※生物工程食品科学
2009, Vol. 30, No. 01181
采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达
载体的构建
陈 波1,2，王 熙2，贺新生2，张义正1, *
(1.四川大学生命科学学院，四川 成都 610064；2. 西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010)摘 要：为在泡盛曲霉中表达外源基因、克服泡盛曲霉常规转化法效率低下的瓶颈，本研究拟构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体。通过PCR ，从糖化酶基因(gla A) 高效表达的泡盛曲霉菌株SG1基因组DNA 扩增获得gla A 2.1 kb启动子片段(包含信号肽编码序列) 及1.1kb 终止子片段，构建了外源基因表达盒。以根瘤农杆菌双元载体pCAMBIA1302为基础，删除非必需区段及多余限制酶位点，插入上述外源基因表达盒及来自丝状真菌标记载体pAN7-1的潮霉素抗性标记，构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉分泌整合型表达载体pSUAA52am 。转化结果表明：采用原生质体法的转化效率为21个转化子/106分生孢子，而农杆菌介导法可达1106个转化子/106分生孢子，是原生质体法的53倍。构建载体成功利用gla A 表达盒与农杆菌介导转化法的高效特性，可为利用泡盛曲霉高效表达外源基因奠定基础。
关键词：泡盛曲霉；gla A 表达盒；农杆菌介导转化法；表达载体
Construction of Agrobacterium -mediated Aspergillus awamori Expression Vector
CHEN Bo1,2，WANG Xi2，HE Xin-sheng2，ZHANG Yi-zheng1, *(1.College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China；
2.College of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China)Abstract ：To utilize the high efficiency of gla A expression cassette of Aspergillus awamori and Agrobacterium-mediated transformation in the construction of A.awamori expression vector, a 2.1-kb glaA promoter fragment including signal peptide-coding sequence and a 1.1-kb gla A terminator fragment were amplified from the genomic DNA of A.awamori strain SG1 by PCRand then fused to form a foreign gene expression cassette. The Agrobacterium tumefaciens binary vector pCAMBIA1302 wasused as backbone and its T-borders and necessary elements for E.coli and Agrobacterium -mediated transformation were retainedwhereas other regions in the vector were deleted. The foreign gene expression cassette described above and the filamentous fungalfunctional hygromycin B resistance marker from pAN7-1 were inserted into the region between T-borders. Finally a secretoryintegration Agrobacterium -mediated A.awamori expression vector pSUAA52am was constructed. Transformation experimentshowed that transformation efficiency of pSUAA52am into A. awamori with protoplast method was 21 transformants/106 spores,while that with Agrobacterium -mediated method reached 1106 transformants/106 spores, 53 folds of the former. This indicatedthat the construction of this expression vector is successful.
Key words： Aspergillus awamori；gla A expression cassette；Agrobacterium -mediated transformation；expression vector中图分类号：Q782 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)01-0181-05
泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 是黑曲霉(Aspergillus niger) 变种，是微生物工业最重要的糖化酶(glucoamylase)生产菌，有着强大的分泌胞外糖化酶的能力，据报道黑曲霉最高可达30g/L的发酵水平[1]。本实验室经过多次诱变
筛选获得一株泡盛曲霉糖化酶高产突变株SG1，该菌株具备如下特点：(1) 糖化酶基因高效表达，且分泌能力强，在优化条件下，表达量可达5.3g/L水平，说明其糖化酶基因glaA 具有强启动子及终止子等高效表达元件；
收稿日期：2007-12-12
基金项目：西南科技大学重大科学研究项目(023113)
作者简介：陈波(1965-)，男，讲师，博士研究生，研究方向为微生物分子生物学。E-mail ：[email protected]*通讯作者：张义正(1947-)，男，教授，研究方向为分子生物学。E-mail ：[email protected]
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食品科学※生物工程
(2)该菌株不产胞外水解蛋白酶，使蛋白质分泌到胞外时不被降解，适合用作宿主菌株；(3)该菌株可利用廉价的淀粉物质，生产基因工程产物时原料成本低廉；(4)产孢能力强，生长迅速，有利于菌种保藏及工业规模生产；(5)该菌株具有食用级安全性[2]，非常适合表达药用及食用蛋白；(6) 与黑曲霉相比，具有不产色素、有利于产物纯化的优点。因此，该菌株适合用于构建泡盛曲霉高效分泌表达系统。考虑到泡盛曲霉高效表达与分泌机制的复杂性，本研究直接利用该菌株的糖化酶基因gla A 的强启动子(包括信号肽序列) 及终止子元件来构建外源基因表达盒，在设计多克隆位点MCS 时考虑位点的翻译及连接序列等因素，使外源基因插入时尽可能接近天然的gla A 基因的表达元件，以减少影响外源基因高效表达的不确定因素，使外源基因获得比较高效的异源表达。
原生质体转化法是泡盛曲霉表达载体的常规转化法，但操作繁琐、效率低下，影响了泡盛曲霉表达系统的实际应用。Groot [3]等于1998年首先报道了根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 可以将Ti 质粒的T-DNA 高效转入丝状真菌，随后用农杆菌介导法转化黑曲霉等多种丝状真菌获得成功[4-5]。Li 等[6]于2005年报道利用农杆菌介导法成功地对黄孢原毛平革菌(P h a n e r o c h a e t e chrysosporium ) 进行了遗传转化，为丝状真菌的转化方法开辟了新途径。本研究以根瘤农杆菌双元载体pCAMBIA1302为骨架，采用泡盛曲霉SG1高效的gla A 表达盒和来自丝状真菌标记载体的pAN7-1潮霉素抗性基因作为选择标记，构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉分泌整合型表达载体，以期打破泡盛曲霉转化效率低下这一瓶颈，为外源基因在泡盛曲霉中的高效表达奠定基础。1材料与方法1.1材料1.1.1
菌株与质粒
大肠杆菌JM109用于常规大肠杆菌质粒扩增；根瘤农杆菌EHA105用于根瘤农杆菌质粒转化；泡盛曲霉SG1为本实验室经多次诱变筛选获得的糖化酶高产菌株[2]，用于提取基因组DNA ，并用作泡盛曲霉表达宿主；质粒pUC19用于PCR 产物亚克隆及测序分析；根瘤农杆菌双元载体pCAMBIA1302用作农杆菌介导的泡盛曲霉表达载体的构建骨架；丝状真菌标记载体pAN7-1用于提供潮霉素(hygromycin B)抗性标记。以上菌株及质粒均为本实验室保存。1.1.2
培养基
大肠杆菌转化采用LB 、SOB 及SOC 培养基[7]；根
瘤农杆菌转化采用YEP 培养基[8]
；泡盛曲霉培养采用
Aa 培养基(g/L)：(NH4) 2SO 4 6.5、柠檬酸2.0、(NH4) 2HPO 4 3.5、MgSO 4 0.2、K 2HPO 4 10、酵母粉10、淀粉50，加水至1000ml ，自然pH 。1.1.3
试剂
限制性内切酶、T4 DNA聚合酶、S1核酸酶及T4DNA 连接酶 宝生物工程(大连) 有限公司；Pfu DNA聚合酶 北京赛百盛公司；卡那霉素、利福平、羧苄青霉素、潮霉素及乙酰丁香酮(AS) 上海生工生物工程公司。1.2方法
1.2.1
泡盛曲霉SG1基因组DNA 提取
接种SG1斜面孢子于100ml Aa培养基中，28℃振荡培养(180r/min)36h，收集菌丝体，然后参照文献[9]的方法提取。1.2.2
限制酶位点消除
载体上需要消除的限制酶位点先用相应限制酶完全酶切，线性化载体平端化后自连即消除该限制酶位点。3’-突出末端采用T 4 D N A 聚合酶切平。5’-突出末端采用Pfu DNA聚合酶延伸法补平，20μl 补平反应体系为：酶切产物适量(＜1μg) 或切胶回收液适量(通常取1μl) ，10mmol/L dNTPs 0.5μl ，Pfu DNA聚合酶1.5 U，补加ddH 2O 至20μl ，72℃ 保温延伸10min 。Spe I 和Bss HII 的5’-突出末端采用S1核酸酶平端化，以免产生新的Bss HII 位点。1.2.3
泡盛曲霉gla A 基因启动子片段克隆
根据报道的黑曲霉糖化酶基因g l a A 5’-区段序列(GenBank Accession No.X56442)设计正向引物[10]，根据泡盛曲霉糖化酶基因gla A 序列(GenBank Accession No.K02465) 设计反向引物[11]：
正向引物：
反向引物：
5' -C G G G G T A C C C C G C C C G C C G C 下划线处为引入的限制酶位点。正向引物末端带Hin dIII 位点，反向引物带Kpn I 、Xba I 和Bss HII 位点。设计扩增的启动子片段包含gla A 信号肽编码序列(以下简称SS) ，以泡盛曲霉SG1基因组DNA 为模板，采用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增。梯度PCR 扩增条件为：94℃(1min)，40～60℃(1min)，72℃(5min)，35个循环。启动子片段PglaA 经Hin dIII+Kpn I 双酶切后亚克隆至pUC19，得到的重组质粒pUC19-PglaA 经测序确认(由上海生工生物工程公司完成) 。1.2.4
泡盛曲霉gla A 基因终止子片段克隆
根据报道的泡盛曲霉gla A 基因序列(GenBank Acces-
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sion No.K02465)设计引物[11]：
正向引物：5'-CTGGTACCTAGACAATCAATCCATTTCGCTA-3' 反向引物：5'-CTGAATTCATCCGGAGATCCTGATCATC-3'
正向引物带Kpn I 位点及终止密码子TAG 末端，反向引物带Eco RI 末端。以泡盛曲霉SG1基因组DNA 为模板，采用高保真Pfu DNA聚合酶扩增泡盛曲霉gla A 终止子。梯度PCR 扩增条件：94℃(1min)，40～50℃(1min)，72℃(3min)，35个循环。终止子片段TglaA 经Kpn I+Eco RI 双酶切后亚克隆至pUC19，得到的重组质粒pUC19-TglaA 经测序确认(由上海生工生物工程公司完成) 。1.2.5
外源基因表达盒的构建
pUC19-PglaA 用Hin dIII ＋Kpn I 双酶切后，电泳切胶分离gla A 启动子片段，插入pUC19-TglaA MCS相应位点，获得带外源基因表达盒的重组质粒p U C 19-PTglaA 。1.2.6
pAN7-1潮霉素抗性标记的获得
为能在构建的表达载体MCS 中使用常见限制酶位点Xba I ，首先消除pAN7-1上位于潮霉素抗性基因表达盒终止子TtrpC 3’-末端的Xba I 位点。消除了Xba I 位点的pAN7-1用Hin dIII ＋Bgl II 完全双酶切、电泳分离后，切胶回收带潮霉素抗性基因表达盒的4.0 kb Hin dIII-Bgl II 大片段。1.2.7
用于农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体的构建先将pCAMBIA1302用Spe I ＋Bss HII 双酶切除去mGFP 5基因(Spe I-Bss HII 区段) ，用S1核酸酶除去5’-端突起序列后自连，获得重组质粒pCAMI 。该质粒用Kpn I ＋Pst I 双酶切，回收大片段，其3’-突出末端用T4 DNA聚合酶切平后自连，以删除Kpn I-Pst I MCS，获得重组质粒pCAMII 。pUC19-PTglaA 用Xho I 完全酶切后，再用Eco RI 部分酶切，分离3.2 kb外源基因表达盒片段(Xho I 位点位于gla A 启动子5’-末端Hin dIII 位点之后) ，然后将该片段替换pCAMII 中的植物转化标记基因——潮霉素抗性基因(Xho I-Eco RI 区段) ，得到含有外源基因表达盒的重组质粒pCAMIII 。最后将来自丝状真菌标记载体pAN7-1的4.0kb Hin dIII-Bgl II 潮霉素抗性标记片段替换pCAMIII 的Hin dIII-Bgl II 区段，得到用于农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体pSUAA52am(图3) 。1.2.8
泡盛曲霉农杆菌介导转化法[6,12-14]
pSUAA52am 采用冻融法转化到根瘤农杆菌EHA105中。从YEP 平板(含卡那霉素50μg/ml、利福平50μg/ml)上挑取携带表达载体的农杆菌单菌落接种于3ml YEP培养液(含卡那霉素50μg/ml、利福平50μg/ml、乙酰丁香酮AS 200μmol/L)中，28℃、250r/min下培养1d 。取1.5ml 培养液提取质粒确认表达载体已转入农杆菌。用查
氏液体培养基将泡盛曲霉斜面孢子洗下并调整孢子浓度至106个/ml。取100μl 已活化的农杆菌(携带表达载体) 菌液和100μl 泡盛曲霉分生孢子悬浮液混匀，涂布在诱导培养基(含200μmol/L AS的查氏培养基) 平板上，22℃共培养2d ，在平板上倒入10～20ml 半固体选择培养基(含200μg/ml潮霉素及200μg/ml羧苄青霉素的查氏培养基) ，28℃继续培养至潮霉素抗性菌落出现。1.2.9
泡盛曲霉转化方法比较
pSUAA52am 采用原生质体法及农杆菌介导法转化泡盛曲霉SG1菌株，通过计数选择培养基平板上潮霉素抗性转化子，比较不同方法的转化效率(每106个分生孢子得到的泡盛曲霉潮霉素抗性转化子数) 。2结果与分析
2.1
泡盛曲霉糖化酶基因gla A 启动子片段的克隆用DNA 分析软件DNAman 3.0对设计引物进行分析，选择40～60℃的退火温度做梯度PCR ，反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1。可知，3～7道(退火温度为43.1～53.5℃) 及10道(59.8℃) 均有大小约2.1kb 的特异带产生，与预期相符。10道(59.8℃) 只有一条特异带，取其PCR 产物用Hin dIII ＋Kpn I 双酶切后插入p U C 19，得到的重组质粒命名为p U C 19-P g l a A 。
1
2
3
4
5
6
7
8910M
←3530bp ←2027bp
1～10.PCR 产物，退火温度为40.0、41.3、43.1、45.4、48.0、50.7、53.5、56.0、58.1、59.8℃；M. λ/Eco RI+Hin dIII DNA Marker。
图1 泡盛曲霉gla A 启动子梯度PCR
Fig.1 Gradient PCR of A.awamori gla A promoter
测序结果表明，克隆到的gla A 启动子片段大小为2061bp ，包括编码24个氨基酸残基的gla A 信号肽序列，序列已提交GenBank (登记号：EF428455) 。该片段与Fowler 报道的黑曲霉ATCC10864菌株的gla A 基因的相同位置片段有64%的同源性[10]，且该片段具有高等真核生物基因启动子共有序列CAAT 框及TATA 框，表明该启动子具有真核生物启动子的典型特征。2.2
泡盛曲霉糖化酶基因gla A 终止子片段的克隆根据引物设计，选择40～50℃退火温度做梯度
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PCR ，结果见图2。可知，1～9道 (退火温度40.1～49.5℃) 都得到了大小约1.1kb 的特异带，与预期相符。其中，8～9道 (48.5～49.5℃) 无非特异性带，其PCR 产物用 KpnI ＋Eco RI 双酶切后插入pUC19，筛选重组子，重组质粒命名为pUC19-TglaA 。
测序结果表明，泡盛曲霉gla A 终止子片段长1034
M 123456789
947bp →
1～9.PCR 产物，退火温度为40.1、41.9、43.4、44.6、45.6、46.5、47.4、48.5、49.5℃；M. λ/Eco RI+Hin dIII DNA Marker。
图2 泡盛曲霉gla A 终止子梯度PCR
Fig.2 Gradient PCR of A.awamori gla A terminator
bp ，序列已提交GenBank (登记号：EF428456) 。该序列与 GenBank上报道的泡盛曲霉gla A 基因的终止子序列有98%的同源性[11]。2.3
外源基因表达盒的构建
从pUC19-PglaA 切下gla A 启动子片段PglaA(Hin dIII ＋Kpn I) ，插入pUC19-TglaA MCS相应位点，得到含有外源基因表达盒的重组质粒pUC19-PTglaA 。重组质粒用Hin dIII+ Kpn I 双酶切鉴定，电泳结果与预期相符(图略) ，表明Pgla A 片段已经插入pUC19-TglaA 。外源基因表达盒为Pgla A (包括ATG-SS)-Bss HII-Xba I-Kpn I-TAG-TglaA 。2.4
用于农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体pSUAA52am 的构建
构建农杆菌介导的泡盛曲霉表达载体采用了图3所示策略：以根瘤农杆菌双元载体pCAMBIA1302为骨架，保留大肠杆菌和农杆菌介导转化必需区段；删除非必需区段以减小构建载体的大小；消除部分限制酶位点以方便外源基因的克隆操作；插入外源基因表达盒；最后插入丝状真菌潮霉素抗性标记。具体操作见“材料与方法”。
经过筛选，随机挑取了2个重组子经Hin dIII ＋Bgl II 双酶切验证，电泳结果显示(图4) ，2个重组质粒均切下了一条约4.0kb 的特异带，表明潮霉素抗性标记已插入pCAMIII 的Hin dIII-Bgl II 之间。该重组质粒带有外源基因表达盒(由gla A 启动子、信号肽序列SS 及终止子构成，SS 后带有多克隆位点) 、适合丝状真菌转化的潮
霉素抗性标记、以及大肠杆菌与根瘤农杆菌转化的必需元件，命名为pSUAA52am(图3) 。2.5
表达载体的转化
Hin Pst1d111
Bg111CaMV35s 启动子Kpn Eco R1
1
Spel CaMV35S mGFP5启动子
Xho l Bss Nos poly-A
H11
潮霉素(R)pCAMB1A1302Bss T-Border(H11
右)
CaMV35S poly-AXho l (10549bp)T-Border(左) pVS1 sta卡那霉素(R)
pBR322 oripBR322 bom
pVS1 repKpn Hin d111TtrPC
Xba 1Bss H11
l TglaA Eco R1潮霉素(R)
PgpdA
SS
Bg 111PglaA
T-Border(右) Xho l
pSUAA52am
T-Border(左) (13783bp)
pVS1 sta
卡那霉素pBR322ori
(R)
pVS1 rep
pBR322 bom
信号肽Gla A、KexB 和NMCS 的核苷酸和氨基酸序列：1 ATG TCG TTC CGA TCT CTA CTC GCC CTG AGC1 Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser31 GGC CTC GTC TGC ACA GGG TTG GCA AAT GTG11 Gly Leu Val Cys Thr Gly Leu Ala Asn Val
BssHLL Xbal KpnI
图3 用于农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体pSUAA52am 的构建Fig.3 Construction of Agrobacterium -mediated A. awamori
expression vector pSUAA52am
M 123
21226bp →5148bp 4268bp →
3530bp →→
831bp →564bp →
M. λ/Eco RI+Hin dIII DNA Marker；1~2. pCAMIII重组子/Hin dIII +BglII ；3. pCAMIII/Hin dIII+Bgl II(对照) 。
图4 pCAMIII重组质粒Hin dIII ＋Bgl II 双酶切鉴定
Fig.4 Identification of pCAMIII recombinants with Hin dIII+Bgl II
digestion
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2009, Vol. 30, No. 01185
表达载体pSUAA52am 分别用原生质体法和农杆菌介导法转化泡盛曲霉分生孢子，在含潮霉素(终浓度200μg/ml)选择平板上筛选潮霉素抗性转化子，结果见表1。
表1表明，传统的原生质体转化法转化效率仅为21
表1 不同转化方法的转化效率
Table 1 Transformation efficiencies with different transformation
methods
转化方法转化效率(转化子/106 孢子)
倍数原生质体转化法211农杆菌介导转化法
1106
53
个转化子/106分生孢子，转化效率低下。农杆菌介导法直接转化分生孢子达1106个转化子/106分生孢子，转化效率是原生质体法的53倍，表明高效表达载体pSUAA52am 构建成功。3
讨 论
本实验克隆到的泡盛曲霉糖化酶高效表达菌株SG1的糖化酶gla A 基因启动子序列与Fowler 报道的黑曲霉ATCC10864菌株的gla A 基因5’-区段序列(启动子部分) 只有64%同源性[10]，而终止子序列与 GenBank上报道的泡盛曲霉菌株gla A 基因的终止子序列有98%的同源性[11]，信号肽序列则与上述黑曲霉及泡盛曲霉菌株都有100%的同源性，提示不同菌株同源基因表达水平的高低主要取决于基因启动子功能的强弱。泡盛曲霉中内源基因分泌表达的高水平与外源基因分泌表达的低水平形成强烈反差[1]，由于影响因素众多，本研究在构建表达载体时，直接采用了泡盛曲霉高效表达菌株SG1糖化酶基因的强启动子、信号肽及终止子序列构建外源基因表达盒，使外源基因的表达元件尽可能与糖化酶基因天然的高效表达元件保持一致，为外源基因的高效表达创造条件。
设计MCS 时考虑了MCS 核苷酸序列翻译后的氨基酸组成和密码子偏爱性，表达载体上的g l a A 信号肽、KexB 切点及MCS 核苷酸序列与氨基酸组成见图3。MCS 设计了3个限制酶位点，其中Bss HII 是gla A 信号肽序列自带位点，Xba I 与Kpn I 之间为以后根据需要加入新限制酶位点预留了空间(引入额外碱基GCGG 是为了提高Xba I 、Kpn I 酶切效率) ，Lys 和Arg 为gla A 信号肽末尾两个氨基酸，是KexB 识别序列，Lys 、Arg 与Ala 之间为K e x B 切割位点(图3中箭头所示) 。研究表明，KexB 旁侧氨基酸种类对切割效率有显著影响，其中旁侧氨基酸为非极性小分子量氨基酸时对KexB 切割影响较小，尤其是旁侧氨基酸是甘氨酸(Gly) 时影响最小，几乎可以保留90%以上的切割效率[15-16]。因此，为了尽可能不影响KexB 的切割，设计时保留了信号肽KexB 切
点后紧邻信号肽的糖化酶多肽自身的第一个氨基酸——丙氨酸(A l a ) ，并在其后设计了连续4个甘氨酸。甘氨酸侧链R 基为H ，是最小氨基酸，非极性，有“柔性氨基酸”之称，1个Ala 和4个Gly 形成一条柔性短肽链，连接信号肽和融合蛋白，以减少对KexB 切割活性的影响，并使信号肽和融合蛋白两个空间结构相对独立，以保持融合蛋白的天然活性。
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载体的构建
陈 波1,2，王 熙2，贺新生2，张义正1, *
(1.四川大学生命科学学院，四川 成都 610064；2. 西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010)摘 要：为在泡盛曲霉中表达外源基因、克服泡盛曲霉常规转化法效率低下的瓶颈，本研究拟构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体。通过PCR ，从糖化酶基因(gla A) 高效表达的泡盛曲霉菌株SG1基因组DNA 扩增获得gla A 2.1 kb启动子片段(包含信号肽编码序列) 及1.1kb 终止子片段，构建了外源基因表达盒。以根瘤农杆菌双元载体pCAMBIA1302为基础，删除非必需区段及多余限制酶位点，插入上述外源基因表达盒及来自丝状真菌标记载体pAN7-1的潮霉素抗性标记，构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉分泌整合型表达载体pSUAA52am 。转化结果表明：采用原生质体法的转化效率为21个转化子/106分生孢子，而农杆菌介导法可达1106个转化子/106分生孢子，是原生质体法的53倍。构建载体成功利用gla A 表达盒与农杆菌介导转化法的高效特性，可为利用泡盛曲霉高效表达外源基因奠定基础。
关键词：泡盛曲霉；gla A 表达盒；农杆菌介导转化法；表达载体
Construction of Agrobacterium -mediated Aspergillus awamori Expression Vector
CHEN Bo1,2，WANG Xi2，HE Xin-sheng2，ZHANG Yi-zheng1, *(1.College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China；
2.College of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China)Abstract ：To utilize the high efficiency of gla A expression cassette of Aspergillus awamori and Agrobacterium-mediated transformation in the construction of A.awamori expression vector, a 2.1-kb glaA promoter fragment including signal peptide-coding sequence and a 1.1-kb gla A terminator fragment were amplified from the genomic DNA of A.awamori strain SG1 by PCRand then fused to form a foreign gene expression cassette. The Agrobacterium tumefaciens binary vector pCAMBIA1302 wasused as backbone and its T-borders and necessary elements for E.coli and Agrobacterium -mediated transformation were retainedwhereas other regions in the vector were deleted. The foreign gene expression cassette described above and the filamentous fungalfunctional hygromycin B resistance marker from pAN7-1 were inserted into the region between T-borders. Finally a secretoryintegration Agrobacterium -mediated A.awamori expression vector pSUAA52am was constructed. Transformation experimentshowed that transformation efficiency of pSUAA52am into A. awamori with protoplast method was 21 transformants/106 spores,while that with Agrobacterium -mediated method reached 1106 transformants/106 spores, 53 folds of the former. This indicatedthat the construction of this expression vector is successful.
Key words： Aspergillus awamori；gla A expression cassette；Agrobacterium -mediated transformation；expression vector中图分类号：Q782 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)01-0181-05
泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 是黑曲霉(Aspergillus niger) 变种，是微生物工业最重要的糖化酶(glucoamylase)生产菌，有着强大的分泌胞外糖化酶的能力，据报道黑曲霉最高可达30g/L的发酵水平[1]。本实验室经过多次诱变
筛选获得一株泡盛曲霉糖化酶高产突变株SG1，该菌株具备如下特点：(1) 糖化酶基因高效表达，且分泌能力强，在优化条件下，表达量可达5.3g/L水平，说明其糖化酶基因glaA 具有强启动子及终止子等高效表达元件；
收稿日期：2007-12-12
基金项目：西南科技大学重大科学研究项目(023113)
作者简介：陈波(1965-)，男，讲师，博士研究生，研究方向为微生物分子生物学。E-mail ：[email protected]*通讯作者：张义正(1947-)，男，教授，研究方向为分子生物学。E-mail ：[email protected]
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食品科学※生物工程
(2)该菌株不产胞外水解蛋白酶，使蛋白质分泌到胞外时不被降解，适合用作宿主菌株；(3)该菌株可利用廉价的淀粉物质，生产基因工程产物时原料成本低廉；(4)产孢能力强，生长迅速，有利于菌种保藏及工业规模生产；(5)该菌株具有食用级安全性[2]，非常适合表达药用及食用蛋白；(6) 与黑曲霉相比，具有不产色素、有利于产物纯化的优点。因此，该菌株适合用于构建泡盛曲霉高效分泌表达系统。考虑到泡盛曲霉高效表达与分泌机制的复杂性，本研究直接利用该菌株的糖化酶基因gla A 的强启动子(包括信号肽序列) 及终止子元件来构建外源基因表达盒，在设计多克隆位点MCS 时考虑位点的翻译及连接序列等因素，使外源基因插入时尽可能接近天然的gla A 基因的表达元件，以减少影响外源基因高效表达的不确定因素，使外源基因获得比较高效的异源表达。
原生质体转化法是泡盛曲霉表达载体的常规转化法，但操作繁琐、效率低下，影响了泡盛曲霉表达系统的实际应用。Groot [3]等于1998年首先报道了根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 可以将Ti 质粒的T-DNA 高效转入丝状真菌，随后用农杆菌介导法转化黑曲霉等多种丝状真菌获得成功[4-5]。Li 等[6]于2005年报道利用农杆菌介导法成功地对黄孢原毛平革菌(P h a n e r o c h a e t e chrysosporium ) 进行了遗传转化，为丝状真菌的转化方法开辟了新途径。本研究以根瘤农杆菌双元载体pCAMBIA1302为骨架，采用泡盛曲霉SG1高效的gla A 表达盒和来自丝状真菌标记载体的pAN7-1潮霉素抗性基因作为选择标记，构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉分泌整合型表达载体，以期打破泡盛曲霉转化效率低下这一瓶颈，为外源基因在泡盛曲霉中的高效表达奠定基础。1材料与方法1.1材料1.1.1
菌株与质粒
大肠杆菌JM109用于常规大肠杆菌质粒扩增；根瘤农杆菌EHA105用于根瘤农杆菌质粒转化；泡盛曲霉SG1为本实验室经多次诱变筛选获得的糖化酶高产菌株[2]，用于提取基因组DNA ，并用作泡盛曲霉表达宿主；质粒pUC19用于PCR 产物亚克隆及测序分析；根瘤农杆菌双元载体pCAMBIA1302用作农杆菌介导的泡盛曲霉表达载体的构建骨架；丝状真菌标记载体pAN7-1用于提供潮霉素(hygromycin B)抗性标记。以上菌株及质粒均为本实验室保存。1.1.2
培养基
大肠杆菌转化采用LB 、SOB 及SOC 培养基[7]；根
瘤农杆菌转化采用YEP 培养基[8]
；泡盛曲霉培养采用
Aa 培养基(g/L)：(NH4) 2SO 4 6.5、柠檬酸2.0、(NH4) 2HPO 4 3.5、MgSO 4 0.2、K 2HPO 4 10、酵母粉10、淀粉50，加水至1000ml ，自然pH 。1.1.3
试剂
限制性内切酶、T4 DNA聚合酶、S1核酸酶及T4DNA 连接酶 宝生物工程(大连) 有限公司；Pfu DNA聚合酶 北京赛百盛公司；卡那霉素、利福平、羧苄青霉素、潮霉素及乙酰丁香酮(AS) 上海生工生物工程公司。1.2方法
1.2.1
泡盛曲霉SG1基因组DNA 提取
接种SG1斜面孢子于100ml Aa培养基中，28℃振荡培养(180r/min)36h，收集菌丝体，然后参照文献[9]的方法提取。1.2.2
限制酶位点消除
载体上需要消除的限制酶位点先用相应限制酶完全酶切，线性化载体平端化后自连即消除该限制酶位点。3’-突出末端采用T 4 D N A 聚合酶切平。5’-突出末端采用Pfu DNA聚合酶延伸法补平，20μl 补平反应体系为：酶切产物适量(＜1μg) 或切胶回收液适量(通常取1μl) ，10mmol/L dNTPs 0.5μl ，Pfu DNA聚合酶1.5 U，补加ddH 2O 至20μl ，72℃ 保温延伸10min 。Spe I 和Bss HII 的5’-突出末端采用S1核酸酶平端化，以免产生新的Bss HII 位点。1.2.3
泡盛曲霉gla A 基因启动子片段克隆
根据报道的黑曲霉糖化酶基因g l a A 5’-区段序列(GenBank Accession No.X56442)设计正向引物[10]，根据泡盛曲霉糖化酶基因gla A 序列(GenBank Accession No.K02465) 设计反向引物[11]：
正向引物：
反向引物：
5' -C G G G G T A C C C C G C C C G C C G C 下划线处为引入的限制酶位点。正向引物末端带Hin dIII 位点，反向引物带Kpn I 、Xba I 和Bss HII 位点。设计扩增的启动子片段包含gla A 信号肽编码序列(以下简称SS) ，以泡盛曲霉SG1基因组DNA 为模板，采用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增。梯度PCR 扩增条件为：94℃(1min)，40～60℃(1min)，72℃(5min)，35个循环。启动子片段PglaA 经Hin dIII+Kpn I 双酶切后亚克隆至pUC19，得到的重组质粒pUC19-PglaA 经测序确认(由上海生工生物工程公司完成) 。1.2.4
泡盛曲霉gla A 基因终止子片段克隆
根据报道的泡盛曲霉gla A 基因序列(GenBank Acces-
※生物工程
食品科学
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sion No.K02465)设计引物[11]：
正向引物：5'-CTGGTACCTAGACAATCAATCCATTTCGCTA-3' 反向引物：5'-CTGAATTCATCCGGAGATCCTGATCATC-3'
正向引物带Kpn I 位点及终止密码子TAG 末端，反向引物带Eco RI 末端。以泡盛曲霉SG1基因组DNA 为模板，采用高保真Pfu DNA聚合酶扩增泡盛曲霉gla A 终止子。梯度PCR 扩增条件：94℃(1min)，40～50℃(1min)，72℃(3min)，35个循环。终止子片段TglaA 经Kpn I+Eco RI 双酶切后亚克隆至pUC19，得到的重组质粒pUC19-TglaA 经测序确认(由上海生工生物工程公司完成) 。1.2.5
外源基因表达盒的构建
pUC19-PglaA 用Hin dIII ＋Kpn I 双酶切后，电泳切胶分离gla A 启动子片段，插入pUC19-TglaA MCS相应位点，获得带外源基因表达盒的重组质粒p U C 19-PTglaA 。1.2.6
pAN7-1潮霉素抗性标记的获得
为能在构建的表达载体MCS 中使用常见限制酶位点Xba I ，首先消除pAN7-1上位于潮霉素抗性基因表达盒终止子TtrpC 3’-末端的Xba I 位点。消除了Xba I 位点的pAN7-1用Hin dIII ＋Bgl II 完全双酶切、电泳分离后，切胶回收带潮霉素抗性基因表达盒的4.0 kb Hin dIII-Bgl II 大片段。1.2.7
用于农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体的构建先将pCAMBIA1302用Spe I ＋Bss HII 双酶切除去mGFP 5基因(Spe I-Bss HII 区段) ，用S1核酸酶除去5’-端突起序列后自连，获得重组质粒pCAMI 。该质粒用Kpn I ＋Pst I 双酶切，回收大片段，其3’-突出末端用T4 DNA聚合酶切平后自连，以删除Kpn I-Pst I MCS，获得重组质粒pCAMII 。pUC19-PTglaA 用Xho I 完全酶切后，再用Eco RI 部分酶切，分离3.2 kb外源基因表达盒片段(Xho I 位点位于gla A 启动子5’-末端Hin dIII 位点之后) ，然后将该片段替换pCAMII 中的植物转化标记基因——潮霉素抗性基因(Xho I-Eco RI 区段) ，得到含有外源基因表达盒的重组质粒pCAMIII 。最后将来自丝状真菌标记载体pAN7-1的4.0kb Hin dIII-Bgl II 潮霉素抗性标记片段替换pCAMIII 的Hin dIII-Bgl II 区段，得到用于农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体pSUAA52am(图3) 。1.2.8
泡盛曲霉农杆菌介导转化法[6,12-14]
pSUAA52am 采用冻融法转化到根瘤农杆菌EHA105中。从YEP 平板(含卡那霉素50μg/ml、利福平50μg/ml)上挑取携带表达载体的农杆菌单菌落接种于3ml YEP培养液(含卡那霉素50μg/ml、利福平50μg/ml、乙酰丁香酮AS 200μmol/L)中，28℃、250r/min下培养1d 。取1.5ml 培养液提取质粒确认表达载体已转入农杆菌。用查
氏液体培养基将泡盛曲霉斜面孢子洗下并调整孢子浓度至106个/ml。取100μl 已活化的农杆菌(携带表达载体) 菌液和100μl 泡盛曲霉分生孢子悬浮液混匀，涂布在诱导培养基(含200μmol/L AS的查氏培养基) 平板上，22℃共培养2d ，在平板上倒入10～20ml 半固体选择培养基(含200μg/ml潮霉素及200μg/ml羧苄青霉素的查氏培养基) ，28℃继续培养至潮霉素抗性菌落出现。1.2.9
泡盛曲霉转化方法比较
pSUAA52am 采用原生质体法及农杆菌介导法转化泡盛曲霉SG1菌株，通过计数选择培养基平板上潮霉素抗性转化子，比较不同方法的转化效率(每106个分生孢子得到的泡盛曲霉潮霉素抗性转化子数) 。2结果与分析
2.1
泡盛曲霉糖化酶基因gla A 启动子片段的克隆用DNA 分析软件DNAman 3.0对设计引物进行分析，选择40～60℃的退火温度做梯度PCR ，反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1。可知，3～7道(退火温度为43.1～53.5℃) 及10道(59.8℃) 均有大小约2.1kb 的特异带产生，与预期相符。10道(59.8℃) 只有一条特异带，取其PCR 产物用Hin dIII ＋Kpn I 双酶切后插入p U C 19，得到的重组质粒命名为p U C 19-P g l a A 。
1
2
3
4
5
6
7
8910M
←3530bp ←2027bp
1～10.PCR 产物，退火温度为40.0、41.3、43.1、45.4、48.0、50.7、53.5、56.0、58.1、59.8℃；M. λ/Eco RI+Hin dIII DNA Marker。
图1 泡盛曲霉gla A 启动子梯度PCR
Fig.1 Gradient PCR of A.awamori gla A promoter
测序结果表明，克隆到的gla A 启动子片段大小为2061bp ，包括编码24个氨基酸残基的gla A 信号肽序列，序列已提交GenBank (登记号：EF428455) 。该片段与Fowler 报道的黑曲霉ATCC10864菌株的gla A 基因的相同位置片段有64%的同源性[10]，且该片段具有高等真核生物基因启动子共有序列CAAT 框及TATA 框，表明该启动子具有真核生物启动子的典型特征。2.2
泡盛曲霉糖化酶基因gla A 终止子片段的克隆根据引物设计，选择40～50℃退火温度做梯度
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食品科学※生物工程
PCR ，结果见图2。可知，1～9道 (退火温度40.1～49.5℃) 都得到了大小约1.1kb 的特异带，与预期相符。其中，8～9道 (48.5～49.5℃) 无非特异性带，其PCR 产物用 KpnI ＋Eco RI 双酶切后插入pUC19，筛选重组子，重组质粒命名为pUC19-TglaA 。
测序结果表明，泡盛曲霉gla A 终止子片段长1034
M 123456789
947bp →
1～9.PCR 产物，退火温度为40.1、41.9、43.4、44.6、45.6、46.5、47.4、48.5、49.5℃；M. λ/Eco RI+Hin dIII DNA Marker。
图2 泡盛曲霉gla A 终止子梯度PCR
Fig.2 Gradient PCR of A.awamori gla A terminator
bp ，序列已提交GenBank (登记号：EF428456) 。该序列与 GenBank上报道的泡盛曲霉gla A 基因的终止子序列有98%的同源性[11]。2.3
外源基因表达盒的构建
从pUC19-PglaA 切下gla A 启动子片段PglaA(Hin dIII ＋Kpn I) ，插入pUC19-TglaA MCS相应位点，得到含有外源基因表达盒的重组质粒pUC19-PTglaA 。重组质粒用Hin dIII+ Kpn I 双酶切鉴定，电泳结果与预期相符(图略) ，表明Pgla A 片段已经插入pUC19-TglaA 。外源基因表达盒为Pgla A (包括ATG-SS)-Bss HII-Xba I-Kpn I-TAG-TglaA 。2.4
用于农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体pSUAA52am 的构建
构建农杆菌介导的泡盛曲霉表达载体采用了图3所示策略：以根瘤农杆菌双元载体pCAMBIA1302为骨架，保留大肠杆菌和农杆菌介导转化必需区段；删除非必需区段以减小构建载体的大小；消除部分限制酶位点以方便外源基因的克隆操作；插入外源基因表达盒；最后插入丝状真菌潮霉素抗性标记。具体操作见“材料与方法”。
经过筛选，随机挑取了2个重组子经Hin dIII ＋Bgl II 双酶切验证，电泳结果显示(图4) ，2个重组质粒均切下了一条约4.0kb 的特异带，表明潮霉素抗性标记已插入pCAMIII 的Hin dIII-Bgl II 之间。该重组质粒带有外源基因表达盒(由gla A 启动子、信号肽序列SS 及终止子构成，SS 后带有多克隆位点) 、适合丝状真菌转化的潮
霉素抗性标记、以及大肠杆菌与根瘤农杆菌转化的必需元件，命名为pSUAA52am(图3) 。2.5
表达载体的转化
Hin Pst1d111
Bg111CaMV35s 启动子Kpn Eco R1
1
Spel CaMV35S mGFP5启动子
Xho l Bss Nos poly-A
H11
潮霉素(R)pCAMB1A1302Bss T-Border(H11
右)
CaMV35S poly-AXho l (10549bp)T-Border(左) pVS1 sta卡那霉素(R)
pBR322 oripBR322 bom
pVS1 repKpn Hin d111TtrPC
Xba 1Bss H11
l TglaA Eco R1潮霉素(R)
PgpdA
SS
Bg 111PglaA
T-Border(右) Xho l
pSUAA52am
T-Border(左) (13783bp)
pVS1 sta
卡那霉素pBR322ori
(R)
pVS1 rep
pBR322 bom
信号肽Gla A、KexB 和NMCS 的核苷酸和氨基酸序列：1 ATG TCG TTC CGA TCT CTA CTC GCC CTG AGC1 Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser31 GGC CTC GTC TGC ACA GGG TTG GCA AAT GTG11 Gly Leu Val Cys Thr Gly Leu Ala Asn Val
BssHLL Xbal KpnI
图3 用于农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体pSUAA52am 的构建Fig.3 Construction of Agrobacterium -mediated A. awamori
expression vector pSUAA52am
M 123
21226bp →5148bp 4268bp →
3530bp →→
831bp →564bp →
M. λ/Eco RI+Hin dIII DNA Marker；1~2. pCAMIII重组子/Hin dIII +BglII ；3. pCAMIII/Hin dIII+Bgl II(对照) 。
图4 pCAMIII重组质粒Hin dIII ＋Bgl II 双酶切鉴定
Fig.4 Identification of pCAMIII recombinants with Hin dIII+Bgl II
digestion
※生物工程食品科学
2009, Vol. 30, No. 01185
表达载体pSUAA52am 分别用原生质体法和农杆菌介导法转化泡盛曲霉分生孢子，在含潮霉素(终浓度200μg/ml)选择平板上筛选潮霉素抗性转化子，结果见表1。
表1表明，传统的原生质体转化法转化效率仅为21
表1 不同转化方法的转化效率
Table 1 Transformation efficiencies with different transformation
methods
转化方法转化效率(转化子/106 孢子)
倍数原生质体转化法211农杆菌介导转化法
1106
53
个转化子/106分生孢子，转化效率低下。农杆菌介导法直接转化分生孢子达1106个转化子/106分生孢子，转化效率是原生质体法的53倍，表明高效表达载体pSUAA52am 构建成功。3
讨 论
本实验克隆到的泡盛曲霉糖化酶高效表达菌株SG1的糖化酶gla A 基因启动子序列与Fowler 报道的黑曲霉ATCC10864菌株的gla A 基因5’-区段序列(启动子部分) 只有64%同源性[10]，而终止子序列与 GenBank上报道的泡盛曲霉菌株gla A 基因的终止子序列有98%的同源性[11]，信号肽序列则与上述黑曲霉及泡盛曲霉菌株都有100%的同源性，提示不同菌株同源基因表达水平的高低主要取决于基因启动子功能的强弱。泡盛曲霉中内源基因分泌表达的高水平与外源基因分泌表达的低水平形成强烈反差[1]，由于影响因素众多，本研究在构建表达载体时，直接采用了泡盛曲霉高效表达菌株SG1糖化酶基因的强启动子、信号肽及终止子序列构建外源基因表达盒，使外源基因的表达元件尽可能与糖化酶基因天然的高效表达元件保持一致，为外源基因的高效表达创造条件。
设计MCS 时考虑了MCS 核苷酸序列翻译后的氨基酸组成和密码子偏爱性，表达载体上的g l a A 信号肽、KexB 切点及MCS 核苷酸序列与氨基酸组成见图3。MCS 设计了3个限制酶位点，其中Bss HII 是gla A 信号肽序列自带位点，Xba I 与Kpn I 之间为以后根据需要加入新限制酶位点预留了空间(引入额外碱基GCGG 是为了提高Xba I 、Kpn I 酶切效率) ，Lys 和Arg 为gla A 信号肽末尾两个氨基酸，是KexB 识别序列，Lys 、Arg 与Ala 之间为K e x B 切割位点(图3中箭头所示) 。研究表明，KexB 旁侧氨基酸种类对切割效率有显著影响，其中旁侧氨基酸为非极性小分子量氨基酸时对KexB 切割影响较小，尤其是旁侧氨基酸是甘氨酸(Gly) 时影响最小，几乎可以保留90%以上的切割效率[15-16]。因此，为了尽可能不影响KexB 的切割，设计时保留了信号肽KexB 切
点后紧邻信号肽的糖化酶多肽自身的第一个氨基酸——丙氨酸(A l a ) ，并在其后设计了连续4个甘氨酸。甘氨酸侧链R 基为H ，是最小氨基酸，非极性，有“柔性氨基酸”之称，1个Ala 和4个Gly 形成一条柔性短肽链，连接信号肽和融合蛋白，以减少对KexB 切割活性的影响，并使信号肽和融合蛋白两个空间结构相对独立，以保持融合蛋白的天然活性。
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