质粒大提试剂盒说明书
DI1120-10（10次） RNaseA（10mg/ml） 600μl 溶液Ⅰ 60ml 溶液Ⅱ 60ml 溶液Ⅲ 80ml 漂洗液（浓缩液） 2×15ml 洗脱缓冲液 30ml 吸附柱 10个 收集管（50ml） 10个 说明书 1份
产品简介：
本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的特性提取质粒DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白质及细胞中其他有机化合物，一般从20-50ml大肠杆菌LB培养液中，可快速提取200-300μg纯净地高拷贝质粒DNA，提取率达85-90％。使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。
注意事项：在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1、溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（可将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀置于2-8℃保存。如果菌液量太大，超过50 ml，会造成RNＡ消化不完全，可先加入500μl RNaseA，提出的质粒中再加入余下的100μl，
2、第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在漂洗液中加入无水乙醇配制成工作液（如向15ml的漂洗液中加入60ml的无水乙醇）。
3、使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。
4、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后应立即盖紧盖子。
5、如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心。
操作步骤：
1、收集50-100ml过夜培养的菌液11000rpm离心10分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
2、向留有菌体沉淀的离心管中加入5ml溶液Ⅰ（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入5ml P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意：①翻转一定要温和，以免污染细菌基因组DNA。
②作用时间不要超过2分钟，以免质粒受到破坏。
4、向离心管中加入7ml P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
5、11000rpm离心10分钟，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，注意尽量不要吸出沉淀。 注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
6、 将上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室温放置2-3分钟，11000rpm离心30-60秒，
倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(如为提高得率，可将收集管中的液体加入吸附柱再次吸附一次。)
7、 向吸附柱中加入8ml漂洗液（请先检查是否已加入无水乙醇），11000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废
液，将吸附柱重新放回收集管中。
8、 向吸附柱重加入5ml漂洗液，11000rpm离心1分钟，弃掉收集管中的废液。
9、 将吸附柱重新放回收集管中，11000rpm离心3分钟，将吸附柱置于室温放置3-5分钟。
注意：此步骤非常关键，其目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）试验。
10、将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1ml左右经65-70℃水浴预热的洗脱液缓冲液，室温放置2分钟，11000rpm离心3分钟将质粒溶液收集到离心管中。
注意：①为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入利息吸附柱中，11000rpm再次离心3分钟。
②洗脱缓冲液体积不应少于500μl，体积过小影响回收效率。
11、DNA产物可-20℃保存。
内毒素清除剂使用步骤：
提取前内毒素清除剂放在冰上5分钟，期间翻转瓶子数次使液体均匀冰冷。预冷内毒素清除剂按照推荐的温度操作绝对重要，可按比例加大或缩小提取规模。
1、在质粒DNA溶液中加入1/10体积3M NaAc或1/20体积5M NaCl溶液，冰水浴5分钟。
2、加1/5体积预冷的内毒素清除剂，振荡混匀，冰浴10分钟，溶液应变清亮。
3、37℃水浴20-30min，不时振荡。
4、12000rpm离心5min，离心温度应在25℃以上。
5、溶液应分为两相，否则应重复步骤3-4。上层水相含DNA，下层油状相含内毒素。
6、将含DNA的上层水相转移到新管，弃层油状相。重复抽提2次，即重复步骤2-6两次。
7、最后加2.5倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇沉淀质粒DNA，用无内毒素的高纯水或缓冲液溶解沉淀。
8、用内毒素检测试剂测定样品中内毒素活性，并与初始样品比较。
低拷贝或大质粒（>10kb）提取
如果所提质粒为低拷贝质粒或大质粒10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用100-200ml过夜培养物，同时按照比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液应在65-70℃预热，再吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。其他步骤相同。
质粒DNA浓度及纯度检测
得到的质粒DNA可用1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度于纯度。电泳检测可能为单一条带，也可能为2到3条DNA条带，这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度有关。OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不是表示质粒纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。
质粒大提试剂盒说明书
DI1120-10（10次） RNaseA（10mg/ml） 600μl 溶液Ⅰ 60ml 溶液Ⅱ 60ml 溶液Ⅲ 80ml 漂洗液（浓缩液） 2×15ml 洗脱缓冲液 30ml 吸附柱 10个 收集管（50ml） 10个 说明书 1份
产品简介：
本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的特性提取质粒DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白质及细胞中其他有机化合物，一般从20-50ml大肠杆菌LB培养液中，可快速提取200-300μg纯净地高拷贝质粒DNA，提取率达85-90％。使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。
注意事项：在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1、溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（可将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀置于2-8℃保存。如果菌液量太大，超过50 ml，会造成RNＡ消化不完全，可先加入500μl RNaseA，提出的质粒中再加入余下的100μl，
2、第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在漂洗液中加入无水乙醇配制成工作液（如向15ml的漂洗液中加入60ml的无水乙醇）。
3、使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。
4、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后应立即盖紧盖子。
5、如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心。
操作步骤：
1、收集50-100ml过夜培养的菌液11000rpm离心10分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
2、向留有菌体沉淀的离心管中加入5ml溶液Ⅰ（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入5ml P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意：①翻转一定要温和，以免污染细菌基因组DNA。
②作用时间不要超过2分钟，以免质粒受到破坏。
4、向离心管中加入7ml P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
5、11000rpm离心10分钟，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，注意尽量不要吸出沉淀。 注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
6、 将上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室温放置2-3分钟，11000rpm离心30-60秒，
倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(如为提高得率，可将收集管中的液体加入吸附柱再次吸附一次。)
7、 向吸附柱中加入8ml漂洗液（请先检查是否已加入无水乙醇），11000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废
液，将吸附柱重新放回收集管中。
8、 向吸附柱重加入5ml漂洗液，11000rpm离心1分钟，弃掉收集管中的废液。
9、 将吸附柱重新放回收集管中，11000rpm离心3分钟，将吸附柱置于室温放置3-5分钟。
注意：此步骤非常关键，其目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）试验。
10、将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1ml左右经65-70℃水浴预热的洗脱液缓冲液，室温放置2分钟，11000rpm离心3分钟将质粒溶液收集到离心管中。
注意：①为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入利息吸附柱中，11000rpm再次离心3分钟。
②洗脱缓冲液体积不应少于500μl，体积过小影响回收效率。
11、DNA产物可-20℃保存。
内毒素清除剂使用步骤：
提取前内毒素清除剂放在冰上5分钟，期间翻转瓶子数次使液体均匀冰冷。预冷内毒素清除剂按照推荐的温度操作绝对重要，可按比例加大或缩小提取规模。
1、在质粒DNA溶液中加入1/10体积3M NaAc或1/20体积5M NaCl溶液，冰水浴5分钟。
2、加1/5体积预冷的内毒素清除剂，振荡混匀，冰浴10分钟，溶液应变清亮。
3、37℃水浴20-30min，不时振荡。
4、12000rpm离心5min，离心温度应在25℃以上。
5、溶液应分为两相，否则应重复步骤3-4。上层水相含DNA，下层油状相含内毒素。
6、将含DNA的上层水相转移到新管，弃层油状相。重复抽提2次，即重复步骤2-6两次。
7、最后加2.5倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇沉淀质粒DNA，用无内毒素的高纯水或缓冲液溶解沉淀。
8、用内毒素检测试剂测定样品中内毒素活性，并与初始样品比较。
低拷贝或大质粒（>10kb）提取
如果所提质粒为低拷贝质粒或大质粒10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用100-200ml过夜培养物，同时按照比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液应在65-70℃预热，再吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。其他步骤相同。
质粒DNA浓度及纯度检测
得到的质粒DNA可用1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度于纯度。电泳检测可能为单一条带，也可能为2到3条DNA条带，这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度有关。OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不是表示质粒纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。