药物分析杂志
LC-HRMS测定胡椒碱对小鼠血液的药代动力学研究
Bokka Ramesh, P. Rajesh Rao Vadaparthi, Genji Sukumar, Nemali
Manjula, Katragadda Suresh Babu n, Potturi Sita Devi n
天然产物化学部门,印度理工学院的化学技术,,印度
关键词 干血纸片法
LC-HRMS
胡椒碱
药物动力学
三中脉酰胺
摘要:液相色谱–高分辨质谱（LC–HRMS）的方法开发和验证的胡椒碱的含量（PPR）干血点（DBS）。DBS样品制备用被分析物的全血来产生30毫升的血样采集卡。色谱分离实现使用乙腈和水的亚特兰蒂斯DC18柱（0.1%甲酸）（85:15，V/V）为在0.75毫升/分钟进行电喷雾质谱检测正离子模式对目标离子和监控流量在等度洗脱流动相模式在m/z 286.1465为内标PPR和272.1303（是）。该方法具有线性动态范围超过0.01–2000毫微克/毫升PPR DBS。聚丙烯的整体提取回收率从DBS是92.5%。红细胞压积和现货量对DBS的影响进行了评估和发现是在可接受的范围内。该方法已成功应用于药代动力学研究在大鼠的PPR。
2015西安交通大学。生产和托管由Elsevier公司保留所有权利。这是CC by-nc-nd许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-n三维/ 4 /）。
1。介绍
胡椒碱（PPR），具有多种药理作用它具有抗氧化、抗炎、止泻、抗惊厥、抗突变、降血脂、促进胆汁分泌抑制肿瘤活性。也是一个已知的中枢神经系统抗抑郁药品。此外，它其中含有多种有效成分。因为这些多重生物效应，生物分析和PPR的药代动力学研究已经成为研究重点。几个分析方法文献报道的PPR单独或与其他活性测定生物体液中化合物的组合，包括高性能的薄层色谱Y（HPTLC），高效液相色谱法（HPLC），液相色谱–核磁共振–质谱（LC–核磁共振–MS），液相色谱串联质谱法–Y（LC–MS / MS和超快速液相色谱（UFLC）。所有上述方法,样品蛋白质进行了脱水处理 。然而,这些化验需要一个相对较大的血容量(一般是40.5毫升)来产生足够的等离子体体积进行分析。相反,干血滴(DBS),血液样本的收集需要最低血容量,它可以很容易地通过手指或跟刺,和消除等离子体离心简化示例制备。与传统的全血样品相比,整个血液样本的收集在滤纸上显示了独特的优势,包括样品保存时间长,需要制冷,更少的侵袭性,更大的成本效益,方便运输和储存,减少感染的风险与潜在病原体在滤纸上失活的风险。
因此，DBS已成为一个利益主体，为药代动力学研究各种药物的定量生物分析干矩阵提供了比传统的静脉血的几个优点采样。这也是显着的优势，但从道德考虑无法大量的对幼儿和老年人采样。另外，一些出版物上使用DBS 或各种包括抗疟药、抗癫痫药物，降糖药和抗高血压药的报道。成功的运用DBS也被毒代动力学治疗药物监测研究以及药代动力学报道。
据我们所知，还没有研究报道对胡椒碱进行量化，对胡椒碱的有效成分进行DBS分析，使用DBS采样。药用植物提取物作为草药配方中通常含有极微量的生物活性化合物。这也是常见的，这些前束可能包含一个分子量有时具有相同的分子量。在本研究中，我们采用高–分辨质谱（HRMS）因为它提供了高灵敏度，质量分辨率和质量准确度（O5 ppm）。研究方法已在过去的几年中改进，现在有三重四极杆质谱定量竞争。在这里，我们描述了我们试图开发和验证一个简单的物质，选择敏感的和有特异性的PPR DBS的定量LC–HRMS方法并探讨其潜在的效用。
2实验
2.1化学品和材料
PPR和三中脉（TCS）是在实验室中从胡椒碱中分离。通过核磁共振和质谱分析，鉴定了它们的结构，并与文献报道的进行比较。专业高效液相色谱仪、默克公司生产的乙腈和甲酸（孟买，印度）。水净化系统采购机制备用于整个分析水（班加罗尔，印度）。自贸区dmpk-c卡提供whatmann（Whatman，GE Healthcare，NJ）。样品管（加尔各答，印度）。离心机（模型2–16p）由SIGM一个（苏黎世，瑞士）和哈里斯打孔和切割垫由whatmann（斯坦福，我，USA）进行。干燥剂硅胶密封塑料袋血斑卡存储市场。从tarsons是直放站多吸管用于发现血液（加尔各答，印度）。EDTA涂层毛细管从该（莱斯特，英国）进行。
2.2。液相色谱–高分辨质谱（LC–HRMS）
由安捷伦1200系列LC仪器色谱系统（安捷伦、美国）–四极杆-飞行时间–（Q–TOF）质谱仪（Q–TOF质谱6510系列CLA中国社会调查事务所g6510a、安捷伦、美国）配备ESI源使用。色谱法对水域进行亚特兰蒂斯DC18（150毫米4.6毫米，5μM）在25°C柱以乙腈-水（含0.1%甲酸）（85:15，V/V）为0.75毫升/分钟的流量在等度洗脱模式的移动相，与注射量为10 ml，数据的采集前提是大工作站软件的控制下。典型的操作源条件MS扫描阳性ESI模式进行了优化：电离电压80 V，V的毛细管3000–电压3500 V，60 V的撇油器，氮作为干燥（300°C；9升/分钟）、雾化器（45 psi）气。–的TOF MS外部校准进行日常分析之前。
2.3解决方案的准备、校准标准（CSS）和质量控制（QC）样本
PPR内部标准（IS）取约10毫克PPR溶解在10毫升的甲醇溶液中。准备新鲜的甲醇：水（50:50，v/v）生产20000，15000，10000，5000，2500，1000，500，250，20和0.1，稀释100倍，以添加不同的新鲜血液样品制备ng/mL的CSSOD（900毫升）与100毫升上述工作方案，收益率为2000，1500，1000，500，250，100，50，25，最终浓度为10，2和0.01纳克/毫升的PPR在血液。一零PPR血液样本（空白）是由扣球新鲜血液制备（900毫升）与100毫升的甲醇：水（50:50，v/v）。通过稀释适当的工作标准与全血质控样品的制备给予浓度为10（低质量），400（中等质量）和1200（高质量）ng/ml PPR。因此，制备的质量控制和铯样品的使用中的方法的验证，也为稳定的研究。这些QCS
被存放在密封的塑料袋中室温下用干燥剂干燥。
2.4。DBS样品的制备
用刻度吸管，收集各血样30毫升到FTA血斑卡准备DBS样品斑点。样品在室温下干燥，储存在4°C，直至分析。
2.5。DBS样品的提取
从DBS样品的中心用10毫米的管转移到离心管。加入500毫升体积的萃取溶剂（50%甲醇组成的50纳克/毫升），和管涡流混合10 min，离心10 min，与上清液转移到自动进样瓶分析LC–HRMS。额外的生产过程示意图如图1所示。
2.6。验证过程 所提出的方法进行验证评估下列参数：选择性、线性、精密度、准确度、定量下限（LLOQ）以及QC样品的稳定性DBS也有自己的一套独特的性能进行评估，其中包括现货量、红细胞压积和稀释作用
3。结果与讨论
3.1。选择
适当的选择是处理样品基质效应的一个重要方面。理想的结构应该是一种结构相似的模拟或稳定同位素标记的化合物。TCS作为是对于PPR由于其结构的相似性的量化（图2），在ESI–MS电离反应和萃取回收率和类似的洗脱模式。
3.2。色谱条件的优化
色谱条件，尤其是流动相的组成，非常的关键。为了取得了良好的色谱行为和适当的电离用不同流动相（甲醇- w水、乙腈–水或无MIC酸或醋酸铵），使用亚特兰蒂斯DC18调查（150毫米4.6毫米，5毫米）柱以优化的分析性能。它观察到在乙腈中被发现是更好的分辨率和峰值形状相比，甲醇。用乙腈-水（含0.1%甲酸）良好的峰型，相当大的反应达到基线分离。流动相是在0.75毫升/分钟的流量允许短的运行时间为3.0分钟,此时com-promising色谱选择性最好。
3.3。质量条件优化
MS参数进行调整，对PPR的正离子的参数进行了优化，以最大限度地响应。乙腈提供比甲醇更高的效应，因此再选择作为洗脱液中的有机改性剂，增加了0.1%甲酸的移动相增强的反应。由于提取离子色谱图（EIC），基于精确质
量测量T，被用来量化的PPR，有必要确定分析物的准确。标准质谱在全扫描范围为100 - 1000，得到了注射PPR标准溶液（500毫微克/毫升），是（250纳克/毫升）。分子离子[ M ]þHþPPR和呈高信号在m/z 286.1465和m/z 272.1303（图3），观察到的质量偏差为4.94 ppm和3.81 ppm的是PPR。
3.4。样品制备方法的优化
在目前的工作中，用不同的提取溶剂提取和PPR是DBS。DBS用不同溶剂（甲醇、乙腈和混合物的处理，缓冲/有机溶剂混合物）提取：纯有机溶剂被证明是不适合于本文，除PPR（提取率小于50%），而贮水溶剂（水）中的DBS样品的分析物的提取。最后，以甲醇/水混合物（50:50，v/v）给了可喜的成果，从清洁样品和提取率（90%以上）。
3.5。方法验证
3.5.1。线性度、选择性和LLOQ
样品在DBS PPR的是峰面积比值超过0.01–2000毫微克/毫升。平均线性回归方程校正曲线的范围方面的分析物的浓度线性分析¼758.2xþY 0.091，Y在被分析物的峰面积比的是和X被分析物的浓度。相关系数（R2）为PPR为0.9987的浓度浓度范围内使用。最低定量限、标准曲线的最低浓度，可以接受的准确度和精度从正常DBS样品中分析物的测量，为0.01毫微克/毫升。证明LC–HRMS的选择性非常适合本实验
3.5.2。准确度和精密度
测定六个样品DBS QCS各个指标。通过分析，对日间检测的精度和准确度进行了评价，六产品每天一次，连续三天。精密度和准确度进行了RSD（%）和重（%），分别。所有获得的值均在接受标准的测定lidations和在预定的15%的限制要求。日内和日间的数据的准确性和精度的方法总结在表1。
3.5.3。恢复与基体效应
通过对提取的QC样品的峰面积确定了PPR的提取回收率，是（n¼6）与相同浓度的纯QC样品的峰面积。回收率PPR和在三质量浓度的测定（低、中、高浓度）如表2。通过比较色谱峰的基质效应进行了评价地区分析物的整洁和解决是添加到空白样品提取DBS（N¼6）低、中、高浓度的标准溶液，在相同的浓度离子。结果是一致的测试浓度，发现在可接受范围（95%–105%）。因此，
基质效应被认为是微不足道的，并没有影响所提出的精度
3.5.4。稳定性
结果的稳定性研究表明，PPR DBSS三浓度在常温（25°C）下24 h培养的稳定性与在4°C的7°C和20°C 30°C的样品的研究并没有改变分析物。稳定性试验结果见表3。从表3可以看出，结果是好的，在接受范围内。
3.6。血斑
在100和500纳克/毫升，复制两质量水平的血斑体积的影响（N¼5）在不同的地方卷（25，30和35毫升）发现在DBS卡。一个10毫米直径的磁盘穿孔从每个样品的中心，以避免可能出现的问题，从冲的位置，并随后提取样品。从每个点的浓度进行了线性回归方程比较，从DBS样品取样30毫升。准确度和精密度数据均在15%的上限，为25和35毫升体积的尺寸在两个试验点泰德的浓度（表4），表明量的血斑不影响PPR在FTA卡的分布。
3.7。影响红细胞压积
为了结果的准确性有必要对红细胞压积（HCT）效应对血液中活性物的稳定性进行测定。红细胞压积对血液粘度的影响，导致不同粘度通过用于样品收集DBS卡在血流量和扩散性质是不同的。这直接影响到确定DBS样品中分析物的精度。HCT通常ABO血型UT斯达康0.31–0.50鼠。在高HCT值，通过纸/卡的血液样本的分布可能是少的，导致在一个较小的血斑与低血样本相比HCT小20%，测试了10毫米的光斑大小在1000纳克/毫升的PPR分别为35%和50%的HCT。测得的PPR浓度与DBS样品与HCT 35得到的结果比较，结果在表5。结果表明，RSD在验收标准与HCT值的影响关系不大。
3.8。动物实验
生物分析（LC–HRMS）PPR在DBS中药代动力学的适用性。取雄性大鼠六只，体重200g进行研究。禁食到过夜前4小时后给药（PPR的研究是由印度学院化学技术，海得拉巴动物伦理委员会批准）。每只大鼠接受15毫克/公斤的PPR 50%丙二醇/ 50% Milli Q水口服剂量（V／V）浓度在1毫克/毫升PPR配方。血液样本（30毫升），收集从刺尾得到的血液。串行血液样本被发现在FTA检测卡在0，0.5，1，2，3，4，5，6，8，10，12和24小时后的剂量。样品进行处理，如在第2.5节中详细说明的过程中，D分析。
3.9。药代动力学
–平均浓度时间数据进行非房室药代动力学分析采用线性梯形法则。图5显示的平均血浆浓度时间曲线–PPR。医药工业动力学参数如Cmax，Tmax，T1 / 2，AUC和AUC0–1 PPR列于表6。与DBS的药代动力学数据进行比较
4。结论
我们证明了全扫描LC–HRMS的检测符合VA lidation验收标准在准确度、精度、灵敏度和选择性的要求。用PPR可以为DBS快速和高灵敏度的测定提供样品。DBS方法有几个优点如无创，只需微量血液样本（通常有与传统的静脉采血相比，与传统的静脉采血比较简单。这充分验证了LC–HRMS方法简单，灵敏度高，特异性，已成功应用于PHA在大鼠的DBS研究。
致谢
导师对我工作的支持
药物分析杂志
LC-HRMS测定胡椒碱对小鼠血液的药代动力学研究
Bokka Ramesh, P. Rajesh Rao Vadaparthi, Genji Sukumar, Nemali
Manjula, Katragadda Suresh Babu n, Potturi Sita Devi n
天然产物化学部门,印度理工学院的化学技术,,印度
关键词 干血纸片法
LC-HRMS
胡椒碱
药物动力学
三中脉酰胺
摘要:液相色谱–高分辨质谱（LC–HRMS）的方法开发和验证的胡椒碱的含量（PPR）干血点（DBS）。DBS样品制备用被分析物的全血来产生30毫升的血样采集卡。色谱分离实现使用乙腈和水的亚特兰蒂斯DC18柱（0.1%甲酸）（85:15，V/V）为在0.75毫升/分钟进行电喷雾质谱检测正离子模式对目标离子和监控流量在等度洗脱流动相模式在m/z 286.1465为内标PPR和272.1303（是）。该方法具有线性动态范围超过0.01–2000毫微克/毫升PPR DBS。聚丙烯的整体提取回收率从DBS是92.5%。红细胞压积和现货量对DBS的影响进行了评估和发现是在可接受的范围内。该方法已成功应用于药代动力学研究在大鼠的PPR。
2015西安交通大学。生产和托管由Elsevier公司保留所有权利。这是CC by-nc-nd许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-n三维/ 4 /）。
1。介绍
胡椒碱（PPR），具有多种药理作用它具有抗氧化、抗炎、止泻、抗惊厥、抗突变、降血脂、促进胆汁分泌抑制肿瘤活性。也是一个已知的中枢神经系统抗抑郁药品。此外，它其中含有多种有效成分。因为这些多重生物效应，生物分析和PPR的药代动力学研究已经成为研究重点。几个分析方法文献报道的PPR单独或与其他活性测定生物体液中化合物的组合，包括高性能的薄层色谱Y（HPTLC），高效液相色谱法（HPLC），液相色谱–核磁共振–质谱（LC–核磁共振–MS），液相色谱串联质谱法–Y（LC–MS / MS和超快速液相色谱（UFLC）。所有上述方法,样品蛋白质进行了脱水处理 。然而,这些化验需要一个相对较大的血容量(一般是40.5毫升)来产生足够的等离子体体积进行分析。相反,干血滴(DBS),血液样本的收集需要最低血容量,它可以很容易地通过手指或跟刺,和消除等离子体离心简化示例制备。与传统的全血样品相比,整个血液样本的收集在滤纸上显示了独特的优势,包括样品保存时间长,需要制冷,更少的侵袭性,更大的成本效益,方便运输和储存,减少感染的风险与潜在病原体在滤纸上失活的风险。
因此，DBS已成为一个利益主体，为药代动力学研究各种药物的定量生物分析干矩阵提供了比传统的静脉血的几个优点采样。这也是显着的优势，但从道德考虑无法大量的对幼儿和老年人采样。另外，一些出版物上使用DBS 或各种包括抗疟药、抗癫痫药物，降糖药和抗高血压药的报道。成功的运用DBS也被毒代动力学治疗药物监测研究以及药代动力学报道。
据我们所知，还没有研究报道对胡椒碱进行量化，对胡椒碱的有效成分进行DBS分析，使用DBS采样。药用植物提取物作为草药配方中通常含有极微量的生物活性化合物。这也是常见的，这些前束可能包含一个分子量有时具有相同的分子量。在本研究中，我们采用高–分辨质谱（HRMS）因为它提供了高灵敏度，质量分辨率和质量准确度（O5 ppm）。研究方法已在过去的几年中改进，现在有三重四极杆质谱定量竞争。在这里，我们描述了我们试图开发和验证一个简单的物质，选择敏感的和有特异性的PPR DBS的定量LC–HRMS方法并探讨其潜在的效用。
2实验
2.1化学品和材料
PPR和三中脉（TCS）是在实验室中从胡椒碱中分离。通过核磁共振和质谱分析，鉴定了它们的结构，并与文献报道的进行比较。专业高效液相色谱仪、默克公司生产的乙腈和甲酸（孟买，印度）。水净化系统采购机制备用于整个分析水（班加罗尔，印度）。自贸区dmpk-c卡提供whatmann（Whatman，GE Healthcare，NJ）。样品管（加尔各答，印度）。离心机（模型2–16p）由SIGM一个（苏黎世，瑞士）和哈里斯打孔和切割垫由whatmann（斯坦福，我，USA）进行。干燥剂硅胶密封塑料袋血斑卡存储市场。从tarsons是直放站多吸管用于发现血液（加尔各答，印度）。EDTA涂层毛细管从该（莱斯特，英国）进行。
2.2。液相色谱–高分辨质谱（LC–HRMS）
由安捷伦1200系列LC仪器色谱系统（安捷伦、美国）–四极杆-飞行时间–（Q–TOF）质谱仪（Q–TOF质谱6510系列CLA中国社会调查事务所g6510a、安捷伦、美国）配备ESI源使用。色谱法对水域进行亚特兰蒂斯DC18（150毫米4.6毫米，5μM）在25°C柱以乙腈-水（含0.1%甲酸）（85:15，V/V）为0.75毫升/分钟的流量在等度洗脱模式的移动相，与注射量为10 ml，数据的采集前提是大工作站软件的控制下。典型的操作源条件MS扫描阳性ESI模式进行了优化：电离电压80 V，V的毛细管3000–电压3500 V，60 V的撇油器，氮作为干燥（300°C；9升/分钟）、雾化器（45 psi）气。–的TOF MS外部校准进行日常分析之前。
2.3解决方案的准备、校准标准（CSS）和质量控制（QC）样本
PPR内部标准（IS）取约10毫克PPR溶解在10毫升的甲醇溶液中。准备新鲜的甲醇：水（50:50，v/v）生产20000，15000，10000，5000，2500，1000，500，250，20和0.1，稀释100倍，以添加不同的新鲜血液样品制备ng/mL的CSSOD（900毫升）与100毫升上述工作方案，收益率为2000，1500，1000，500，250，100，50，25，最终浓度为10，2和0.01纳克/毫升的PPR在血液。一零PPR血液样本（空白）是由扣球新鲜血液制备（900毫升）与100毫升的甲醇：水（50:50，v/v）。通过稀释适当的工作标准与全血质控样品的制备给予浓度为10（低质量），400（中等质量）和1200（高质量）ng/ml PPR。因此，制备的质量控制和铯样品的使用中的方法的验证，也为稳定的研究。这些QCS
被存放在密封的塑料袋中室温下用干燥剂干燥。
2.4。DBS样品的制备
用刻度吸管，收集各血样30毫升到FTA血斑卡准备DBS样品斑点。样品在室温下干燥，储存在4°C，直至分析。
2.5。DBS样品的提取
从DBS样品的中心用10毫米的管转移到离心管。加入500毫升体积的萃取溶剂（50%甲醇组成的50纳克/毫升），和管涡流混合10 min，离心10 min，与上清液转移到自动进样瓶分析LC–HRMS。额外的生产过程示意图如图1所示。
2.6。验证过程 所提出的方法进行验证评估下列参数：选择性、线性、精密度、准确度、定量下限（LLOQ）以及QC样品的稳定性DBS也有自己的一套独特的性能进行评估，其中包括现货量、红细胞压积和稀释作用
3。结果与讨论
3.1。选择
适当的选择是处理样品基质效应的一个重要方面。理想的结构应该是一种结构相似的模拟或稳定同位素标记的化合物。TCS作为是对于PPR由于其结构的相似性的量化（图2），在ESI–MS电离反应和萃取回收率和类似的洗脱模式。
3.2。色谱条件的优化
色谱条件，尤其是流动相的组成，非常的关键。为了取得了良好的色谱行为和适当的电离用不同流动相（甲醇- w水、乙腈–水或无MIC酸或醋酸铵），使用亚特兰蒂斯DC18调查（150毫米4.6毫米，5毫米）柱以优化的分析性能。它观察到在乙腈中被发现是更好的分辨率和峰值形状相比，甲醇。用乙腈-水（含0.1%甲酸）良好的峰型，相当大的反应达到基线分离。流动相是在0.75毫升/分钟的流量允许短的运行时间为3.0分钟,此时com-promising色谱选择性最好。
3.3。质量条件优化
MS参数进行调整，对PPR的正离子的参数进行了优化，以最大限度地响应。乙腈提供比甲醇更高的效应，因此再选择作为洗脱液中的有机改性剂，增加了0.1%甲酸的移动相增强的反应。由于提取离子色谱图（EIC），基于精确质
量测量T，被用来量化的PPR，有必要确定分析物的准确。标准质谱在全扫描范围为100 - 1000，得到了注射PPR标准溶液（500毫微克/毫升），是（250纳克/毫升）。分子离子[ M ]þHþPPR和呈高信号在m/z 286.1465和m/z 272.1303（图3），观察到的质量偏差为4.94 ppm和3.81 ppm的是PPR。
3.4。样品制备方法的优化
在目前的工作中，用不同的提取溶剂提取和PPR是DBS。DBS用不同溶剂（甲醇、乙腈和混合物的处理，缓冲/有机溶剂混合物）提取：纯有机溶剂被证明是不适合于本文，除PPR（提取率小于50%），而贮水溶剂（水）中的DBS样品的分析物的提取。最后，以甲醇/水混合物（50:50，v/v）给了可喜的成果，从清洁样品和提取率（90%以上）。
3.5。方法验证
3.5.1。线性度、选择性和LLOQ
样品在DBS PPR的是峰面积比值超过0.01–2000毫微克/毫升。平均线性回归方程校正曲线的范围方面的分析物的浓度线性分析¼758.2xþY 0.091，Y在被分析物的峰面积比的是和X被分析物的浓度。相关系数（R2）为PPR为0.9987的浓度浓度范围内使用。最低定量限、标准曲线的最低浓度，可以接受的准确度和精度从正常DBS样品中分析物的测量，为0.01毫微克/毫升。证明LC–HRMS的选择性非常适合本实验
3.5.2。准确度和精密度
测定六个样品DBS QCS各个指标。通过分析，对日间检测的精度和准确度进行了评价，六产品每天一次，连续三天。精密度和准确度进行了RSD（%）和重（%），分别。所有获得的值均在接受标准的测定lidations和在预定的15%的限制要求。日内和日间的数据的准确性和精度的方法总结在表1。
3.5.3。恢复与基体效应
通过对提取的QC样品的峰面积确定了PPR的提取回收率，是（n¼6）与相同浓度的纯QC样品的峰面积。回收率PPR和在三质量浓度的测定（低、中、高浓度）如表2。通过比较色谱峰的基质效应进行了评价地区分析物的整洁和解决是添加到空白样品提取DBS（N¼6）低、中、高浓度的标准溶液，在相同的浓度离子。结果是一致的测试浓度，发现在可接受范围（95%–105%）。因此，
基质效应被认为是微不足道的，并没有影响所提出的精度
3.5.4。稳定性
结果的稳定性研究表明，PPR DBSS三浓度在常温（25°C）下24 h培养的稳定性与在4°C的7°C和20°C 30°C的样品的研究并没有改变分析物。稳定性试验结果见表3。从表3可以看出，结果是好的，在接受范围内。
3.6。血斑
在100和500纳克/毫升，复制两质量水平的血斑体积的影响（N¼5）在不同的地方卷（25，30和35毫升）发现在DBS卡。一个10毫米直径的磁盘穿孔从每个样品的中心，以避免可能出现的问题，从冲的位置，并随后提取样品。从每个点的浓度进行了线性回归方程比较，从DBS样品取样30毫升。准确度和精密度数据均在15%的上限，为25和35毫升体积的尺寸在两个试验点泰德的浓度（表4），表明量的血斑不影响PPR在FTA卡的分布。
3.7。影响红细胞压积
为了结果的准确性有必要对红细胞压积（HCT）效应对血液中活性物的稳定性进行测定。红细胞压积对血液粘度的影响，导致不同粘度通过用于样品收集DBS卡在血流量和扩散性质是不同的。这直接影响到确定DBS样品中分析物的精度。HCT通常ABO血型UT斯达康0.31–0.50鼠。在高HCT值，通过纸/卡的血液样本的分布可能是少的，导致在一个较小的血斑与低血样本相比HCT小20%，测试了10毫米的光斑大小在1000纳克/毫升的PPR分别为35%和50%的HCT。测得的PPR浓度与DBS样品与HCT 35得到的结果比较，结果在表5。结果表明，RSD在验收标准与HCT值的影响关系不大。
3.8。动物实验
生物分析（LC–HRMS）PPR在DBS中药代动力学的适用性。取雄性大鼠六只，体重200g进行研究。禁食到过夜前4小时后给药（PPR的研究是由印度学院化学技术，海得拉巴动物伦理委员会批准）。每只大鼠接受15毫克/公斤的PPR 50%丙二醇/ 50% Milli Q水口服剂量（V／V）浓度在1毫克/毫升PPR配方。血液样本（30毫升），收集从刺尾得到的血液。串行血液样本被发现在FTA检测卡在0，0.5，1，2，3，4，5，6，8，10，12和24小时后的剂量。样品进行处理，如在第2.5节中详细说明的过程中，D分析。
3.9。药代动力学
–平均浓度时间数据进行非房室药代动力学分析采用线性梯形法则。图5显示的平均血浆浓度时间曲线–PPR。医药工业动力学参数如Cmax，Tmax，T1 / 2，AUC和AUC0–1 PPR列于表6。与DBS的药代动力学数据进行比较
4。结论
我们证明了全扫描LC–HRMS的检测符合VA lidation验收标准在准确度、精度、灵敏度和选择性的要求。用PPR可以为DBS快速和高灵敏度的测定提供样品。DBS方法有几个优点如无创，只需微量血液样本（通常有与传统的静脉采血相比，与传统的静脉采血比较简单。这充分验证了LC–HRMS方法简单，灵敏度高，特异性，已成功应用于PHA在大鼠的DBS研究。
致谢
导师对我工作的支持