摘要：拌种灵四氢呋喃与乙醛酸乙酯或丙酮酸乙酯衍生合成出2个希夫碱化合物（Ⅰa和Ⅰb），经硼氢化钠还原合成2个拌种灵的氨基酸衍生物（Ⅱa和Ⅱb），并经熔点测定、NMR和MS表征。以拌种灵为对照药剂，测定了4个目标化合物对水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）和水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae）的室内抑菌活性。结果表明4个目标化合物对水稻纹枯病菌和水稻白叶枯病菌均有抑菌活性。 关键词：拌种灵；氨基酸衍生物；生物活性 中图分类号：S482.2+ 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1061-03 内吸性杀菌剂的成功研发，使对寄生于植物内部的病原菌所导致病害的防治取得了极大的进 展[1]，但是由于大多数内吸性杀菌剂进入植物体内后都是在质外体传导，即从下而上单向传导，而土壤施药常常因环境因子复杂而影响药效，且用药量大，用药成本高，环境污染严重。如果杀菌剂通过茎叶喷雾后，经植物韧皮部向下传导来防治维管束和根部病害，有望从根本上解决维管束病害难于通过喷雾法防治的问题。 要解决杀菌剂等外源化合物在植物韧皮部传导的问题，必须了解植物韧皮部传导化合物的组成及传导特点。已有研究表明，蔗糖、氨基酸、植物激素等小分子化合物及某些蛋白质、核酸、多肽等生物大分子都能在植物韧皮部中进行长距离传导 [2-6]，且各种物质的运转有其特定的规律。其中，氨基酸在韧皮部流出液中的浓度为5～40 g/L，在植物韧皮部内能够双向传导，且这种传导是由细胞膜上的载体系统参与完成的，在所有膜上都发现了多种类型的载体蛋白。酸性的、碱性的和中性的氨基酸是由原生质膜上不同的载体蛋白来运输的，这些载体蛋白对于同一类型氨基酸有一定的广谱性[7]，即一种氨基酸的载体蛋白可以运载结构相近的多种氨基酸。如果将植物体内氨基酸等容易传导的化合物与杀菌剂有效结合，且结合部位没有屏蔽氨基酸与载体蛋白的结合部位，可能使杀菌剂在氨基酸的介导下经韧皮部传导而提高药效。李俊凯等[8-11]研究了氨基酸和植物生长调节剂与多种杀菌剂的耦合特性，并试验了部分耦合物的杀菌活性和在植物体内的传导性。研究表明，许多外源化合物与植物本身存在的化合物耦合后能在内源化合物的引导下向植物特定部位传输并积累[12]。 本研究以拌种灵（四氢呋喃）为有效成分，在其分子结构中衍生出α-氨基酸官能团作为导向基团，并试验了化合物的室内杀菌活性，以期为进一步研究其传导性，探求能经共质体传导的杀菌剂分子结构特点奠定基础。 1 材料与方法 1.1 供试材料与仪器 1.1.1 供试菌种 水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）和水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae），由华中农业大学微生物学实验室提供。 1.1.2 主要仪器及试剂 LABOROTA 4003型旋转蒸发仪，Bruker 600型核磁共振仪，Agilent质谱仪，冷冻干燥机，生长培养箱，超净工作台，WRR熔点测定仪等。拌种灵，乙醛酸乙酯，丙酮酸乙酯，硼氢化钠均为市售药剂。 1.2 试验方法 1.2.1 目标化合物的合成 目标化合物合成路线如图1所示。称取6.69 g拌种灵于100 mL的圆底烧瓶中，并置于磁力搅拌器上，加入30 mL四氢呋喃，待拌种灵充分溶解后加入3.06 g的乙醛酸乙酯或丙酮酸乙酯，60℃，反应3～4 h。柱层析（乙酸乙酯和石油醚梯度洗脱）分离得目标化合物Ⅰa或Ⅰb，产率68%。称取3.17 gⅠa或Ⅰb溶于30 mL四氢呋喃，加入0.56 g 硼氢化钠，30℃，反应4～5 h分离纯化得目标化合物Ⅱa或Ⅱb，产率48.3%。 1.2.2 室内生物活性的测定方法 采用菌丝生长速率抑制法[13]测定4个目标化合物对水稻纹枯病菌的室内生物活性。以拌种灵为对照药剂，将4个目标化合物配制成2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μmol/L的梯度浓度，设3次平行试验，取平均值。计算供试药剂对菌丝生长抑制率，并计算各目标化合物对水稻纹枯病菌的EC50。 菌丝生长抑制率= ■×100% 采用抑菌圈法[13]测定4个目标化合物在室内对水稻白叶枯病菌的生物活性。以拌种灵为对照药剂，将4个目标化合物配制成640、1 280、2 560、5 120、10 240、20 480 μmol/L的梯度浓度，设3次平行试验，取平均值。测量抑菌圈直径，并计算各目标化合物对水稻白叶枯病菌的EC50。 2 结果与分析 2.1 目标化合物表征 Ⅰa：白色粉末状固体，熔点：201～202 ℃； 1HNMR（600 MHz，CDCl3）δ：1.40（t，3H，CH3 in CH2CH3），2.62（s，3H，CH3-thiazol），4.23（t，2H，CH2），6.95～7.35 （m， 5H， C6H5），8.06（s， 1H， CH=N）。 Ⅱa：白色粉末状固体，熔点：151～153 ℃；1HNMR（600 MHz，CDCl3）δ：2.61（s，3H，CH3-thiazol），4.15（d，2H，CH2），6.93～7.61（m，5H，C6H5）；EI-MS：583[2M+1]+，291[M+1]+，246[C12H12N3OS]+，154[C6H6N2OS]+。 Ⅰb：白色粉末状固体，熔点：173～174 ℃；1HNMR（600 MHz，CDCl3）δ：1.36（t， 3H， CH3 in CH2CH3）， 1.43（s， 3H， CH3-C=N）， 2.60（s， 3H-thiazol）， 4.22（t，2H， CH2）， 6.80～7.65（m， 5H， C6H5）。 Ⅱb：白色粉末状固体，熔点：193～195 ℃；1HNMR（600 MHz，CDCl3）δ：1.42（t，3H，CH3），2.61（s，3H，CH3-thiazol）， 3.67（m， H， CH）， 6.95～7.60（m，5H， C6H5）；EI-MS：711[2M+1]+，306[M+1]+，260[C13H14N3OS]+，168[C7H8N2OS]+。 2.2 目标化合物生物活性测定结果 2.2.1 目标化合物对水稻纹枯病菌的室内毒力测定结果 利用菌丝生长速率抑制法测定化合物Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb对水稻纹枯病菌的室内毒力，结果见表1。由表1可知，目标化合物Ⅰa与Ⅱa的抑菌活性与拌种灵的抑菌活性相似，而目标化合物Ⅰb与Ⅱb的抑菌活性相对较差，且Ⅱa和Ⅱb的活性均分别低于Ⅰa和Ⅰb。 2.2.2 目标化合物对水稻白叶枯病菌的室内毒力测定结果 利用抑菌圈法测定目标化合物Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb对水稻白叶枯病菌的室内毒力，结果见表2。由表2可知，各供试药剂对水稻白叶枯病菌的抑菌活性由大到小依次为拌种灵、Ⅱa 、Ⅰa 、Ⅰb 、Ⅱb。其中只有目标化合物Ⅱa的抑菌活性与拌种灵的相似，其他目标化合物的活性相对较差，且Ⅰb 、Ⅱb的活性均低于Ⅱa 、Ⅰa。 3 小结与讨论 室内的毒力测定试验结果表明，经过氨基酸修饰的拌种灵对水稻纹枯病菌和水稻白叶枯病菌均有抑菌活性。其中拌种灵的甘氨酸衍生物（Ⅰa、Ⅱa）的生物活性与拌种灵的相近，拌种灵的丙氨酸衍生物（Ⅰb，Ⅱb）的生物活性降低，但所有化合物与拌种灵的抑菌活性之间差异不明显。当然，如果所合成的新化合物自身没有活性或在离体条件下活性不佳，只要在植物体内能传导到特定部位并释放出有效成分，同样可以发挥较好的田间效果。 本试验主要研究了拌种灵氨基酸衍生物在离体条件下的生物活性，没有研究其在植物体内的传导活性以及在植物体内的杀菌活性。如果将新合成的化合物作叶面喷施试验，并证明新合成化合物能定向传导到植物的特定部位，这将能有效提高拌种灵等农药的田间药效，并很好地解决土壤施药带来的一系列问题。 参考文献： [1] MARSH R W.内吸性杀菌剂[M].郑 仲，李宗成（译）.北京：化学工业出版社，1983：152-157. [2] WARD J M，KUHN C，TEGEDER M，et al.Sucrose transport in higher plants[J].International Review of Cytology-A Survey of Cell Biology，1997，178：41-71. [3] BUSH D R.Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants[J].Annual Review Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1993，44：513-542. [4] RENTSCH D， BOORER K J，FROMMER W B.Structure and function of plasma membrane amino acid， oligopeptide and sucrose reansporters from higer plants[J].Journal of Membrane Biology，1998，162（3）：177-190. [5] STIEGER P A，REINHARDT D，KUHLEMEIER C.The auxin influx carrier is essential for correct leaf positioning[J].The Plant Journal，2002，32（4）：509-517. [6] KOH A，NOHUO S，SHU F，et al. Destinationselective longdistance movement of phloem proteins[J]. The Plant Cell，2005， 17（6）：1801-1814. [7] 李俊凯，徐汉虹，王 勇.杀菌剂在韧皮部的传导性研究进展[J].世界农药，2009，32（1）：35-39. [8] 李俊凯.氨基酸和生长素介导的杀菌剂定向积累[D].广州：华南农业大学，2006. [9] 李俊凯，徐汉虹，江定心，等.吲哚乙酸引导下三唑醇在大豆植株中的传导与积累研究初报[J].农药学学报，2005，7（3）：259-263. [10] 李俊凯，徐汉虹，谭堂峰，等.乙酰水杨酸与杀菌剂的耦合物合成及生物活性[J].农药学学报，2008，10（2）：196-199. [11] 李俊凯，徐汉虹，谭堂峰，等.生长素与杀菌剂耦合物合成及初步的生物活性[J].湖北农业科学，2008，49（12）：18-22. [12] 李俊凯，徐汉虹，王 勇.杀菌剂在韧皮部的传导性研究进 展[J].世界农药，2009，32（1）：35-39. [13] 孙家隆，慕 卫. 农药学实验技术与指导[M].北京：化学工业出版社，2009.
摘要：拌种灵四氢呋喃与乙醛酸乙酯或丙酮酸乙酯衍生合成出2个希夫碱化合物（Ⅰa和Ⅰb），经硼氢化钠还原合成2个拌种灵的氨基酸衍生物（Ⅱa和Ⅱb），并经熔点测定、NMR和MS表征。以拌种灵为对照药剂，测定了4个目标化合物对水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）和水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae）的室内抑菌活性。结果表明4个目标化合物对水稻纹枯病菌和水稻白叶枯病菌均有抑菌活性。 关键词：拌种灵；氨基酸衍生物；生物活性 中图分类号：S482.2+ 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1061-03 内吸性杀菌剂的成功研发，使对寄生于植物内部的病原菌所导致病害的防治取得了极大的进 展[1]，但是由于大多数内吸性杀菌剂进入植物体内后都是在质外体传导，即从下而上单向传导，而土壤施药常常因环境因子复杂而影响药效，且用药量大，用药成本高，环境污染严重。如果杀菌剂通过茎叶喷雾后，经植物韧皮部向下传导来防治维管束和根部病害，有望从根本上解决维管束病害难于通过喷雾法防治的问题。 要解决杀菌剂等外源化合物在植物韧皮部传导的问题，必须了解植物韧皮部传导化合物的组成及传导特点。已有研究表明，蔗糖、氨基酸、植物激素等小分子化合物及某些蛋白质、核酸、多肽等生物大分子都能在植物韧皮部中进行长距离传导 [2-6]，且各种物质的运转有其特定的规律。其中，氨基酸在韧皮部流出液中的浓度为5～40 g/L，在植物韧皮部内能够双向传导，且这种传导是由细胞膜上的载体系统参与完成的，在所有膜上都发现了多种类型的载体蛋白。酸性的、碱性的和中性的氨基酸是由原生质膜上不同的载体蛋白来运输的，这些载体蛋白对于同一类型氨基酸有一定的广谱性[7]，即一种氨基酸的载体蛋白可以运载结构相近的多种氨基酸。如果将植物体内氨基酸等容易传导的化合物与杀菌剂有效结合，且结合部位没有屏蔽氨基酸与载体蛋白的结合部位，可能使杀菌剂在氨基酸的介导下经韧皮部传导而提高药效。李俊凯等[8-11]研究了氨基酸和植物生长调节剂与多种杀菌剂的耦合特性，并试验了部分耦合物的杀菌活性和在植物体内的传导性。研究表明，许多外源化合物与植物本身存在的化合物耦合后能在内源化合物的引导下向植物特定部位传输并积累[12]。 本研究以拌种灵（四氢呋喃）为有效成分，在其分子结构中衍生出α-氨基酸官能团作为导向基团，并试验了化合物的室内杀菌活性，以期为进一步研究其传导性，探求能经共质体传导的杀菌剂分子结构特点奠定基础。 1 材料与方法 1.1 供试材料与仪器 1.1.1 供试菌种 水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）和水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae），由华中农业大学微生物学实验室提供。 1.1.2 主要仪器及试剂 LABOROTA 4003型旋转蒸发仪，Bruker 600型核磁共振仪，Agilent质谱仪，冷冻干燥机，生长培养箱，超净工作台，WRR熔点测定仪等。拌种灵，乙醛酸乙酯，丙酮酸乙酯，硼氢化钠均为市售药剂。 1.2 试验方法 1.2.1 目标化合物的合成 目标化合物合成路线如图1所示。称取6.69 g拌种灵于100 mL的圆底烧瓶中，并置于磁力搅拌器上，加入30 mL四氢呋喃，待拌种灵充分溶解后加入3.06 g的乙醛酸乙酯或丙酮酸乙酯，60℃，反应3～4 h。柱层析（乙酸乙酯和石油醚梯度洗脱）分离得目标化合物Ⅰa或Ⅰb，产率68%。称取3.17 gⅠa或Ⅰb溶于30 mL四氢呋喃，加入0.56 g 硼氢化钠，30℃，反应4～5 h分离纯化得目标化合物Ⅱa或Ⅱb，产率48.3%。 1.2.2 室内生物活性的测定方法 采用菌丝生长速率抑制法[13]测定4个目标化合物对水稻纹枯病菌的室内生物活性。以拌种灵为对照药剂，将4个目标化合物配制成2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μmol/L的梯度浓度，设3次平行试验，取平均值。计算供试药剂对菌丝生长抑制率，并计算各目标化合物对水稻纹枯病菌的EC50。 菌丝生长抑制率= ■×100% 采用抑菌圈法[13]测定4个目标化合物在室内对水稻白叶枯病菌的生物活性。以拌种灵为对照药剂，将4个目标化合物配制成640、1 280、2 560、5 120、10 240、20 480 μmol/L的梯度浓度，设3次平行试验，取平均值。测量抑菌圈直径，并计算各目标化合物对水稻白叶枯病菌的EC50。 2 结果与分析 2.1 目标化合物表征 Ⅰa：白色粉末状固体，熔点：201～202 ℃； 1HNMR（600 MHz，CDCl3）δ：1.40（t，3H，CH3 in CH2CH3），2.62（s，3H，CH3-thiazol），4.23（t，2H，CH2），6.95～7.35 （m， 5H， C6H5），8.06（s， 1H， CH=N）。 Ⅱa：白色粉末状固体，熔点：151～153 ℃；1HNMR（600 MHz，CDCl3）δ：2.61（s，3H，CH3-thiazol），4.15（d，2H，CH2），6.93～7.61（m，5H，C6H5）；EI-MS：583[2M+1]+，291[M+1]+，246[C12H12N3OS]+，154[C6H6N2OS]+。 Ⅰb：白色粉末状固体，熔点：173～174 ℃；1HNMR（600 MHz，CDCl3）δ：1.36（t， 3H， CH3 in CH2CH3）， 1.43（s， 3H， CH3-C=N）， 2.60（s， 3H-thiazol）， 4.22（t，2H， CH2）， 6.80～7.65（m， 5H， C6H5）。 Ⅱb：白色粉末状固体，熔点：193～195 ℃；1HNMR（600 MHz，CDCl3）δ：1.42（t，3H，CH3），2.61（s，3H，CH3-thiazol）， 3.67（m， H， CH）， 6.95～7.60（m，5H， C6H5）；EI-MS：711[2M+1]+，306[M+1]+，260[C13H14N3OS]+，168[C7H8N2OS]+。 2.2 目标化合物生物活性测定结果 2.2.1 目标化合物对水稻纹枯病菌的室内毒力测定结果 利用菌丝生长速率抑制法测定化合物Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb对水稻纹枯病菌的室内毒力，结果见表1。由表1可知，目标化合物Ⅰa与Ⅱa的抑菌活性与拌种灵的抑菌活性相似，而目标化合物Ⅰb与Ⅱb的抑菌活性相对较差，且Ⅱa和Ⅱb的活性均分别低于Ⅰa和Ⅰb。 2.2.2 目标化合物对水稻白叶枯病菌的室内毒力测定结果 利用抑菌圈法测定目标化合物Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb对水稻白叶枯病菌的室内毒力，结果见表2。由表2可知，各供试药剂对水稻白叶枯病菌的抑菌活性由大到小依次为拌种灵、Ⅱa 、Ⅰa 、Ⅰb 、Ⅱb。其中只有目标化合物Ⅱa的抑菌活性与拌种灵的相似，其他目标化合物的活性相对较差，且Ⅰb 、Ⅱb的活性均低于Ⅱa 、Ⅰa。 3 小结与讨论 室内的毒力测定试验结果表明，经过氨基酸修饰的拌种灵对水稻纹枯病菌和水稻白叶枯病菌均有抑菌活性。其中拌种灵的甘氨酸衍生物（Ⅰa、Ⅱa）的生物活性与拌种灵的相近，拌种灵的丙氨酸衍生物（Ⅰb，Ⅱb）的生物活性降低，但所有化合物与拌种灵的抑菌活性之间差异不明显。当然，如果所合成的新化合物自身没有活性或在离体条件下活性不佳，只要在植物体内能传导到特定部位并释放出有效成分，同样可以发挥较好的田间效果。 本试验主要研究了拌种灵氨基酸衍生物在离体条件下的生物活性，没有研究其在植物体内的传导活性以及在植物体内的杀菌活性。如果将新合成的化合物作叶面喷施试验，并证明新合成化合物能定向传导到植物的特定部位，这将能有效提高拌种灵等农药的田间药效，并很好地解决土壤施药带来的一系列问题。 参考文献： [1] MARSH R W.内吸性杀菌剂[M].郑 仲，李宗成（译）.北京：化学工业出版社，1983：152-157. [2] WARD J M，KUHN C，TEGEDER M，et al.Sucrose transport in higher plants[J].International Review of Cytology-A Survey of Cell Biology，1997，178：41-71. [3] BUSH D R.Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants[J].Annual Review Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1993，44：513-542. [4] RENTSCH D， BOORER K J，FROMMER W B.Structure and function of plasma membrane amino acid， oligopeptide and sucrose reansporters from higer plants[J].Journal of Membrane Biology，1998，162（3）：177-190. [5] STIEGER P A，REINHARDT D，KUHLEMEIER C.The auxin influx carrier is essential for correct leaf positioning[J].The Plant Journal，2002，32（4）：509-517. [6] KOH A，NOHUO S，SHU F，et al. Destinationselective longdistance movement of phloem proteins[J]. The Plant Cell，2005， 17（6）：1801-1814. [7] 李俊凯，徐汉虹，王 勇.杀菌剂在韧皮部的传导性研究进展[J].世界农药，2009，32（1）：35-39. [8] 李俊凯.氨基酸和生长素介导的杀菌剂定向积累[D].广州：华南农业大学，2006. [9] 李俊凯，徐汉虹，江定心，等.吲哚乙酸引导下三唑醇在大豆植株中的传导与积累研究初报[J].农药学学报，2005，7（3）：259-263. [10] 李俊凯，徐汉虹，谭堂峰，等.乙酰水杨酸与杀菌剂的耦合物合成及生物活性[J].农药学学报，2008，10（2）：196-199. [11] 李俊凯，徐汉虹，谭堂峰，等.生长素与杀菌剂耦合物合成及初步的生物活性[J].湖北农业科学，2008，49（12）：18-22. [12] 李俊凯，徐汉虹，王 勇.杀菌剂在韧皮部的传导性研究进 展[J].世界农药，2009，32（1）：35-39. [13] 孙家隆，慕 卫. 农药学实验技术与指导[M].北京：化学工业出版社，2009.