免疫胶体金技术及其在禽病诊断上的应用
【摘 要】:免疫胶体金技术是一种新型免疫标记技术，与免疫荧光技术、酶联免疫吸附技术和放射免疫测定法
相比更具优越性。本文综述了胶体金技术的发展简史、基本原理、制备方法、标记技术及其在禽病诊断中的应用情况。并对其优缺点进行了评价，对免疫胶体金技术的前景进行了展望。
【关键词】:免疫胶体金、标记蛋白、标记物、禽病诊断
Immunogold Technique and Its Application in the Diagnosis of Avian Diseases
【Abstract】：Immunogold technique is a new type of immune markers, and it has more advantages compared with the immunofluorescence technique, enzyme-linked immunosorbent assay and radioimmunoassay Determination. This paper reviews the development history of the immunogold technique, the basic principles of the preparation method, the marker techniques and their application in the diagnosis of avian diseases ， their advantages and disadvantages of the evaluation and the prospects immunogold technique.
【Keywords】：immunogold; Marker protein; markers; diagnosis of avian diseases
免疫胶体金技术是一种常见的标记技术，它是以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，在光镜、电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术，是继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术。1857年,法拉第用还原法从氯金酸水溶液中制备胶体金，并发现在其中加入少量电解质后，可使胶体金由红色变为蓝色，最终凝集成无色－而加入明胶或其他大分子物质便可阻止这种变化。他的重大发现奠定了胶体金
[1]制备和应用的科学基础。直至1971年Faulk等将胶体金引入免疫化学。此后免疫胶体金技术
[15]作为一种新的免疫学方法，在生物医学领域得到了日益广泛的应用。自Faulk与Taylor在1971
年创立胶体金标记技术以来，Geoghegan应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原，建立了光镜水平的免疫金技术。Danscher在此基础上改进并发展了用银显影液增强光镜金颗粒可见性的免
[2]疫金染色法（IGSS）。Holgate也对此法进行了改进。Leuvcring于1980年最早报道了用胶体金检测人绒毛膜促性腺激素（hCG）的凝集试验，１９８５年起有商品试剂盒供应，从此胶体金
[3]成为免疫学测定方法研究开发的新热点，新的方法和试剂盒层出不穷。
1. 免疫胶体金技术的基本原理
免疫胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应中的一种新型免疫标记技术。胶体金(Couoidal gold)是由氯金酸(HAuCl)水溶液在还原剂作用下，聚合成特定大小的金颗粒，颗粒之间因静电作用形成一种稳定的胶体状态，也称金溶胶(gold s01)。利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团籍静电吸引而形成牢固的结合，这种结合对所标记蛋白质的生物活性无明显影响。除蛋白质分子外，胶体金颗粒还可以与其他多种生[4]
物大分子物质(如毒素、抗生素、激素、核酸、多肽缀合物等)结合。
2. 免疫胶体金的制备
2.1 胶体金的制备
利用还原法可以方便地从氯金酸溶液中制备不同粒径(5-150nm)的胶体金颗粒。胶体金的粒径不同会呈现不同的颜色。常用的制备方法有白磷还原法、抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、鞣酸一柠檬酸三钠还原法、乙醇超声波还原法和硼氢化钠还原法。其中最常用的制备方法为柠檬酸三钠还原法，将0.01％的氯金酸溶液加热至沸腾，快速搅拌的同时迅速加入1％的柠檬酸三钠水溶液，继续加热，溶液颜色由浅黄色逐渐变为浅蓝色、蓝色、蓝紫色、紫红色，最后变为澄清透明的红色。此法制备程序简单，胶体金的颗粒形状、大小较均一。
2.2 胶体金标记蛋白的制备
胶体金标记蛋白的制备，实质上是蛋白质等生物大分子物质被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程[16]。在免疫组织化学中，将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针，用于免疫测定时多简称为免疫胶体金(immunogold)。胶体金对蛋白质的吸附主要取决于标记体系的pH值、电解质浓度、被标记蛋白质用量等因素。在接近于被标记蛋白质的等电点或略偏碱(pH≥pI)时，胶体金颗粒的吸附力最强，制成的胶体金一蛋白质复合物也最稳定，胶体金的酸碱度可用0.1 mol/LK2CO3，或0.1 mol/L HCl调节。金溶胶的pH值可能会损害pH测定计的探头，因此，一般采用精密pH试纸测定其pH值。待标记蛋白质的离子浓度应尽可能小，标记前可用0.005％的氯化钠或双蒸水透析以除去多余的离子。测定待标记蛋白质实际用量时，最好在标记前测定形成稳定胶体金一蛋白质复合物的最小蛋白质需要量，然后按计算结果增加10％，即为待标记蛋白质的实际用量。制备好的胶体金一蛋白质复合物需进一步纯化，以除去未结合的蛋白质或胶体金颗粒，一般采用超速离心法和凝胶过滤法。
3. 免疫胶体金标记技术
3.1 蛋白质的预处理
由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先用低离子强度的水透析。蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。
3.2 选择最适蛋白质用量
将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质5-40ug)加到l ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照，5min后加入0．1 ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2 h，
免疫胶体金技术及其在禽病诊断上的应用
不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白质量再加10％即为最佳标记蛋白质量。
3.3 标记
在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记，蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。按照以上条件作胶体金标记。
4. 免疫胶体金技术在禽病诊断中的应用
随着世界范围内养禽业的规模不断扩大，禽病对养殖的危害也随之加剧。对家禽疾病进行有效防治的关键是快速准确地进行诊断并弄清致病因子。伴随着病原检测技术的进步，免疫胶体金技术以其快速，简便，可单份检测，灵敏度高，特异性强，稳定性好，检测标本种类多等优点开始被逐渐应用于禽病的病原诊断。王长美等用免疫胶体金试验诊断一发病率高、死亡快、疑似禽I型副粘病毒感染的鹅病例，结果为禽流感阴性，根据临床症状和病变情况、免疫胶体金试验以及病毒分离和鉴定，证明该鹅群患禽I型副粘病毒病，实现了对禽1型副粘病毒病的快速鉴别诊断。郝桂兰等利用免疫胶体金试验，采取病死鸽棉拭子样品30min内即完成对一发病鸽群的快速鉴别诊断，排除禽流感病原，通过进一步的鉴定，结果该鸽群患的是禽I型副粘病毒病。王爱华等选择15nm的胶体金颗粒作为标记物，制备了鸡减蛋综合征病毒(EDsv)胶体金试纸条。该试纸条能检出浓度约为1．35“g／mE的纯化EDSV[17][6][5]。程安春等应用银加强胶体金探针检测提纯的鸡减蛋综合征病毒(EDSV)抗原的最低检出量为0．1 1719斗g／mL，以此法检测了人工感染的50只鸡采集的样本，对卵巢、输卵管峡部、咽喉部、软壳蛋的阳性率均为100％，粪便阳性率为92％[7]。王泽霖等采用胶体金标记纯化的羊抗鼠IgG，建立了一种对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)进行检测的银加强金标免疫技fSliver-enhanced colloidal gold assay，SECGA)，SECGA检测抗原可用IBV早期检测，具有群特异性，快速，敏感，简便，结果易判定。朱瑞良等用免疫胶体金试纸膜进行快速检测传染性法氏囊病病毒(IBDV)的研究，试验结果能够识别不同的IB—DV毒株，包括强毒和弱毒，为IBDV的检测开辟了一条新的、快速的途径。 [8]
5. 免疫胶体金技术应用的评价
5.1 免疫胶体金技术的优点
（1）不同环境下的稳定性好、易保存、运输，在室温下可长期保存，不需冷藏。（2）操作简便、易于肉眼观察结果，不需经过特殊复杂培训。（3）操作者安全，对环境无污染。（4）操作快速、短时间获得检测结果，一般10-15分钟即可得出结论，便于大批量筛查。（5）取量少，检测成本均较低，无需特殊仪器。（6）适用范围广泛，检测标本种类多，可用于查血、尿液或 - 3 -
粪便，因而适合各种检查。(7)特异性较强、结果有可重复性。
5.2 免疫胶体金技术的缺点
（1）产品质量相差大，不宜质控，不能确保质量。硝酸纤维素膜的性能和质量，膜孔径大小及均一性，选定膜孑L径的适宜性，结合配体(抗原或抗体)容量的大小，非特异吸附性能，亲水性及液体的流动性和流动速度的均一性等；捕捉配体的量及质量(配体的纯度，亲和力及滴度)及在膜上配体的包被量和均一性。配体划线位置的固定一致性；固相金标记膜中的胶体金和配体的含量和比度，条间的均一性，固相标记物的稳定性，复溶性，复溶速度及流动性，所含缓冲物质的种类及有效促溶剂的使用等；各种膜，甚至包括样品垫是否经过预期处理以减少非特异吸附。（2）存在后带现象，标本需稀释测试。只能定性、不能定量、该方法只作为初筛诊断试剂，用于疾病诊断的辅助检查。硝酸纤维膜的特性，主要反应在其流速上。存在后带现象，标本需稀释测试。产品质量相差大，不宜质控。如：结合垫的性能，金标结合物的量，样品垫的特性，检测线的位置及宽度，硝酸纤维膜和结合垫的叠压强度。捕获抗体的亲合力，检测线包被捕获抗体的量，胶体金颗粒的大小，浓度等，易出现判断结果的误差，不能确保质量[10][9][1]。
6. 免疫胶体金技术的前景展望
自免疫胶体金层析技术作为诊断试剂广泛应用到临床后，由于它的快速简便、准确，具有高度特异性和高敏感性，结果直观可靠，而且试剂和样品用量极少，每个样品只需1～2ul，无需仪器设备，简化了烦琐的常规操作过程，同时也减小了因操作引起的误差，是一种目前发展最快的复合型免疫层析技术[11]。胶体金免疫层析技术与ELISA技术原理不尽相同，前者技术要求更高，实施更为困难。其主要原因在于胶体金免疫层析技术发展快，时间较短；层析材料主要采用国外产品，国内产品尚无法达到要求。胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害，金标记物比酶标记物更稳定，试验结果可以长期保存而不腿色[12]。DICA试验中质控点可用来监测质量和实验操作，保证了整个试验的有效性。目前该技术已经在临床医学检验广泛应用，如激素(早孕、LH等)、传染病病原的抗体和抗原(甲肝、乙肝、丙肝、爱滋病、乙脑、流感等)、性病(梅毒螺旋体抗体、淋球菌等)、细菌(结核杆菌抗体、沙门氏菌抗体等)、寄生虫(弓形虫、包虫、血吸虫、人囊虫等)、肿瘤标记物(甲胎蛋白、血清癌胚抗原等)、心血管病检测标记物(血清心肌钙蛋白等)以及大麻、吗啡、海洛因等[27]。这已经充分显示了该技术的应用前景仍将越来越广阔。该技术在动物医学研究虽然起步较晚，但可喜的是已经有诊断试剂面市，随着该技术的不断研究和发展，必将为兽医临床诊断试剂研究提供更加快
免疫胶体金技术及其在禽病诊断上的应用
速简便、商品化自动化的新途径[28]。该法被认为是微生物和传染病及寄生虫病诊断技术标准化最有前途的新技术之一，并且可以进一步研发定量或半定量检测试纸条以及通用检测试纸条，以促进我国畜牧兽医事业的健康快速和持续发展。
参考文献
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医学报，2000，31(6):497-502
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免疫胶体金技术及其在禽病诊断上的应用
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相比更具优越性。本文综述了胶体金技术的发展简史、基本原理、制备方法、标记技术及其在禽病诊断中的应用情况。并对其优缺点进行了评价，对免疫胶体金技术的前景进行了展望。
【关键词】:免疫胶体金、标记蛋白、标记物、禽病诊断
Immunogold Technique and Its Application in the Diagnosis of Avian Diseases
【Abstract】：Immunogold technique is a new type of immune markers, and it has more advantages compared with the immunofluorescence technique, enzyme-linked immunosorbent assay and radioimmunoassay Determination. This paper reviews the development history of the immunogold technique, the basic principles of the preparation method, the marker techniques and their application in the diagnosis of avian diseases ， their advantages and disadvantages of the evaluation and the prospects immunogold technique.
【Keywords】：immunogold; Marker protein; markers; diagnosis of avian diseases
免疫胶体金技术是一种常见的标记技术，它是以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，在光镜、电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术，是继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术。1857年,法拉第用还原法从氯金酸水溶液中制备胶体金，并发现在其中加入少量电解质后，可使胶体金由红色变为蓝色，最终凝集成无色－而加入明胶或其他大分子物质便可阻止这种变化。他的重大发现奠定了胶体金
[1]制备和应用的科学基础。直至1971年Faulk等将胶体金引入免疫化学。此后免疫胶体金技术
[15]作为一种新的免疫学方法，在生物医学领域得到了日益广泛的应用。自Faulk与Taylor在1971
年创立胶体金标记技术以来，Geoghegan应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原，建立了光镜水平的免疫金技术。Danscher在此基础上改进并发展了用银显影液增强光镜金颗粒可见性的免
[2]疫金染色法（IGSS）。Holgate也对此法进行了改进。Leuvcring于1980年最早报道了用胶体金检测人绒毛膜促性腺激素（hCG）的凝集试验，１９８５年起有商品试剂盒供应，从此胶体金
[3]成为免疫学测定方法研究开发的新热点，新的方法和试剂盒层出不穷。
1. 免疫胶体金技术的基本原理
免疫胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应中的一种新型免疫标记技术。胶体金(Couoidal gold)是由氯金酸(HAuCl)水溶液在还原剂作用下，聚合成特定大小的金颗粒，颗粒之间因静电作用形成一种稳定的胶体状态，也称金溶胶(gold s01)。利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团籍静电吸引而形成牢固的结合，这种结合对所标记蛋白质的生物活性无明显影响。除蛋白质分子外，胶体金颗粒还可以与其他多种生[4]
物大分子物质(如毒素、抗生素、激素、核酸、多肽缀合物等)结合。
2. 免疫胶体金的制备
2.1 胶体金的制备
利用还原法可以方便地从氯金酸溶液中制备不同粒径(5-150nm)的胶体金颗粒。胶体金的粒径不同会呈现不同的颜色。常用的制备方法有白磷还原法、抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、鞣酸一柠檬酸三钠还原法、乙醇超声波还原法和硼氢化钠还原法。其中最常用的制备方法为柠檬酸三钠还原法，将0.01％的氯金酸溶液加热至沸腾，快速搅拌的同时迅速加入1％的柠檬酸三钠水溶液，继续加热，溶液颜色由浅黄色逐渐变为浅蓝色、蓝色、蓝紫色、紫红色，最后变为澄清透明的红色。此法制备程序简单，胶体金的颗粒形状、大小较均一。
2.2 胶体金标记蛋白的制备
胶体金标记蛋白的制备，实质上是蛋白质等生物大分子物质被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程[16]。在免疫组织化学中，将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针，用于免疫测定时多简称为免疫胶体金(immunogold)。胶体金对蛋白质的吸附主要取决于标记体系的pH值、电解质浓度、被标记蛋白质用量等因素。在接近于被标记蛋白质的等电点或略偏碱(pH≥pI)时，胶体金颗粒的吸附力最强，制成的胶体金一蛋白质复合物也最稳定，胶体金的酸碱度可用0.1 mol/LK2CO3，或0.1 mol/L HCl调节。金溶胶的pH值可能会损害pH测定计的探头，因此，一般采用精密pH试纸测定其pH值。待标记蛋白质的离子浓度应尽可能小，标记前可用0.005％的氯化钠或双蒸水透析以除去多余的离子。测定待标记蛋白质实际用量时，最好在标记前测定形成稳定胶体金一蛋白质复合物的最小蛋白质需要量，然后按计算结果增加10％，即为待标记蛋白质的实际用量。制备好的胶体金一蛋白质复合物需进一步纯化，以除去未结合的蛋白质或胶体金颗粒，一般采用超速离心法和凝胶过滤法。
3. 免疫胶体金标记技术
3.1 蛋白质的预处理
由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先用低离子强度的水透析。蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。
3.2 选择最适蛋白质用量
将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质5-40ug)加到l ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照，5min后加入0．1 ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2 h，
免疫胶体金技术及其在禽病诊断上的应用
不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白质量再加10％即为最佳标记蛋白质量。
3.3 标记
在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记，蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。按照以上条件作胶体金标记。
4. 免疫胶体金技术在禽病诊断中的应用
随着世界范围内养禽业的规模不断扩大，禽病对养殖的危害也随之加剧。对家禽疾病进行有效防治的关键是快速准确地进行诊断并弄清致病因子。伴随着病原检测技术的进步，免疫胶体金技术以其快速，简便，可单份检测，灵敏度高，特异性强，稳定性好，检测标本种类多等优点开始被逐渐应用于禽病的病原诊断。王长美等用免疫胶体金试验诊断一发病率高、死亡快、疑似禽I型副粘病毒感染的鹅病例，结果为禽流感阴性，根据临床症状和病变情况、免疫胶体金试验以及病毒分离和鉴定，证明该鹅群患禽I型副粘病毒病，实现了对禽1型副粘病毒病的快速鉴别诊断。郝桂兰等利用免疫胶体金试验，采取病死鸽棉拭子样品30min内即完成对一发病鸽群的快速鉴别诊断，排除禽流感病原，通过进一步的鉴定，结果该鸽群患的是禽I型副粘病毒病。王爱华等选择15nm的胶体金颗粒作为标记物，制备了鸡减蛋综合征病毒(EDsv)胶体金试纸条。该试纸条能检出浓度约为1．35“g／mE的纯化EDSV[17][6][5]。程安春等应用银加强胶体金探针检测提纯的鸡减蛋综合征病毒(EDSV)抗原的最低检出量为0．1 1719斗g／mL，以此法检测了人工感染的50只鸡采集的样本，对卵巢、输卵管峡部、咽喉部、软壳蛋的阳性率均为100％，粪便阳性率为92％[7]。王泽霖等采用胶体金标记纯化的羊抗鼠IgG，建立了一种对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)进行检测的银加强金标免疫技fSliver-enhanced colloidal gold assay，SECGA)，SECGA检测抗原可用IBV早期检测，具有群特异性，快速，敏感，简便，结果易判定。朱瑞良等用免疫胶体金试纸膜进行快速检测传染性法氏囊病病毒(IBDV)的研究，试验结果能够识别不同的IB—DV毒株，包括强毒和弱毒，为IBDV的检测开辟了一条新的、快速的途径。 [8]
5. 免疫胶体金技术应用的评价
5.1 免疫胶体金技术的优点
（1）不同环境下的稳定性好、易保存、运输，在室温下可长期保存，不需冷藏。（2）操作简便、易于肉眼观察结果，不需经过特殊复杂培训。（3）操作者安全，对环境无污染。（4）操作快速、短时间获得检测结果，一般10-15分钟即可得出结论，便于大批量筛查。（5）取量少，检测成本均较低，无需特殊仪器。（6）适用范围广泛，检测标本种类多，可用于查血、尿液或 - 3 -
粪便，因而适合各种检查。(7)特异性较强、结果有可重复性。
5.2 免疫胶体金技术的缺点
（1）产品质量相差大，不宜质控，不能确保质量。硝酸纤维素膜的性能和质量，膜孔径大小及均一性，选定膜孑L径的适宜性，结合配体(抗原或抗体)容量的大小，非特异吸附性能，亲水性及液体的流动性和流动速度的均一性等；捕捉配体的量及质量(配体的纯度，亲和力及滴度)及在膜上配体的包被量和均一性。配体划线位置的固定一致性；固相金标记膜中的胶体金和配体的含量和比度，条间的均一性，固相标记物的稳定性，复溶性，复溶速度及流动性，所含缓冲物质的种类及有效促溶剂的使用等；各种膜，甚至包括样品垫是否经过预期处理以减少非特异吸附。（2）存在后带现象，标本需稀释测试。只能定性、不能定量、该方法只作为初筛诊断试剂，用于疾病诊断的辅助检查。硝酸纤维膜的特性，主要反应在其流速上。存在后带现象，标本需稀释测试。产品质量相差大，不宜质控。如：结合垫的性能，金标结合物的量，样品垫的特性，检测线的位置及宽度，硝酸纤维膜和结合垫的叠压强度。捕获抗体的亲合力，检测线包被捕获抗体的量，胶体金颗粒的大小，浓度等，易出现判断结果的误差，不能确保质量[10][9][1]。
6. 免疫胶体金技术的前景展望
自免疫胶体金层析技术作为诊断试剂广泛应用到临床后，由于它的快速简便、准确，具有高度特异性和高敏感性，结果直观可靠，而且试剂和样品用量极少，每个样品只需1～2ul，无需仪器设备，简化了烦琐的常规操作过程，同时也减小了因操作引起的误差，是一种目前发展最快的复合型免疫层析技术[11]。胶体金免疫层析技术与ELISA技术原理不尽相同，前者技术要求更高，实施更为困难。其主要原因在于胶体金免疫层析技术发展快，时间较短；层析材料主要采用国外产品，国内产品尚无法达到要求。胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害，金标记物比酶标记物更稳定，试验结果可以长期保存而不腿色[12]。DICA试验中质控点可用来监测质量和实验操作，保证了整个试验的有效性。目前该技术已经在临床医学检验广泛应用，如激素(早孕、LH等)、传染病病原的抗体和抗原(甲肝、乙肝、丙肝、爱滋病、乙脑、流感等)、性病(梅毒螺旋体抗体、淋球菌等)、细菌(结核杆菌抗体、沙门氏菌抗体等)、寄生虫(弓形虫、包虫、血吸虫、人囊虫等)、肿瘤标记物(甲胎蛋白、血清癌胚抗原等)、心血管病检测标记物(血清心肌钙蛋白等)以及大麻、吗啡、海洛因等[27]。这已经充分显示了该技术的应用前景仍将越来越广阔。该技术在动物医学研究虽然起步较晚，但可喜的是已经有诊断试剂面市，随着该技术的不断研究和发展，必将为兽医临床诊断试剂研究提供更加快
免疫胶体金技术及其在禽病诊断上的应用
速简便、商品化自动化的新途径[28]。该法被认为是微生物和传染病及寄生虫病诊断技术标准化最有前途的新技术之一，并且可以进一步研发定量或半定量检测试纸条以及通用检测试纸条，以促进我国畜牧兽医事业的健康快速和持续发展。
参考文献
[1] 文杰，林济华，高宇清．维生素C对热应激状态下肉仔鸡生产性能及维生素C合成能力的影响[J]．畜牧兽
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