifier(1:1, w/w) , and with the CO 2flow rate of 15L/h for 3h. The most content of Puer ２arin was determinate by HPLC after the collection, the extraction rate reach 1. 85%.Conclusion The experimental results can be used for confirming process for extraction of Radix Puerariae and for the industrial production. 【K ey words 】 Radix Puerariae; Puerarin; HPLC; supercritical fluid extraction 葛根为豆科植物野葛Puerariae lobata (Willd. ) Ohwi 的干燥根, 系常用中药, 《中国药典》收载。葛根素是葛根的主要有效成分, 在降低血压和心肌耗氧量、抗心律失常和限制心肌梗死范围等方面具有较好疗效
[1]
低, 单纯的超临界CO 2萃取的效果很差。本文采用加入共溶剂的改良工艺, 取得了较好的提取率, 为葛根提取工艺的研究和开发提供了新的技术思路。1 仪器与药品
超临界萃取装置由江苏南通华安超临界萃取有限公司提供, 型号为HA220-50-06。超临界流体萃取的工艺流程如图1所示。葛根药材(杭州中药饮片厂) ; 葛根素对照品(浙江省药检所) ; CO 2(纯度≥99%, 由杭州凯天气体公司提供) ; 95%乙醇(药用级) 。2 方法
2. 1 葛根素的含量测定方法
2. 1. 1 高效液相色谱条件 色谱柱:C 18色谱柱(250mm ×4. 6mm, 5μm) ; 流动相A 为纯水; 流动相B 为甲醇, 线形梯度洗脱, 程序为0～15min 内, B 体积分数25%～30%; 15～16min 内, B 体积分数30%～70%; 16～20min 内, B 体积分数70%; 20～21min 内, B 体积分数70%～25%; 检测波长250nm; 进样量
。目前, 文献报道的从葛根中提取分离
[2～7]
葛根素的方法有乙醇加热回流法、渗滤法、超声提取、微波辅助萃取和加压溶剂提取等
, 这些方法
大多存在工艺流程长、耗费大、提取效率低、有机溶剂残留等缺点。超临界萃取(Supercritical Fluid Ex ２traction, SFE) 具有工艺流程短、提取效率高、无污染等诸多优点。CO 2是唯一工业化应用的超临界流体, 其超临界状态较易达到, 而且对产品无副作用, 故在中药浸膏和有效组分的提取中应用很广泛
[8～10]
。
由于葛根的主要有效成分是以葛根素为代表的异黄酮类化合物, 这些物质一般在CO 2的溶解度较
作者单位:1310027浙江杭州, 浙江大学药学院
2310009浙江杭州, 浙江中医药大学门诊部
10μl; 柱温35℃; 流速0. 7ml /
min 。
1CO 2钢瓶 2净化器 3携带剂 4冰箱 5混合器 6净化器 7萃取缸 8分离器Ⅰ 9分离器Ⅱ
图1 临界流体萃取实验装置
2. 1. 2 对照品溶液的制备 精密称取葛根素对照品20. 5mg, 置10ml 量瓶中, 加75%甲醇水溶液稀释至刻度, 摇匀; 精密吸取1. 0ml, 置25ml 量瓶中, 加75%甲醇溶液稀释至刻度, 摇匀, 即得对照品溶液(每1ml 含葛根素82μg) 。
2. 1. 3 供试品溶液的制备 将葛根的超临界CO 2萃取物减压浓缩后, 得到浅黄色浸膏。精确称取0. 1g 浸膏, 置5ml 容量瓶中, 加适量75%甲醇水溶液, 超声搅拌30min, 使浸膏尽量溶解, 定容至刻度。摇匀, 以0. 45μm 的微孔滤膜滤过, 弃去初滤液, 取续滤液, 即为供试品溶液。
2. 2 超临界提取工艺 将经过粉碎得到的葛根粉末加入适量的共溶剂乙醇, 用超临界流体CO 2进行超临界流体萃取实验。实验的萃取压力为15～30mPa, 萃取温度为40℃～70℃, 萃取时间为100～240min, 分离釜的解析压力分别为6mPa 和4. 5mPa, CO 2循环萃取。
超临界CO 2萃取过程是一个复杂体系, 工艺参数的影响因素比较多, 其中有些显著, 需要严格控制; 有些不明显, 操作范围相对较宽。为了减少实验工作量, 本文采用正交试验研究超临界萃取葛根素的工艺方法。
按照L 9(3) 正交表进行设计, 选定考察的四个工艺因素为:萃取压力(A) 、萃取温度(B) 、原料的粒度(C) 和乙醇比例(D) 。其他条件为:萃取时间3h, CO 2流量15L/h, 分离釜的压力分别为6mPa 和4. 5mPa 。因素水平见表1。
4
表1 因素水平表
因素
水平
A 压力(mPa)
123
152025
B 温度(K) 318323328
C
平均粒径(mm)
0. 550. 350. 20
D R 1:11:21:3
注:R 为乙醇与物料的质量比
3 结果与讨论
3. 1 正交试验结果 见表2、表3。表2和表3分别列出了正交试验结果和方差分析。由表2可知, 因素A 有显著影响。因素的影响次序为:A >B >D >C 。根据表2和表3, 得到本实验范围内的最佳工艺条件是A 3B 2C 3D 1。因此, 得到超临界萃取葛根浸膏的优选工艺为:原料平均粒度0. 20mm, 共溶剂乙醇的用量为(1:1, w/w), 萃取压力25mPa, 萃取温度50℃, CO 2流量15L/h, 萃取时间3h 。
表2 L 9(3) 正交实验设计及结果
因素
实验号
A
123456
111222
B 123123
C 123231
D 123312
葛根素得率Y i , mg/g 8. 610. 511. 011. 618. 813. 0
4
续表2
789k 1k 2k 3R j 最佳水平
33310. 0314. 4715. 575. 54A 3
12311. 1715. 0313. 873. 87B 2
31212. 4713. 2314. 371. 90C 3
23115. 0012. 6712. 802. 73D 1
13. 315. 817. 6
对照葛根中葛根素的分析结果, 可知在优选条件下葛根素SFE 的提取率达到95%以上, 提取效果良好。研究结果表明, 采用乙醇作为共溶剂的超临界CO 2萃取工艺能较好地提取葛根中的异黄酮化合物。不仅如此, 由于CO 2对多糖、蛋白质等大分子的溶解度极低, 提取的选择性较高, 故SFE 得到的浸膏比传统的溶剂法要干净, 这样有利于后续的分离和纯化过程。
【参考文献】
表3 正交实验方差分析
因素A B C D 误差总计
方差平方和50. 6123. 415. 5411. 955. 5491. 51
自由度22222
均方25. 3111. 712. 775. 982. 77
F 值9. 144. 231. 002. 16
显著性+
1 刘新元, 何永志, 王倩, 等. HPLC 法测定葛根素氯化钠注射液中葛
根素的含量. 中草药, 2001, 32(9) :795-796.
2 马海乐, 王超, 刘伟民. 葛根总黄酮微波辅助萃取技术. 江苏大学学
报(自然科学版) , 2005, 26(2) :98-101.
3 王美东, 李常行, 孙饮美. 葛根提取工艺的正交设计试验. 齐鲁药
事, 2005, 24(1) :45-46.
4 梁桂贤, 李勤. 葛根黄酮提取分离方法及制剂研究进展. 山西中医
学院学报, 2001, 2(4) :47-49.
5 向纪明, 李金灿, 柳林. 吸附法提取分离葛根素的研究. 天然产物研
究与开发, 2003, 15(3) :242-244.
6 贺云, 张尊听, 杨红兵. 一种简便方法从野葛根中提取纯化葛根异
黄酮. 天然产物研究与开发, 2002, 4(1) :54-56.
7 万建波, 徐辰, 王一涛, 等. 葛根异黄酮成分的加压溶剂提取法研
究. 分析化学, 2005, 33(10) :1435-1438.
8 Peterson A, Machmudah S, Hirose T. Extraction of essential oil from ge ２
ranium with supercritical carbon dioxide. J Chem Technol Biot , 2006, 81(2) :167-172.
9 Smith RM. Supercritical fluids in separation science -the dreams, the
注:++:F 0. 05(2, 2) =19. 00, +:F 0. 1(2, 2) =9. 00
3. 2 最佳工艺验证试验 根据上述最佳的工艺条件, 取已粉碎的葛根药材进行多次重复提取实验(n =5) 。然后从超临界提取的浸膏中取样, 进行葛根素定量分析, 计算葛根素的提取率, 结果列于表4。乙醇共溶剂超临界CO 2提取葛根, 葛根素的平均得率为18. 5mg /g, 明显高于微波提取工艺的得率(9. 2mg /g)
[2]
。
表4 优化条件下超临界萃取实验结果
产率(mg/g)
18. 617. 919. 517. 818. 8
18. 5±0. 3平均得率(mg /g)
reality and the fut ure. J Chromatogr A, 1999, 859(1-2) :83-115. 10 Sovova H. Mathematical model for supercritical flui d extraction of nat ２
ural products and extraction curve evaluation. J Supercrit Fluid, 2005, 33(1) :35-52.
实验编号
12345
(编辑:张 彦)
敬 告 读 者
本刊每条参考文献均于正文内标注角码并照下列格式按引用先后排列于文末:
期刊:作者. 文题. 刊名(外文刊名用通用缩写) , 年, 卷(期) :起页-止页. 书籍:作者(主编). 文题. 书名. 版次. 出版地:出版社, 年, 起页-止页.
《中华现代中医学杂志》编辑部
・论 著・
正交法优化葛根超临界提取工艺研究
王龙虎, 叶秀珠, 宋彦廷, 刘雪松, 陈 勇
1
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【摘要】 目的 研究超临界萃取工艺提取葛根浸膏的新技术。方法 采用正交试验法, 以葛根素的提取率为技术指
标, 考察原料、温度、压力、CO 2流量萃取时间和共溶剂用量等工艺条件对提取效果的影响。结果 确定如下超临界提取葛根的优选条:原料葛根粉碎到平均粒度(0. 20mm) , 加入(1:1, w/w)共溶剂乙醇, 在50℃和25mPa 下, 以15L/h 流量的CO 2萃取3h, 葛根素的提取率达到1. 85%, 高于文献报道的微波提取方法。结论 乙醇辅助超临界提取葛根方法具有快速、高效和浸膏杂质少的优点。
【关键词】 葛根; 葛根素; 高效液相色谱; 超临界流体萃取
【中图分类号】 R284. 2 【文献标识码】 A 【文章编号】 1681-2476(2007) 04-0300-03
Study on pr ocess for super cr itical fluid extr action of Radix Puer ar iae by or thog ２onal exper iments
WA NG Long -hu, Y E Xiu -zhu, SONG Y an -ting, et a l. College of Pha rma ceutical Sciences, Zhejia ng University, Hangzhou 310027, China
【Abstr act 】 Objective To investigate supercritical fluid extraction(SFE) of Radix Puerariae. Methods Condi ２tions for the supercritical CO 2extraction were studied by orthogonal experimental design according to the content of puerarin in the extract. Results The optimum conditions for SFE of Radix Puerariae were found as 50℃, 25mPa, using the ethanol as the modifier(1:1, w/w) , and with the CO 2flow rate of 15L/h for 3h. The most content of Puer ２arin was determinate by HPLC after the collection, the extraction rate reach 1. 85%.Conclusion The experimental results can be used for confirming process for extraction of Radix Puerariae and for the industrial production. 【K ey words 】 Radix Puerariae; Puerarin; HPLC; supercritical fluid extraction 葛根为豆科植物野葛Puerariae lobata (Willd. ) Ohwi 的干燥根, 系常用中药, 《中国药典》收载。葛根素是葛根的主要有效成分, 在降低血压和心肌耗氧量、抗心律失常和限制心肌梗死范围等方面具有较好疗效
[1]
低, 单纯的超临界CO 2萃取的效果很差。本文采用加入共溶剂的改良工艺, 取得了较好的提取率, 为葛根提取工艺的研究和开发提供了新的技术思路。1 仪器与药品
超临界萃取装置由江苏南通华安超临界萃取有限公司提供, 型号为HA220-50-06。超临界流体萃取的工艺流程如图1所示。葛根药材(杭州中药饮片厂) ; 葛根素对照品(浙江省药检所) ; CO 2(纯度≥99%, 由杭州凯天气体公司提供) ; 95%乙醇(药用级) 。2 方法
2. 1 葛根素的含量测定方法
2. 1. 1 高效液相色谱条件 色谱柱:C 18色谱柱(250mm ×4. 6mm, 5μm) ; 流动相A 为纯水; 流动相B 为甲醇, 线形梯度洗脱, 程序为0～15min 内, B 体积分数25%～30%; 15～16min 内, B 体积分数30%～70%; 16～20min 内, B 体积分数70%; 20～21min 内, B 体积分数70%～25%; 检测波长250nm; 进样量
。目前, 文献报道的从葛根中提取分离
[2～7]
葛根素的方法有乙醇加热回流法、渗滤法、超声提取、微波辅助萃取和加压溶剂提取等
, 这些方法
大多存在工艺流程长、耗费大、提取效率低、有机溶剂残留等缺点。超临界萃取(Supercritical Fluid Ex ２traction, SFE) 具有工艺流程短、提取效率高、无污染等诸多优点。CO 2是唯一工业化应用的超临界流体, 其超临界状态较易达到, 而且对产品无副作用, 故在中药浸膏和有效组分的提取中应用很广泛
[8～10]
。
由于葛根的主要有效成分是以葛根素为代表的异黄酮类化合物, 这些物质一般在CO 2的溶解度较
作者单位:1310027浙江杭州, 浙江大学药学院
2310009浙江杭州, 浙江中医药大学门诊部
10μl; 柱温35℃; 流速0. 7ml /
min 。
1CO 2钢瓶 2净化器 3携带剂 4冰箱 5混合器 6净化器 7萃取缸 8分离器Ⅰ 9分离器Ⅱ
图1 临界流体萃取实验装置
2. 1. 2 对照品溶液的制备 精密称取葛根素对照品20. 5mg, 置10ml 量瓶中, 加75%甲醇水溶液稀释至刻度, 摇匀; 精密吸取1. 0ml, 置25ml 量瓶中, 加75%甲醇溶液稀释至刻度, 摇匀, 即得对照品溶液(每1ml 含葛根素82μg) 。
2. 1. 3 供试品溶液的制备 将葛根的超临界CO 2萃取物减压浓缩后, 得到浅黄色浸膏。精确称取0. 1g 浸膏, 置5ml 容量瓶中, 加适量75%甲醇水溶液, 超声搅拌30min, 使浸膏尽量溶解, 定容至刻度。摇匀, 以0. 45μm 的微孔滤膜滤过, 弃去初滤液, 取续滤液, 即为供试品溶液。
2. 2 超临界提取工艺 将经过粉碎得到的葛根粉末加入适量的共溶剂乙醇, 用超临界流体CO 2进行超临界流体萃取实验。实验的萃取压力为15～30mPa, 萃取温度为40℃～70℃, 萃取时间为100～240min, 分离釜的解析压力分别为6mPa 和4. 5mPa, CO 2循环萃取。
超临界CO 2萃取过程是一个复杂体系, 工艺参数的影响因素比较多, 其中有些显著, 需要严格控制; 有些不明显, 操作范围相对较宽。为了减少实验工作量, 本文采用正交试验研究超临界萃取葛根素的工艺方法。
按照L 9(3) 正交表进行设计, 选定考察的四个工艺因素为:萃取压力(A) 、萃取温度(B) 、原料的粒度(C) 和乙醇比例(D) 。其他条件为:萃取时间3h, CO 2流量15L/h, 分离釜的压力分别为6mPa 和4. 5mPa 。因素水平见表1。
4
表1 因素水平表
因素
水平
A 压力(mPa)
123
152025
B 温度(K) 318323328
C
平均粒径(mm)
0. 550. 350. 20
D R 1:11:21:3
注:R 为乙醇与物料的质量比
3 结果与讨论
3. 1 正交试验结果 见表2、表3。表2和表3分别列出了正交试验结果和方差分析。由表2可知, 因素A 有显著影响。因素的影响次序为:A >B >D >C 。根据表2和表3, 得到本实验范围内的最佳工艺条件是A 3B 2C 3D 1。因此, 得到超临界萃取葛根浸膏的优选工艺为:原料平均粒度0. 20mm, 共溶剂乙醇的用量为(1:1, w/w), 萃取压力25mPa, 萃取温度50℃, CO 2流量15L/h, 萃取时间3h 。
表2 L 9(3) 正交实验设计及结果
因素
实验号
A
123456
111222
B 123123
C 123231
D 123312
葛根素得率Y i , mg/g 8. 610. 511. 011. 618. 813. 0
4
续表2
789k 1k 2k 3R j 最佳水平
33310. 0314. 4715. 575. 54A 3
12311. 1715. 0313. 873. 87B 2
31212. 4713. 2314. 371. 90C 3
23115. 0012. 6712. 802. 73D 1
13. 315. 817. 6
对照葛根中葛根素的分析结果, 可知在优选条件下葛根素SFE 的提取率达到95%以上, 提取效果良好。研究结果表明, 采用乙醇作为共溶剂的超临界CO 2萃取工艺能较好地提取葛根中的异黄酮化合物。不仅如此, 由于CO 2对多糖、蛋白质等大分子的溶解度极低, 提取的选择性较高, 故SFE 得到的浸膏比传统的溶剂法要干净, 这样有利于后续的分离和纯化过程。
【参考文献】
表3 正交实验方差分析
因素A B C D 误差总计
方差平方和50. 6123. 415. 5411. 955. 5491. 51
自由度22222
均方25. 3111. 712. 775. 982. 77
F 值9. 144. 231. 002. 16
显著性+
1 刘新元, 何永志, 王倩, 等. HPLC 法测定葛根素氯化钠注射液中葛
根素的含量. 中草药, 2001, 32(9) :795-796.
2 马海乐, 王超, 刘伟民. 葛根总黄酮微波辅助萃取技术. 江苏大学学
报(自然科学版) , 2005, 26(2) :98-101.
3 王美东, 李常行, 孙饮美. 葛根提取工艺的正交设计试验. 齐鲁药
事, 2005, 24(1) :45-46.
4 梁桂贤, 李勤. 葛根黄酮提取分离方法及制剂研究进展. 山西中医
学院学报, 2001, 2(4) :47-49.
5 向纪明, 李金灿, 柳林. 吸附法提取分离葛根素的研究. 天然产物研
究与开发, 2003, 15(3) :242-244.
6 贺云, 张尊听, 杨红兵. 一种简便方法从野葛根中提取纯化葛根异
黄酮. 天然产物研究与开发, 2002, 4(1) :54-56.
7 万建波, 徐辰, 王一涛, 等. 葛根异黄酮成分的加压溶剂提取法研
究. 分析化学, 2005, 33(10) :1435-1438.
8 Peterson A, Machmudah S, Hirose T. Extraction of essential oil from ge ２
ranium with supercritical carbon dioxide. J Chem Technol Biot , 2006, 81(2) :167-172.
9 Smith RM. Supercritical fluids in separation science -the dreams, the
注:++:F 0. 05(2, 2) =19. 00, +:F 0. 1(2, 2) =9. 00
3. 2 最佳工艺验证试验 根据上述最佳的工艺条件, 取已粉碎的葛根药材进行多次重复提取实验(n =5) 。然后从超临界提取的浸膏中取样, 进行葛根素定量分析, 计算葛根素的提取率, 结果列于表4。乙醇共溶剂超临界CO 2提取葛根, 葛根素的平均得率为18. 5mg /g, 明显高于微波提取工艺的得率(9. 2mg /g)
[2]
。
表4 优化条件下超临界萃取实验结果
产率(mg/g)
18. 617. 919. 517. 818. 8
18. 5±0. 3平均得率(mg /g)
reality and the fut ure. J Chromatogr A, 1999, 859(1-2) :83-115. 10 Sovova H. Mathematical model for supercritical flui d extraction of nat ２
ural products and extraction curve evaluation. J Supercrit Fluid, 2005, 33(1) :35-52.
实验编号
12345
(编辑:张 彦)
敬 告 读 者
本刊每条参考文献均于正文内标注角码并照下列格式按引用先后排列于文末:
期刊:作者. 文题. 刊名(外文刊名用通用缩写) , 年, 卷(期) :起页-止页. 书籍:作者(主编). 文题. 书名. 版次. 出版地:出版社, 年, 起页-止页.
《中华现代中医学杂志》编辑部