内蒙古大学生命科学学院生物系
生物化学实验室
生物化学大实验结题报告
论文题目：重组细菌性碱性磷酸酶的分离、 纯化及特性分析
学生姓名：
年 级：
专 业：
指导教师：
2011年xx 月xx 日
重组细菌性碱性磷酸酶的分离、纯化及特性分析
X X
（xxxxxxxxxxxxxxxxxxx(地址) ）
摘 要: 将外源基因BAP 克隆在含有lac 启动子的表达载体coli 中，让其在E. coli 中表达。培养宿主菌，在培养基中加入诱导物IPTG （异丙基硫代-β-D-半乳糖），使阻遏蛋白不能与操纵基因结合，而外源基因大量转录并高效表达。将宿主菌进行超声波破碎，用亲和层析柱将蛋白分离纯化，最后SDS-PAGE 检测转录表达蛋白，用Western-blotting 方式分析蛋白特性。
关键词：细菌性碱性磷酸酶；亲和层析；SDS-PAGE ；Western-blotting
碱性磷酸酶是适于在pH 约9-10的条件下水解许多非特异性磷酸单脂而使磷酸游离的磷酸脂酶的总称。它是一种底物专一性低的磷酸单酯酶, 是分子生物学中常用的工具酶之一。它的作用是催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA(或RNA) 片段的5'-Pi 末端转换成5'-OH 末端，这也就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。而提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究。碱性磷酸酶有两种来源：一种是从大肠杆菌种纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase, 简称BAP) ；BAP 属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa 。每个单体由449个氨基酸组成，完整的AKP 分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心，活性中心区域由Asp101-Ser102-Ala103三连体、Arg166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。细菌性碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。其最适pH 是8.0。上图为细菌性碱性磷酸酶二级结构。
实验中使用我们在应用基础研究中建立的表达重组His-BAP 的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株，在IPTG 的诱导下表达有活性的重组His-BAP 并通过SDS-PAGE 和Western-blotting 进行鉴定。本实验技术路线：重组蛋白的诱导表达→重组蛋白的亲和层析纯化重组蛋白的分子筛排阻层析纯化→SDS-PAGE 电泳及Western-blot 鉴定重组蛋白→重组蛋白活性的检测。
1 材料与试剂
1.1 菌种
大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)
1.2 实验试剂
葡聚糖G-75干粉、 Tris-HCl、NaCl 、标准蛋白、IPTG （异丙基硫代-β-D-半乳糖）、starting buffer 、8 M/L尿素、乙醇、咪唑、Marker 、PVDF 膜、TBS 、吐温、一抗、酶标二抗，牛血清蛋白，糜蛋白酶、PNPP 等试验试剂。
2 方法与步骤
2.1 装柱及标准样品的分子筛层析
把柱子固定在夹子上，打开下面的盖，用取液器匀速加入介质。保证介质均匀沉淀，且要缓慢加入，防止产生气泡。待介质完全沉降打开柱的上盖，剪一与柱内径大小一致的圆形滤纸片放入柱中，沉淀于介质表面。液体接近界面时加入3ml 超纯水，同时在层析杯中加入100ml 超纯水，连接泵洗柱15min ，同时配制平衡液200mL （20mmol Tris-HCl,pH 8.0; 20mmol NaCl）。待液体接近界面时，在柱中加入3ml 平衡液（其余平衡液加到层析杯中），调节流速，控制滴速为3ml/10min（一分钟约6-7滴）。平衡柱过中午。
缓慢向柱中加入样品4ml 打开层析柱上下端，使样品靠重力流出。当样品接近界面时在柱中加入3ml 上样缓冲液（即平衡液），连接泵，调T=100 ，A(0.5A)=0 , 开启记录仪，同时配制100ml 0.1M Nacl。待两个峰都出来后，把层析杯中的液体换为0.1M Nacl洗柱20min ，再用超纯水洗柱30min ，封柱，关机。
2.2 BAP的诱导表达
在5ml 培养基中加入Amp 2.5μl （母液为100mg/ml）和10μl 菌液。在摇床上37℃ 130转过夜预培养。之后取预培养的菌液2.5ml ，将菌液加入50ml 含有Amp (25μl) 的LB 培养基中以1:20的比例扩增。在37℃恒温摇床，以180-200rpm 培养40-60min 左右。之后加入终浓度为1mM 的IPTG(500μl) 进行外源基因的诱导表达。于室温诱导4-5小时。取出诱导细胞进行细胞超声破碎，留1ml 破碎前菌液， 处理后进行western 及PAGE ，其余放入冰箱于4度保存。
2.3 BAP的亲和层析纯化
2.3.1 盐酸胍破碎
将100ml 诱导后的菌液分别放于大离心管中，配平，5000rpm 离心15min 。弃去上清液加入1/10体积PH8.0磷酸钠缓冲液（20mM ）重悬后5000rpm 离心10min ，去上清。在沉淀中加入1/10体积的6M 的盐酸胍溶液（注：盐酸胍要用20mM 的磷酸钠缓冲液溶解）。用玻动棒搅开后在30℃的摇床10min 。分装于1.5ml 离心管中，12000rpm 离心10imn ，取上清，上样（留100μl 上样前的蛋白样品）。
2.3.2 超声波破碎
诱导后的菌体置于大离心管中，5000rpm 离心15min ，弃上清。加入1/10体积的破碎缓冲液洗涤。离心15min 5000rpm 去上清，加入破碎缓冲液及终浓度为50μl/5ml的溶菌酶（现用现配，母液100mg/ml）。 30℃温浴15min 。（离心时调好30℃的水浴摇床）。在冰浴条件下，60%功率超声处理5min （具体做法是每管中0.5ml 样品，每五管一组，放于冰浴中连续处理，每管4秒，再重复，直到处理5min 为止。再用40%功率超声处理5min ）。
超声要求a 将菌液处理至清亮；b 始终保持低温环境；c 避免出现黑色沉淀。将超声处理后的样品于4℃ 2000rpm离心10min ，沉淀为细胞碎片弃去。上清再于4℃ 12000rpm离心10min 。上清为可溶性蛋白，沉淀为包涵体。（包涵体留样1ml ，可溶性蛋白留样100μl ）。
2.4 上亲和柱
每柱中装1.5ml 的介质、乙醇混合液（混合后加）。打开底下的帽，待液体滴至界面时加入5柱体积约4ml 的超纯水洗5遍，然后加入5柱体积的storting buffer ，5遍平衡柱。待液体接近界面时，用取液器将可溶性蛋白样品加入亲和柱。（盐酸胍破碎）。可少上一些样品，根据流速确定上样量。超声波破碎的要全部上样。并且根据流速可以上2-3次。待样品流到界面时，用含10mM 咪唑的淋洗液洗10柱体积。（注意：咪唑用破碎缓冲液稀释）。用3ml 含有300mM 咪唑的洗脱液洗脱，并且用eppendorf 管收集每管500μl 。（留样100μl ）其余的洗脱样品用于离子交换层析。
2.5 BAP的分子筛排阻层析
亲和层析的样品第2、3、4管分别取400µl混匀于1.5ml 离心管中上柱，重力使之渗入柱子。样品接近界面时，加入1ml 起始缓冲液。打开泵开始收集（加样时即打开读纸器），在峰顶处留样测定酶活。关读纸机。然后用20ml 0.1M Nacl 的处理柱子。洗柱，用超纯水洗30min 左右。
2.6 SDS-PAGE
2.6.1样品处理
包涵体处理：在留样的沉淀中加入500μl 8M的尿素，摇匀。取20μl 于
1.5ml 离心管中，再加入50μl 上样缓冲液，于100℃沸水中煮沸5min 。菌体处理：将留样的1ml 菌体于12000rpm 离心1min ，用滤纸吸干残液，用100μl 上样缓冲液重悬菌体，100℃沸水中煮沸5min 。亲和层析样品处理：取亲和层析样品，2和3号管各20μl 于1.5ml 离心管中，再加入20μl 上样缓冲液，于100℃沸水中煮沸5min 。待样品冷却后12000rpm 离心5min 。
2.6.2清洗安装
清洗电泳槽，玻璃板（用海绵块洗），胶条等电泳装置，然后用卫生纸轻轻吸水晾干。组装玻璃板（凹面向外），封胶条，要贴紧玻璃板，胶条下端要平直并且胶条始终要自然弹性范围不要用力拽。每组装好后让老师检查后再去灌胶。
2.6.3分离胶及浓缩胶的配置
准备一个小烧杯，按照实验讲义的配方配。12%的分离胶，混匀后立即用取液器加入玻璃板中，加至红线处。然后加入1ml 的超纯水。静置30min 。待胶凝固后倾斜倒出超纯水。用滤纸吸干残液。
配5%浓缩胶，混匀后立即加入插上梳子的玻璃板面，直至没过柱子与玻璃板凹面相平。静置30min 。
2.6.4 准备及电泳
待浓缩胶凝固后垂直拔下梳子，取出玻璃板，除去胶条，使玻璃板凹面向内重新组装，然后向内外槽加入电极缓冲液（内槽一定要加满）。
按顺序依次点样，两块胶一块做SDS 染色（普通Marker ），另一块做western 杂交（点预染Marker ）。Marker 要提前处理。
将电泳装置与电泳电源连接（注意正负极）。调电压60V 。待溴酚蓝前沿进入分离胶后，换成90V 电压，直到溴酚蓝前沿跑出胶，再过半小时，关闭电源停
止电泳。
2.6.4 电泳胶处理
电泳完毕后，卸下玻璃板，小心撬开。用手术刀切去浓缩胶。将点有普通Marker 的胶浸泡在染色液中。染色→脱色→水洗（过夜）。预染Marker 的胶进行转膜处理。
清洗电泳槽，玻璃板，胶条等电泳装置，然后用滤纸轻轻吸水晾干。组装玻璃板（凹面向外），封胶条要贴紧玻璃板，胶条下端要平直，并且胶条始终要自然弹性范围不要用力拽。准备一个小烧杯，配制12%的分离胶，混匀后立即用取液器加入玻璃板中，加至红线处。再加入1ml 的超纯水，静置30min 。待胶凝固后倾斜倒出超纯水。用滤纸吸干残液。配制5%浓缩胶，混匀后立即加入插上梳子的玻璃板面，直至没过柱子与玻璃板凹面相平。静置30min 。待浓缩胶凝固后垂直拔下梳子，取出玻璃板，除去胶条，使玻璃板凹面向内重新组装，然后向内外槽加入电极缓冲液。按顺序依次点样，两块胶一块做SDS 染色（普通Marker ），另一块做western 杂交（点预染Marker ）。Marker 要提前处理。
将电泳装置与电泳电源连接。调电压60V 。待溴酚蓝前沿进入分离胶后，换成90V 电压，直到溴酚蓝前沿跑出胶，再过半小时，关闭电源停止电泳。电泳完毕后，卸下玻璃板，小心撬开。用手术刀切去浓缩胶。将点有普通Marker 的胶浸泡在染色液中。染色→脱色→水洗（过夜）。预染Marker 的胶进行转膜处理。
清洗转移电泳槽等装置。蒸馏水漂洗点有预染Marker 的胶。然后浸泡在转移缓冲液中。戴上手套用镊子夹住PVDF 膜。先在甲醇中精确处理15秒。然后放入蒸馏水槽中漂洗一下，最后放于盛有转移缓冲液的盆中平衡15min 。同时将4片滤纸2块海绵浸泡在转移缓冲液中。尽量用玻璃棒赶去海绵中的气泡（否则易短路）。按照阴极黑板—海绵垫—2层滤纸—凝胶—PVDF 膜—2层滤纸—海绵垫—阳极红板的顺序装。80mA 恒流下在转移电泳槽中冰浴电泳2.5小时。取出PVDF 膜放于干燥滤纸上片刻，但不要吸干膜。灭菌去离子水中冲洗。
将PVDF 膜放入玻璃平皿中加入封闭液（10mlTBS ，10ml ，0.25g 脱脂奶粉），在摇床上封闭2小时。取出PVDF 膜，在1XTBS 中漂洗2次后放入平皿中加入10ml 一抗封闭液（10ml 1×TBS ，5μl 吐温，5μl 一抗，0.5g 奶粉），在脱色摇床上摇10min ，然后4℃过夜孵育。取出膜后在1× TBS中漂洗2次。每次10min 。
放入10ml 二抗封闭液中。孵育2小时。取一片DAB 溶于37℃预热的10m 超纯水。用玻璃棒搅拌至完全溶解。加入20μl 30%的双氧水摇匀。倒入平皿中。将平皿放于抽屉暗处显色5min 。取出膜用灭菌去离子水漂洗终止反应，然后用清水冲洗。
2.7 酶活力测定
取5只1.5mlEP 管标号1—5，向1#管中加入1ml 超纯水。2#加50μl 总蛋白。3#、4#分别加入50μl 亲和层析2号和3号样品。5#中加入1μlBAP 和1ml 灭菌处理过的超纯水（先加水，后加BAP 标准品）。2#、3#、4#、5#管分别加超纯水稀释至1ml 。取5只试管，洗净后标号1—5. 每个试管中加入2ml 底物溶液，再把相应编号的EP 管中的溶液加入试管中。用力混匀。在大烧杯中盛入适量预热37℃预热的水。将试管放入烧杯中，在恒温37℃水浴中反应5min 。在每支试管中加入250μl 1M NaOH 溶液终止反应。在可见分光光度计测量OD410，计算3次平均值。计算酶活力。
3 实验结果计算分析
3.1分子筛层析蛋白峰值图谱
使用自动蛋白核酸分离层析仪连接纸机记录标准蛋白（牛血清蛋白(68kD)、糜蛋白酶(25kD) 2:1混合液）及亲和层析的样品第2、3、4管混合样的出峰图谱。
牛血清蛋白以及糜蛋白酶洗脱体积图
牛血清蛋白洗脱体积
目的蛋白洗脱体积图
目的蛋白洗脱体积图
以上两幅图片为牛血清蛋白、糜蛋白酶和目的蛋白的体积洗脱图，可根据以上二图计算目的蛋白的分子质量。
3.1.1牛血清蛋白洗脱体积
3.1.2糜蛋白洗脱体积
3.1.3目的蛋白分子量的计算
由上述的两种标准蛋白分子量的对数值为横坐标，洗脱值为纵坐标，求两点之间的一条直线。
其中牛血清蛋白的分子量的对数值：ln68 = 1.832。糜蛋白的相对分子量的对数值：ln25=1.400 。由以上数据得直线的方程式为y+56.9x=113.26 。将BAP 的洗脱体积7.6ml 带入上式得出BAP 蛋白的分子量为73KDa 。
3.1.4 结果分析
有活性的天然BAP 是以二聚体的形成存在的，其单体的分子量略大于40KDa ，工程菌表达的从组His-BAP
由于带有融合标签而使分子量偏大，如果有活性的二聚体则分子量应该大于70KDa ，而本实验求的BAP 分子量为73KDa 。 3.2 SDS-PAGE电泳鉴定
以普通Marker 为对照对已经过处理的总蛋白、包涵体、亲和层析样品进行
SDS-PAGE 电泳分析。电泳结果显示，各样品特异性较好；目的蛋白处于第8和
第9条带之间，与普通Marker 条带对比图对比可知，该目的蛋白的kD 大概为48，符合预期结果。
图3.2-1凝胶电泳图
图 2.4-1 印记实验图
由以上两幅图对照可得出，BAP 表达蛋白的分子量在43KDa —55KDa 之间，符合目的蛋白预期结果。
3.3 酶活力计算及分析
3.3.1 数据记录
使用可见光分光光度计分别检测1#管中的1ml 超纯水；2#管着中的50μl 总蛋白+950μl 超纯水；3#管中的50μl 分子筛峰处样+950μl 超纯水，4#-50μl 亲和层析3号样+950μl 超纯水。5#-1μlBAP 和1ml 灭菌处理过的超纯水（先加水，后加BAP 标准品），OD 值。
因此由酶活力单位数计算公式：OD 410样品⨯稀释倍数×0.45U OD 410标准品⨯稀释倍数
亲和层析样品2酶活力单位数为：
亲和层析样品3酶活力单位数为：2. 095⨯20×0.45U=8.89×10-3 U 2. 120⨯10003. 000⨯20×0.45U=8.89×10-3 U 2. 120⨯1000
3.4 mg蛋白
mg 蛋白计算公式：mg 蛋白 = 蛋白浓度（mg/ml）× 蛋白体积
表 3.4-1 mg蛋白记录表
3.5酶比活力计算
酶的比活力=酶活力单位数/mg蛋白
表 3.5-1 mg蛋白记录
3.6蛋白质浓度的测定数
表3.6—1 样品OD
280
、OD 260值
由蛋白质浓度计算公式：
蛋白浓度（mg/ml）=1.45OD280（×稀释倍数）—0.74OD 260（×稀释倍数）得：
离子交换层析后，蛋白浓度很低，OD260可能为负值。蛋白浓度可以用另一经验公式：
蛋白浓度
0.54mg/ml
OD280×稀释释倍数
可计算出下表：
4 讨论
4.1 IPTG诱导表达
外源基因克隆在含有lac 启动子的表达载体中，让其在E.coli 中表达。先让宿主菌生长，阻遏蛋白与lac 操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及
表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac 操纵子的诱导物IPTG ，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量并高效表达。表达蛋白可经SDS-PAGE 电泳检测或做Western-blot 鉴定，用抗体识别。 4.2 亲和层析纯化蛋白的优缺点
亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。 载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配机本身要经过分离纯化，配基与载体偶联条件激烈。
参考文献
1. 生物学实验教程. 滕利荣，孟庆繁. 北京：科学出版社，2008， 2. 现代生化教程. 郭勇. 北京：科学出版社，2004，
3. 生物化学技术原理及应用. 赵永芳. 北京：科学出版社，2002。
内蒙古大学生命科学学院生物系
生物化学实验室
生物化学大实验结题报告
论文题目：重组细菌性碱性磷酸酶的分离、 纯化及特性分析
学生姓名：
年 级：
专 业：
指导教师：
2011年xx 月xx 日
重组细菌性碱性磷酸酶的分离、纯化及特性分析
X X
（xxxxxxxxxxxxxxxxxxx(地址) ）
摘 要: 将外源基因BAP 克隆在含有lac 启动子的表达载体coli 中，让其在E. coli 中表达。培养宿主菌，在培养基中加入诱导物IPTG （异丙基硫代-β-D-半乳糖），使阻遏蛋白不能与操纵基因结合，而外源基因大量转录并高效表达。将宿主菌进行超声波破碎，用亲和层析柱将蛋白分离纯化，最后SDS-PAGE 检测转录表达蛋白，用Western-blotting 方式分析蛋白特性。
关键词：细菌性碱性磷酸酶；亲和层析；SDS-PAGE ；Western-blotting
碱性磷酸酶是适于在pH 约9-10的条件下水解许多非特异性磷酸单脂而使磷酸游离的磷酸脂酶的总称。它是一种底物专一性低的磷酸单酯酶, 是分子生物学中常用的工具酶之一。它的作用是催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA(或RNA) 片段的5'-Pi 末端转换成5'-OH 末端，这也就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。而提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究。碱性磷酸酶有两种来源：一种是从大肠杆菌种纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase, 简称BAP) ；BAP 属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa 。每个单体由449个氨基酸组成，完整的AKP 分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心，活性中心区域由Asp101-Ser102-Ala103三连体、Arg166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。细菌性碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。其最适pH 是8.0。上图为细菌性碱性磷酸酶二级结构。
实验中使用我们在应用基础研究中建立的表达重组His-BAP 的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株，在IPTG 的诱导下表达有活性的重组His-BAP 并通过SDS-PAGE 和Western-blotting 进行鉴定。本实验技术路线：重组蛋白的诱导表达→重组蛋白的亲和层析纯化重组蛋白的分子筛排阻层析纯化→SDS-PAGE 电泳及Western-blot 鉴定重组蛋白→重组蛋白活性的检测。
1 材料与试剂
1.1 菌种
大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)
1.2 实验试剂
葡聚糖G-75干粉、 Tris-HCl、NaCl 、标准蛋白、IPTG （异丙基硫代-β-D-半乳糖）、starting buffer 、8 M/L尿素、乙醇、咪唑、Marker 、PVDF 膜、TBS 、吐温、一抗、酶标二抗，牛血清蛋白，糜蛋白酶、PNPP 等试验试剂。
2 方法与步骤
2.1 装柱及标准样品的分子筛层析
把柱子固定在夹子上，打开下面的盖，用取液器匀速加入介质。保证介质均匀沉淀，且要缓慢加入，防止产生气泡。待介质完全沉降打开柱的上盖，剪一与柱内径大小一致的圆形滤纸片放入柱中，沉淀于介质表面。液体接近界面时加入3ml 超纯水，同时在层析杯中加入100ml 超纯水，连接泵洗柱15min ，同时配制平衡液200mL （20mmol Tris-HCl,pH 8.0; 20mmol NaCl）。待液体接近界面时，在柱中加入3ml 平衡液（其余平衡液加到层析杯中），调节流速，控制滴速为3ml/10min（一分钟约6-7滴）。平衡柱过中午。
缓慢向柱中加入样品4ml 打开层析柱上下端，使样品靠重力流出。当样品接近界面时在柱中加入3ml 上样缓冲液（即平衡液），连接泵，调T=100 ，A(0.5A)=0 , 开启记录仪，同时配制100ml 0.1M Nacl。待两个峰都出来后，把层析杯中的液体换为0.1M Nacl洗柱20min ，再用超纯水洗柱30min ，封柱，关机。
2.2 BAP的诱导表达
在5ml 培养基中加入Amp 2.5μl （母液为100mg/ml）和10μl 菌液。在摇床上37℃ 130转过夜预培养。之后取预培养的菌液2.5ml ，将菌液加入50ml 含有Amp (25μl) 的LB 培养基中以1:20的比例扩增。在37℃恒温摇床，以180-200rpm 培养40-60min 左右。之后加入终浓度为1mM 的IPTG(500μl) 进行外源基因的诱导表达。于室温诱导4-5小时。取出诱导细胞进行细胞超声破碎，留1ml 破碎前菌液， 处理后进行western 及PAGE ，其余放入冰箱于4度保存。
2.3 BAP的亲和层析纯化
2.3.1 盐酸胍破碎
将100ml 诱导后的菌液分别放于大离心管中，配平，5000rpm 离心15min 。弃去上清液加入1/10体积PH8.0磷酸钠缓冲液（20mM ）重悬后5000rpm 离心10min ，去上清。在沉淀中加入1/10体积的6M 的盐酸胍溶液（注：盐酸胍要用20mM 的磷酸钠缓冲液溶解）。用玻动棒搅开后在30℃的摇床10min 。分装于1.5ml 离心管中，12000rpm 离心10imn ，取上清，上样（留100μl 上样前的蛋白样品）。
2.3.2 超声波破碎
诱导后的菌体置于大离心管中，5000rpm 离心15min ，弃上清。加入1/10体积的破碎缓冲液洗涤。离心15min 5000rpm 去上清，加入破碎缓冲液及终浓度为50μl/5ml的溶菌酶（现用现配，母液100mg/ml）。 30℃温浴15min 。（离心时调好30℃的水浴摇床）。在冰浴条件下，60%功率超声处理5min （具体做法是每管中0.5ml 样品，每五管一组，放于冰浴中连续处理，每管4秒，再重复，直到处理5min 为止。再用40%功率超声处理5min ）。
超声要求a 将菌液处理至清亮；b 始终保持低温环境；c 避免出现黑色沉淀。将超声处理后的样品于4℃ 2000rpm离心10min ，沉淀为细胞碎片弃去。上清再于4℃ 12000rpm离心10min 。上清为可溶性蛋白，沉淀为包涵体。（包涵体留样1ml ，可溶性蛋白留样100μl ）。
2.4 上亲和柱
每柱中装1.5ml 的介质、乙醇混合液（混合后加）。打开底下的帽，待液体滴至界面时加入5柱体积约4ml 的超纯水洗5遍，然后加入5柱体积的storting buffer ，5遍平衡柱。待液体接近界面时，用取液器将可溶性蛋白样品加入亲和柱。（盐酸胍破碎）。可少上一些样品，根据流速确定上样量。超声波破碎的要全部上样。并且根据流速可以上2-3次。待样品流到界面时，用含10mM 咪唑的淋洗液洗10柱体积。（注意：咪唑用破碎缓冲液稀释）。用3ml 含有300mM 咪唑的洗脱液洗脱，并且用eppendorf 管收集每管500μl 。（留样100μl ）其余的洗脱样品用于离子交换层析。
2.5 BAP的分子筛排阻层析
亲和层析的样品第2、3、4管分别取400µl混匀于1.5ml 离心管中上柱，重力使之渗入柱子。样品接近界面时，加入1ml 起始缓冲液。打开泵开始收集（加样时即打开读纸器），在峰顶处留样测定酶活。关读纸机。然后用20ml 0.1M Nacl 的处理柱子。洗柱，用超纯水洗30min 左右。
2.6 SDS-PAGE
2.6.1样品处理
包涵体处理：在留样的沉淀中加入500μl 8M的尿素，摇匀。取20μl 于
1.5ml 离心管中，再加入50μl 上样缓冲液，于100℃沸水中煮沸5min 。菌体处理：将留样的1ml 菌体于12000rpm 离心1min ，用滤纸吸干残液，用100μl 上样缓冲液重悬菌体，100℃沸水中煮沸5min 。亲和层析样品处理：取亲和层析样品，2和3号管各20μl 于1.5ml 离心管中，再加入20μl 上样缓冲液，于100℃沸水中煮沸5min 。待样品冷却后12000rpm 离心5min 。
2.6.2清洗安装
清洗电泳槽，玻璃板（用海绵块洗），胶条等电泳装置，然后用卫生纸轻轻吸水晾干。组装玻璃板（凹面向外），封胶条，要贴紧玻璃板，胶条下端要平直并且胶条始终要自然弹性范围不要用力拽。每组装好后让老师检查后再去灌胶。
2.6.3分离胶及浓缩胶的配置
准备一个小烧杯，按照实验讲义的配方配。12%的分离胶，混匀后立即用取液器加入玻璃板中，加至红线处。然后加入1ml 的超纯水。静置30min 。待胶凝固后倾斜倒出超纯水。用滤纸吸干残液。
配5%浓缩胶，混匀后立即加入插上梳子的玻璃板面，直至没过柱子与玻璃板凹面相平。静置30min 。
2.6.4 准备及电泳
待浓缩胶凝固后垂直拔下梳子，取出玻璃板，除去胶条，使玻璃板凹面向内重新组装，然后向内外槽加入电极缓冲液（内槽一定要加满）。
按顺序依次点样，两块胶一块做SDS 染色（普通Marker ），另一块做western 杂交（点预染Marker ）。Marker 要提前处理。
将电泳装置与电泳电源连接（注意正负极）。调电压60V 。待溴酚蓝前沿进入分离胶后，换成90V 电压，直到溴酚蓝前沿跑出胶，再过半小时，关闭电源停
止电泳。
2.6.4 电泳胶处理
电泳完毕后，卸下玻璃板，小心撬开。用手术刀切去浓缩胶。将点有普通Marker 的胶浸泡在染色液中。染色→脱色→水洗（过夜）。预染Marker 的胶进行转膜处理。
清洗电泳槽，玻璃板，胶条等电泳装置，然后用滤纸轻轻吸水晾干。组装玻璃板（凹面向外），封胶条要贴紧玻璃板，胶条下端要平直，并且胶条始终要自然弹性范围不要用力拽。准备一个小烧杯，配制12%的分离胶，混匀后立即用取液器加入玻璃板中，加至红线处。再加入1ml 的超纯水，静置30min 。待胶凝固后倾斜倒出超纯水。用滤纸吸干残液。配制5%浓缩胶，混匀后立即加入插上梳子的玻璃板面，直至没过柱子与玻璃板凹面相平。静置30min 。待浓缩胶凝固后垂直拔下梳子，取出玻璃板，除去胶条，使玻璃板凹面向内重新组装，然后向内外槽加入电极缓冲液。按顺序依次点样，两块胶一块做SDS 染色（普通Marker ），另一块做western 杂交（点预染Marker ）。Marker 要提前处理。
将电泳装置与电泳电源连接。调电压60V 。待溴酚蓝前沿进入分离胶后，换成90V 电压，直到溴酚蓝前沿跑出胶，再过半小时，关闭电源停止电泳。电泳完毕后，卸下玻璃板，小心撬开。用手术刀切去浓缩胶。将点有普通Marker 的胶浸泡在染色液中。染色→脱色→水洗（过夜）。预染Marker 的胶进行转膜处理。
清洗转移电泳槽等装置。蒸馏水漂洗点有预染Marker 的胶。然后浸泡在转移缓冲液中。戴上手套用镊子夹住PVDF 膜。先在甲醇中精确处理15秒。然后放入蒸馏水槽中漂洗一下，最后放于盛有转移缓冲液的盆中平衡15min 。同时将4片滤纸2块海绵浸泡在转移缓冲液中。尽量用玻璃棒赶去海绵中的气泡（否则易短路）。按照阴极黑板—海绵垫—2层滤纸—凝胶—PVDF 膜—2层滤纸—海绵垫—阳极红板的顺序装。80mA 恒流下在转移电泳槽中冰浴电泳2.5小时。取出PVDF 膜放于干燥滤纸上片刻，但不要吸干膜。灭菌去离子水中冲洗。
将PVDF 膜放入玻璃平皿中加入封闭液（10mlTBS ，10ml ，0.25g 脱脂奶粉），在摇床上封闭2小时。取出PVDF 膜，在1XTBS 中漂洗2次后放入平皿中加入10ml 一抗封闭液（10ml 1×TBS ，5μl 吐温，5μl 一抗，0.5g 奶粉），在脱色摇床上摇10min ，然后4℃过夜孵育。取出膜后在1× TBS中漂洗2次。每次10min 。
放入10ml 二抗封闭液中。孵育2小时。取一片DAB 溶于37℃预热的10m 超纯水。用玻璃棒搅拌至完全溶解。加入20μl 30%的双氧水摇匀。倒入平皿中。将平皿放于抽屉暗处显色5min 。取出膜用灭菌去离子水漂洗终止反应，然后用清水冲洗。
2.7 酶活力测定
取5只1.5mlEP 管标号1—5，向1#管中加入1ml 超纯水。2#加50μl 总蛋白。3#、4#分别加入50μl 亲和层析2号和3号样品。5#中加入1μlBAP 和1ml 灭菌处理过的超纯水（先加水，后加BAP 标准品）。2#、3#、4#、5#管分别加超纯水稀释至1ml 。取5只试管，洗净后标号1—5. 每个试管中加入2ml 底物溶液，再把相应编号的EP 管中的溶液加入试管中。用力混匀。在大烧杯中盛入适量预热37℃预热的水。将试管放入烧杯中，在恒温37℃水浴中反应5min 。在每支试管中加入250μl 1M NaOH 溶液终止反应。在可见分光光度计测量OD410，计算3次平均值。计算酶活力。
3 实验结果计算分析
3.1分子筛层析蛋白峰值图谱
使用自动蛋白核酸分离层析仪连接纸机记录标准蛋白（牛血清蛋白(68kD)、糜蛋白酶(25kD) 2:1混合液）及亲和层析的样品第2、3、4管混合样的出峰图谱。
牛血清蛋白以及糜蛋白酶洗脱体积图
牛血清蛋白洗脱体积
目的蛋白洗脱体积图
目的蛋白洗脱体积图
以上两幅图片为牛血清蛋白、糜蛋白酶和目的蛋白的体积洗脱图，可根据以上二图计算目的蛋白的分子质量。
3.1.1牛血清蛋白洗脱体积
3.1.2糜蛋白洗脱体积
3.1.3目的蛋白分子量的计算
由上述的两种标准蛋白分子量的对数值为横坐标，洗脱值为纵坐标，求两点之间的一条直线。
其中牛血清蛋白的分子量的对数值：ln68 = 1.832。糜蛋白的相对分子量的对数值：ln25=1.400 。由以上数据得直线的方程式为y+56.9x=113.26 。将BAP 的洗脱体积7.6ml 带入上式得出BAP 蛋白的分子量为73KDa 。
3.1.4 结果分析
有活性的天然BAP 是以二聚体的形成存在的，其单体的分子量略大于40KDa ，工程菌表达的从组His-BAP
由于带有融合标签而使分子量偏大，如果有活性的二聚体则分子量应该大于70KDa ，而本实验求的BAP 分子量为73KDa 。 3.2 SDS-PAGE电泳鉴定
以普通Marker 为对照对已经过处理的总蛋白、包涵体、亲和层析样品进行
SDS-PAGE 电泳分析。电泳结果显示，各样品特异性较好；目的蛋白处于第8和
第9条带之间，与普通Marker 条带对比图对比可知，该目的蛋白的kD 大概为48，符合预期结果。
图3.2-1凝胶电泳图
图 2.4-1 印记实验图
由以上两幅图对照可得出，BAP 表达蛋白的分子量在43KDa —55KDa 之间，符合目的蛋白预期结果。
3.3 酶活力计算及分析
3.3.1 数据记录
使用可见光分光光度计分别检测1#管中的1ml 超纯水；2#管着中的50μl 总蛋白+950μl 超纯水；3#管中的50μl 分子筛峰处样+950μl 超纯水，4#-50μl 亲和层析3号样+950μl 超纯水。5#-1μlBAP 和1ml 灭菌处理过的超纯水（先加水，后加BAP 标准品），OD 值。
因此由酶活力单位数计算公式：OD 410样品⨯稀释倍数×0.45U OD 410标准品⨯稀释倍数
亲和层析样品2酶活力单位数为：
亲和层析样品3酶活力单位数为：2. 095⨯20×0.45U=8.89×10-3 U 2. 120⨯10003. 000⨯20×0.45U=8.89×10-3 U 2. 120⨯1000
3.4 mg蛋白
mg 蛋白计算公式：mg 蛋白 = 蛋白浓度（mg/ml）× 蛋白体积
表 3.4-1 mg蛋白记录表
3.5酶比活力计算
酶的比活力=酶活力单位数/mg蛋白
表 3.5-1 mg蛋白记录
3.6蛋白质浓度的测定数
表3.6—1 样品OD
280
、OD 260值
由蛋白质浓度计算公式：
蛋白浓度（mg/ml）=1.45OD280（×稀释倍数）—0.74OD 260（×稀释倍数）得：
离子交换层析后，蛋白浓度很低，OD260可能为负值。蛋白浓度可以用另一经验公式：
蛋白浓度
0.54mg/ml
OD280×稀释释倍数
可计算出下表：
4 讨论
4.1 IPTG诱导表达
外源基因克隆在含有lac 启动子的表达载体中，让其在E.coli 中表达。先让宿主菌生长，阻遏蛋白与lac 操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及
表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac 操纵子的诱导物IPTG ，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量并高效表达。表达蛋白可经SDS-PAGE 电泳检测或做Western-blot 鉴定，用抗体识别。 4.2 亲和层析纯化蛋白的优缺点
亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。 载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配机本身要经过分离纯化，配基与载体偶联条件激烈。
参考文献
1. 生物学实验教程. 滕利荣，孟庆繁. 北京：科学出版社，2008， 2. 现代生化教程. 郭勇. 北京：科学出版社，2004，
3. 生物化学技术原理及应用. 赵永芳. 北京：科学出版社，2002。