陈杨的纳米技术论文doc

纳米技术在叶酸受体介导的结肠癌细胞靶向治疗中的应用

陈杨 11108130

摘要:目的:利用结肠癌细胞表面叶酸受体的过量表达实现对结肠癌细胞的靶向性检测和治疗。方法:通过叶酸和人血清白蛋白偶联,再连接CdTe量子点,实现对结肠癌细胞的靶向性检测。通过叶酸修饰壳聚糖纳米微球,负载药物实现对结肠癌细胞的靶向性治疗。结果:由于未进行任何实验,本文是利用文献中曾经报道过的实验结果作为依据,进行尽可能合理的设想和推论。

关键词:叶酸受体 结肠癌 壳聚糖

一 理论依据

结肠癌是胃肠道常见肿瘤。传统的对肿瘤的检测和定位,由于缺乏实现靶向定位的方式,很难达到预期的检测效果。在进行放疗和常规化疗时,由于缺乏区分正常细胞和恶性肿瘤细胞的选择性,难以在病灶处聚集,传统的抗肿瘤药物容易引起全身的毒副作用、降低患者对治疗的耐受性。肿瘤靶向治疗有望将造影剂和抗肿瘤药物选择性地集中在肿瘤组织,而没有临床上区域动脉灌注所带来的手术痛苦和风险,因而是较好的替代方法。目前,肿瘤靶向治疗最大的障碍是缺乏合适的具有特殊识别能力的药物载体。寻找选择性强、能够有效载带抗肿瘤药物的靶向载体,是当前结肠癌靶向治疗中的热点问题。

靶向递药系统将化疗药物直接靶向肿瘤组织,提高抗肿瘤药物的疗效,提高药物在肿瘤组织中聚集的同时避免其在非靶向部位的聚集。肿瘤靶向递药系统可分为被动靶向和主动靶向两大类,前者主要借助于纳米尺度的递药载体实现,后者则建立在纳米递药系统的基础上通过肿瘤细胞膜表而的特异性受体介导。在结肠癌的治疗中,主动靶向的纳米递药系统是本文研究的重点。

叶酸是一种小分子维生素,结构如图1所示。它可被还原为四氢叶酸,后者是一碳单位转移酶的辅酶,参与一碳单位代谢和嘌呤、胸腺嘧啶的从头合成。与其他靶向分子如单克隆抗体相比,叶酸相对分子质量小、无免疫原性、价廉易得、稳定性好、与药物或载体之间的化学键合简单易行。因此以叶酸为靶向分子构建递药系统已成为主动靶向治疗肿瘤的一个重要研究方向。

图1 叶酸结构式

叶酸是人体必需的维生素,但人体不能合成叶酸,需要摄取外源性叶酸。其摄取途径是叶酸通过与细胞表面的叶酸受体结合,内吞进入细胞。由此可以推测,在例如结肠癌细胞

这类增殖较多、分裂较快的细胞,需要大量的叶酸。

叶酸受体是一种糖基化磷脂酰肌醇连接的膜糖蛋白,相对分子质量为38~40ku,主要有3种形式:α,β,γ/γ’。还原型叶酸辅酶以相反的立体异构体分别与和α型和β型结合。α,β和γ型的氨基酸序列信号肽分别包含25,19和23个氨基酸残基。α型有3个潜在N-糖基化位点:-Asn 69,Asn 161,Ash 201。而β型有2个糖基化位点位于Asn 99、Asn 179。已证实,在人类基因组中还存在基因编码的第4种受体亚型,但目前,无论是成人还是胚胎组织,都无法检测到,这可能是一种临时的表达形式、结合变异体或一种假叶酸受体基因。

近年来,对叶酸受体在药物靶向输送、癌症及风湿性关节炎的免疫疗法等作用引起广泛关注。与其他可利用的肿瘤标记物相比,叶酸受体优势明显。其配体叶酸易通过γ~羧基与其他分子结合,不会导致其亲和力降低。并且通过叶酸受体介导的内吞作用,能有效将结合FR的叶酸、叶酸偶联物摄入细胞。此外,叶酸受体在正常组织中的表达高度保守,只在肺、肾、脉络膜、胎盘中有低到中等水平表达,且以β亚型为主。但是在大部分恶性肿瘤中,如卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和鼻咽癌中均高度表达,有时可比正常组织高出100~300倍。有文献报道卵巢癌、子宫内膜癌、睾九绒毛膜癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、肺癌等来源于上皮组织的癌组织中α亚型受体高度表达,比正常组织高出100~300倍,β亚型受体表达也增加,但α亚型受体的增加50倍于β亚型受体。

叶酸受体对叶酸及其5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、磺胺、甲氨嘌呤、5,10-亚甲基四氢叶酸等叶酸类似物具有很高的亲和力和特异性,可介导这些物质内吞进入细胞。其转运机制如图2所示,外源性的叶酸复合物与细胞膜表面的叶酸受体特异性结合,周围形成凹陷,进入细胞内形成内涵体。在核体内质子泵的作用下,内涵体内部的pH由7下降至5,使复合物构象改变,叶酸修饰的药物从复合物上解离,释放到细胞内,而叶酸受体可以再回到细胞膜表面,循环转运药物。因此,可以利用这种转运机制和叶酸受体在结肠癌细胞上的高度表达,对肿瘤的靶向性显像诊断和治疗方法进行设计。

图2 叶酸受体介导的内吞作用过程

二 载体设计

药物的低毒和高效对疾病的临床治疗十分重要。常用的抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时,也很有可能损害机体正常组织细胞,造成全细胞杀伤而非我所期望的特异性杀伤。之前我们提到的,肿瘤细胞表面高表达叶酸受体,而正常细胞表面很少过表达叶酸受体。且利用叶酸与叶酸受体的高度亲和性,抗肿瘤药物可经叶酸受体介异的胞吞作用进入细胞内。从这点出发,可以设想,用叶酸修饰某种药物载体,同时实现抗肿瘤药物对肿瘤细胞的靶向识别和药物缓释,避免药物对正常细胞的伤害,提高肿瘤治疗效果。本次设计中,选用壳聚糖作为纳米药物载体,制备叶酸导向的壳聚糖纳米微球。

壳聚糖是甲壳质的脱乙酞基衍生物,和纤维素有着相似的结构,如图3所示。研究表明壳聚糖不仅具有良好的生物与物理化学特性,其本身还能以选择性地蓄积在肿瘤组织中,抑制肿瘤细胞的生长。壳聚糖良好的成膜特性又可以用于制备抗肿瘤药物的微球、纳米球。由于壳聚糖分子中富含游离的氨基和轻基,不仅可以和抗肿瘤药物以醋键或酞胺键偶连,而且还可以和能与肿瘤细胞表面相应受体特异性结合的配基或抗体进行连接,这又可以用于制备主动靶向的抗肿瘤药物载体系统。目前相关的报道主要针对壳聚糖的改性,壳聚糖及其衍生物与抗肿瘤药物的偶连和壳聚糖及其衍生物在靶向抗肿瘤药物制剂领域的应用。

图3 壳聚糖结构式

值得注意的是,壳聚糖及其衍生物分子中富含活性基团(-NH2、-OH、-COOH),因此可以与药物分子以酞胺键、酉旨键、醚键等方式连接。此外,壳聚糖分子中还可以偶连上能被肿瘤细胞表面受体特异性识别的配基。而壳聚糖的这种特性,是设计药物载体可靠性的关键。

我对载体设计的期望是,以叶酸为配体,壳聚糖为纳米载体,在纳米载体表面修饰配体,形成叶酸偶联壳聚糖纳米微球。通过这个载体实现对结肠癌细胞的靶向定位。由于使用了壳聚糖纳米载体,在接下来的药物选择与修饰中,条件降低,整个过程具有了很大的灵活性。

相关文献报道,利用叶酸活性酯与壳聚糖分子上的氨基反应能形成稳定的酞胺键,进而形成叶酸-壳聚糖偶联物。根据这种制备方法,可以制备出我所设计的药物载体。由于壳聚糖具有在酸性溶液中带正电荷这一特性,在接下来的实验中,我们只要对药物进行适当修饰,就可以达到使壳聚糖包被药物的目的。但由于没有实验数据支持,所以依然无法确定该方法制备出的偶联物是否符合要求。

另外,许多文献中也有用叶酸修饰的人血清白蛋白纳米粒作为药物载体,在白蛋白上标记量子点,并成功实现对结肠癌细胞的靶向识别和长期荧光标记的报道。人血清白蛋白是血

浆中含量最丰富的载体蛋白,它具有广泛的结合能力,有多个药物结合位点,能结合许多内源性、外源性物质。并且,白蛋白分子中赖氨酸数目众多(约占残基数的10%),暴露于白蛋白纳米粒表面的赖氨酸ε-氨基及末端氨基,即表面活性氨基是对其进行化学修饰的有效连接部位。根据以上研究结果,可以进行另一种药物载体的设计。我们可以以叶酸与某种白蛋白合成偶联体,并作相应的修饰,作为结肠癌细胞靶向性的药物载体。

但是文献仅仅报道了这种叶酸-白蛋白纳米粒能结合CdTe量子点,并没有证据显示该种方法对常规的抗肿瘤药物也有相同效果,所以目前还不能确定该方法能普遍适用。有文献报道过二巯基丁二酸能修饰氧化铁纳米粒子,能把羧基修饰到金属氧化物纳米粒子上,并形成了很高的表面负电荷。而例如TiO2这样的金属氧化物纳米粒子已被证实对肿瘤细胞具有光动力催化杀伤作用。这给我们一种启示,如果能找到合适的表面修饰剂对抗肿瘤药物进行修饰,使其具有更好的靶向性和稳定性,那么以叶酸-白蛋白纳米粒为基础的药物载体就能得到更广泛的应用。

三 药物选择

方法1:光动力疗法

所选药物:Au改性TiO2纳米复合物

所选载体:叶酸偶联壳聚糖纳米微球

利用光敏剂治疗癌症,是近年来发展起来的行之有效的一种新方法,其特点是利用光敏剂在光照后发生的一系列化学反应,生成强氧化性的活性氧和自由基来消灭癌细胞。研究表明,纳米TiO2无毒,光催化活性高且化学性质稳定,适合作为治疗癌症的光敏剂。TiO2光催化杀伤癌细胞的作用机理在于TiO2是一种具有n型半导体性质的化合物,在紫外光照射下会产生光生电子(e-)-空穴(h+)对。其产生的空穴具有强氧化性,可以与介质中的水反应产生能够氧化损伤癌细胞结构和成分的OH·和HO2·自由基,其作用机理如图4所示。由此可以推断,TiO2光催化杀伤癌细胞效率的高低取决于光生空穴数量的多少。但是TiO2表面产生的光生空穴很容易与光生电子复合,从而大大降低了TiO2光催化杀伤癌细胞的效率。

图3 紫外灯光照下Au/TiO2表面电荷转移过程

有关文献报道,在TiO2表面掺杂贵金属Au可以有效防止电子-空穴对的复合,促进电子-空穴对的有效分离。近年来Au改性的TiO2(Au/TiO2)已经被用于改善TiO2光催化分解有机物的活性,提高TiO2转换太阳能的效率。由上述可知,TiO2表面修饰纳米Au能提高纳米TiO2光催化杀伤癌细胞的效率,其作为光敏剂治疗癌症的有效性将大大提高。

为了实现将Au改性TiO2纳米复合物作为光敏剂杀伤结肠癌细胞的目的,我设计了利用叶酸偶联壳聚糖纳米微球作为药物载体,将药物靶向性导入结肠癌细胞的方法。用这种药物运载方式,一方面是为了实现对结肠癌肿瘤病灶的靶向性,另一方面是为了维持Au沉积量的稳定,防止在运送过程中由于外源因素导致药物的变性和失效。

由于未找到关于对Au改性TiO2纳米复合物的表面修饰的相关报道,所以我们只能通过相关文献对TiO2纳米粒子进行表面修饰的报道,对该方法的实验结果进行猜想。

有文献报道了用沉淀法制备了羧基功能化离子液体表面修饰半导体TiO2纳米颗粒,相关反应式见图4。Cl-离子液体表面修饰TiO2纳米微粒,首先是钛酸四正丁酯在OH-的进攻下水解生成Ti(OH)4。在加热回流情况下,Ti(OH)4的失水与相互聚合是两个同时发生并相互竞争的反应,既可以失水生成TiO2无机粒子[式(1)],又可以互相聚合生成Ti-O-Ti键[式(2)],聚合链上的Ti原子再与离子液体阳离子上的羧基键合,形成带正电的金属-有机分子螯合修饰层[式(3)]。在溶剂中,带正电修饰层的生成,既防止了TiO2纳米微粒的生长,又使带正电的纳米微粒相互排斥,从而防止了相互团聚。而我们所重视的,不仅仅是这种制备纳米微粒的方法本身,而是其形成的带正电的表面修饰层。

图4 羧基功能化离子液体表面修饰半导体TiO2纳米颗粒反应相关化学式

有文献报道了壳聚糖可以作为催化剂载体,特别作为一种金属催化剂的载体。壳聚糖分子中存在大量的-OH和-NH2,有很好的亲水性,并且对金属离子有很好的配位作用。壳聚糖中的氨基基团在中性溶液中就能与金属离子鳌合,所以容易对其进行化学修饰。

利用以上研究结果,我们可以做出一个比较大胆的猜想:使用某种离子液体修饰Au改性TiO2纳米复合物颗粒,形成带正电的表面修饰层,再使其与叶酸修饰的壳聚糖纳米球螯合,通过叶酸受体的介导,实现对结肠癌细胞特异性的靶向药物系统。由于缺乏实验依据,并且无法对改性后的纳米粒子是否与原来的纳米粒子具有相同的螯合效果等关键节点做出合理的解释,这个药物设计的可行性还有待证实。

方法2:siRNA沉默疗法

所选药物:端粒酶逆转录酶基因的siRNA

所选载体:叶酸偶联壳聚糖纳米微球

目前已经在广泛的人类癌瘤组织中检测到端粒酶活性和人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达。在消化系恶性肿瘤中,如结肠癌中,端粒酶也呈较高的阳性表达。有文献报道在胃癌组织、结直肠癌肝转移组织均检测到端粒酶异常激活,hTERT基因表达上调。利用端粒酶、hTERT基因只在肿瘤细胞中表达,而在正常体细胞中不表达的特点,如果选择其作为治疗靶

点,可确保特异地抑制癌细胞的生长,而对正常细胞不产生明显的副作用,极大地提高了肿瘤基因治疗的安全性。利用RNA干扰技术可以高效、特异敲低细胞内特定mRNA水平的特性,通过导入hTERT特异siRNA来敲低细胞内hTERT的水平,从而产生对肿瘤生长的抑制作用。

在这个方法中,同样使用之前的叶酸修饰的壳聚糖纳米球作为药物载体。壳聚糖为阳离子聚合体,可在稀酸溶液中膨胀并形成凝胶。因含有游离氨基并在酸性条件下能结合氢离子,成为带正电荷的电解质,故在酸性溶液中壳聚糖是正电荷多聚物。由于裸露的RNA在碱性条件下带负电荷,直接进入体内后迅速被RNase降解,失去生物活性。因此有保护作用的RNA载体对于RNA的体内应用具有重要意义。在该方法的药物设计中,我选择壳聚糖为载体材料,期望能制备包裹siRNA的叶酸修饰壳聚糖纳米球,实现对结肠癌肿瘤病灶的靶向性治疗。

壳聚糖分子在酸性条件下带正电荷,RNA分子在碱性条件下带负电荷。利用这一特点,有文献报道了采用复凝聚法制备RNA壳聚糖纳米粒的过程。纳米粒主要是以RNA为骨架,在硫酸钠对壳聚糖的脱水作用和壳聚糖与RNA的静电作用下,壳聚糖分子将RNA分子压缩并包裹,形成疏水颗粒并生成纳米粒混悬液。在制备过程改变壳聚糖、硫酸钠、RNA的浓度、配比等制备条件,可调控制备出壳聚糖纳米粒粒径大小。该实验的结果在某种程度上支持了我的药物设计猜想的可行性。

但不可否认,由于没有相关实验,我虽然能找到报道成功制备RNA壳聚糖纳米粒的文献,却依然无法确定使用之前文献中报道的具有沉默作用的siRNA是否能重复该RNA壳聚糖纳米粒制备的过程。并且,我们必须考虑的是,在壳聚糖纳米粒被叶酸修饰后,实验结果会不会产生变化。所以我的对药物设计的猜想,制备包裹siRNA的叶酸修饰壳聚糖纳米球靶向性治疗结肠癌,其可行性还有待实验证实。

四 相关讨论

在我的设计中,最关键的一点就是叶酸与叶酸受体的特异性结合。只有通过这种特异性结合才能实现对结肠癌肿瘤的靶向性。可很多时候,人体内的生理情况并不像培养皿中一样简单明了,许多因素都可能干扰叶酸对叶酸受体的识别。如何增强这种特异性识别,是我的设计面临的一个难点。事实上,在成功应用叶酸受体介导靶向治疗的实验动物模型中,肿瘤组织都表达最佳水平且均一的叶酸受体。然而对于人体肿瘤叶酸受体表达结果显示,叶酸受体在不同细胞中的表达存在较大差异并且表达不均一。为解决这个问题,我们可以选用地塞米松增强叶酸受体的表达。相关文献报道,地塞米松等转录调节剂可以选择性上调叶酸受体阳性肿瘤细胞中叶酸受体的表达。我们在用叶酸受体靶向治疗的过程中,可以同时辅以转录调节剂的使用,以增强靶向药物系统的效果。

在载体设计过程中,所使用的载体对人体正常细胞的损伤也是必须考虑的问题。在研究叶酸受体的内吞作用时,我们可以发现,细胞可通过叶酸受体介导的内吞作用将叶酸吸收入胞内,而叶酸通过其羧基与药物或药物载体系统连接形成叶酸复合物后,其与细胞表面叶酸受体的亲和力基本保持不变,即叶酸受体对叶酸复合物仍具有高度亲和性,浓度为10-10mol/L的叶酸即足以饱和所接触到的叶酸受体。肿瘤细胞表面的叶酸受体和以叶酸复合物为主体的递药系统结合后,细胞膜即发生内陷,叶酸受体与叶酸结合物形成细胞内小泡而被内吞入胞

内,在内涵体的酸化作用下(pH值为5),叶酸受体与叶酸复合物脱离,之后叶酸受体再回到细胞膜表面;叶酸结合物则逸出内涵体,将药物释放在细胞质内。这样,递药系统即可使药物选择性攻击肿瘤细胞,实现了针对特定部位病变细胞的靶向递药。递药系统有效进入肿瘤细胞,发挥靶向治疗作用,从而避免对正常细胞的损伤。此外,正常组织中叶酸受体主要定位于极化上皮表面,如近端肾小管极性侧、脑室脉络丛等,此类叶酸受体面向肾小管或脑室等组织的管腔侧,无法与血液接触。因此,血循环中叶酸复合物无法与正常组织中叶酸受体接触,故不易对正常组织造成损伤。

在这篇附带着自己很多猜想的论文中,我尽量做到有根有据,用已有的实验来支持我的猜想。在每一个分步的写作过程中,都写出了文献中的相关实验。虽然有的实验并不是专门为生物医学的用途而设计的(比如合成某些金属催化剂),但我想只要加以改进,这些实验还是可以用在我们研究生物医学纳米材料领域的。

当然,这也只是我的猜想。

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纳米技术在叶酸受体介导的结肠癌细胞靶向治疗中的应用

陈杨 11108130

摘要:目的:利用结肠癌细胞表面叶酸受体的过量表达实现对结肠癌细胞的靶向性检测和治疗。方法:通过叶酸和人血清白蛋白偶联,再连接CdTe量子点,实现对结肠癌细胞的靶向性检测。通过叶酸修饰壳聚糖纳米微球,负载药物实现对结肠癌细胞的靶向性治疗。结果:由于未进行任何实验,本文是利用文献中曾经报道过的实验结果作为依据,进行尽可能合理的设想和推论。

关键词:叶酸受体 结肠癌 壳聚糖

一 理论依据

结肠癌是胃肠道常见肿瘤。传统的对肿瘤的检测和定位,由于缺乏实现靶向定位的方式,很难达到预期的检测效果。在进行放疗和常规化疗时,由于缺乏区分正常细胞和恶性肿瘤细胞的选择性,难以在病灶处聚集,传统的抗肿瘤药物容易引起全身的毒副作用、降低患者对治疗的耐受性。肿瘤靶向治疗有望将造影剂和抗肿瘤药物选择性地集中在肿瘤组织,而没有临床上区域动脉灌注所带来的手术痛苦和风险,因而是较好的替代方法。目前,肿瘤靶向治疗最大的障碍是缺乏合适的具有特殊识别能力的药物载体。寻找选择性强、能够有效载带抗肿瘤药物的靶向载体,是当前结肠癌靶向治疗中的热点问题。

靶向递药系统将化疗药物直接靶向肿瘤组织,提高抗肿瘤药物的疗效,提高药物在肿瘤组织中聚集的同时避免其在非靶向部位的聚集。肿瘤靶向递药系统可分为被动靶向和主动靶向两大类,前者主要借助于纳米尺度的递药载体实现,后者则建立在纳米递药系统的基础上通过肿瘤细胞膜表而的特异性受体介导。在结肠癌的治疗中,主动靶向的纳米递药系统是本文研究的重点。

叶酸是一种小分子维生素,结构如图1所示。它可被还原为四氢叶酸,后者是一碳单位转移酶的辅酶,参与一碳单位代谢和嘌呤、胸腺嘧啶的从头合成。与其他靶向分子如单克隆抗体相比,叶酸相对分子质量小、无免疫原性、价廉易得、稳定性好、与药物或载体之间的化学键合简单易行。因此以叶酸为靶向分子构建递药系统已成为主动靶向治疗肿瘤的一个重要研究方向。

图1 叶酸结构式

叶酸是人体必需的维生素,但人体不能合成叶酸,需要摄取外源性叶酸。其摄取途径是叶酸通过与细胞表面的叶酸受体结合,内吞进入细胞。由此可以推测,在例如结肠癌细胞

这类增殖较多、分裂较快的细胞,需要大量的叶酸。

叶酸受体是一种糖基化磷脂酰肌醇连接的膜糖蛋白,相对分子质量为38~40ku,主要有3种形式:α,β,γ/γ’。还原型叶酸辅酶以相反的立体异构体分别与和α型和β型结合。α,β和γ型的氨基酸序列信号肽分别包含25,19和23个氨基酸残基。α型有3个潜在N-糖基化位点:-Asn 69,Asn 161,Ash 201。而β型有2个糖基化位点位于Asn 99、Asn 179。已证实,在人类基因组中还存在基因编码的第4种受体亚型,但目前,无论是成人还是胚胎组织,都无法检测到,这可能是一种临时的表达形式、结合变异体或一种假叶酸受体基因。

近年来,对叶酸受体在药物靶向输送、癌症及风湿性关节炎的免疫疗法等作用引起广泛关注。与其他可利用的肿瘤标记物相比,叶酸受体优势明显。其配体叶酸易通过γ~羧基与其他分子结合,不会导致其亲和力降低。并且通过叶酸受体介导的内吞作用,能有效将结合FR的叶酸、叶酸偶联物摄入细胞。此外,叶酸受体在正常组织中的表达高度保守,只在肺、肾、脉络膜、胎盘中有低到中等水平表达,且以β亚型为主。但是在大部分恶性肿瘤中,如卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和鼻咽癌中均高度表达,有时可比正常组织高出100~300倍。有文献报道卵巢癌、子宫内膜癌、睾九绒毛膜癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、肺癌等来源于上皮组织的癌组织中α亚型受体高度表达,比正常组织高出100~300倍,β亚型受体表达也增加,但α亚型受体的增加50倍于β亚型受体。

叶酸受体对叶酸及其5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、磺胺、甲氨嘌呤、5,10-亚甲基四氢叶酸等叶酸类似物具有很高的亲和力和特异性,可介导这些物质内吞进入细胞。其转运机制如图2所示,外源性的叶酸复合物与细胞膜表面的叶酸受体特异性结合,周围形成凹陷,进入细胞内形成内涵体。在核体内质子泵的作用下,内涵体内部的pH由7下降至5,使复合物构象改变,叶酸修饰的药物从复合物上解离,释放到细胞内,而叶酸受体可以再回到细胞膜表面,循环转运药物。因此,可以利用这种转运机制和叶酸受体在结肠癌细胞上的高度表达,对肿瘤的靶向性显像诊断和治疗方法进行设计。

图2 叶酸受体介导的内吞作用过程

二 载体设计

药物的低毒和高效对疾病的临床治疗十分重要。常用的抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时,也很有可能损害机体正常组织细胞,造成全细胞杀伤而非我所期望的特异性杀伤。之前我们提到的,肿瘤细胞表面高表达叶酸受体,而正常细胞表面很少过表达叶酸受体。且利用叶酸与叶酸受体的高度亲和性,抗肿瘤药物可经叶酸受体介异的胞吞作用进入细胞内。从这点出发,可以设想,用叶酸修饰某种药物载体,同时实现抗肿瘤药物对肿瘤细胞的靶向识别和药物缓释,避免药物对正常细胞的伤害,提高肿瘤治疗效果。本次设计中,选用壳聚糖作为纳米药物载体,制备叶酸导向的壳聚糖纳米微球。

壳聚糖是甲壳质的脱乙酞基衍生物,和纤维素有着相似的结构,如图3所示。研究表明壳聚糖不仅具有良好的生物与物理化学特性,其本身还能以选择性地蓄积在肿瘤组织中,抑制肿瘤细胞的生长。壳聚糖良好的成膜特性又可以用于制备抗肿瘤药物的微球、纳米球。由于壳聚糖分子中富含游离的氨基和轻基,不仅可以和抗肿瘤药物以醋键或酞胺键偶连,而且还可以和能与肿瘤细胞表面相应受体特异性结合的配基或抗体进行连接,这又可以用于制备主动靶向的抗肿瘤药物载体系统。目前相关的报道主要针对壳聚糖的改性,壳聚糖及其衍生物与抗肿瘤药物的偶连和壳聚糖及其衍生物在靶向抗肿瘤药物制剂领域的应用。

图3 壳聚糖结构式

值得注意的是,壳聚糖及其衍生物分子中富含活性基团(-NH2、-OH、-COOH),因此可以与药物分子以酞胺键、酉旨键、醚键等方式连接。此外,壳聚糖分子中还可以偶连上能被肿瘤细胞表面受体特异性识别的配基。而壳聚糖的这种特性,是设计药物载体可靠性的关键。

我对载体设计的期望是,以叶酸为配体,壳聚糖为纳米载体,在纳米载体表面修饰配体,形成叶酸偶联壳聚糖纳米微球。通过这个载体实现对结肠癌细胞的靶向定位。由于使用了壳聚糖纳米载体,在接下来的药物选择与修饰中,条件降低,整个过程具有了很大的灵活性。

相关文献报道,利用叶酸活性酯与壳聚糖分子上的氨基反应能形成稳定的酞胺键,进而形成叶酸-壳聚糖偶联物。根据这种制备方法,可以制备出我所设计的药物载体。由于壳聚糖具有在酸性溶液中带正电荷这一特性,在接下来的实验中,我们只要对药物进行适当修饰,就可以达到使壳聚糖包被药物的目的。但由于没有实验数据支持,所以依然无法确定该方法制备出的偶联物是否符合要求。

另外,许多文献中也有用叶酸修饰的人血清白蛋白纳米粒作为药物载体,在白蛋白上标记量子点,并成功实现对结肠癌细胞的靶向识别和长期荧光标记的报道。人血清白蛋白是血

浆中含量最丰富的载体蛋白,它具有广泛的结合能力,有多个药物结合位点,能结合许多内源性、外源性物质。并且,白蛋白分子中赖氨酸数目众多(约占残基数的10%),暴露于白蛋白纳米粒表面的赖氨酸ε-氨基及末端氨基,即表面活性氨基是对其进行化学修饰的有效连接部位。根据以上研究结果,可以进行另一种药物载体的设计。我们可以以叶酸与某种白蛋白合成偶联体,并作相应的修饰,作为结肠癌细胞靶向性的药物载体。

但是文献仅仅报道了这种叶酸-白蛋白纳米粒能结合CdTe量子点,并没有证据显示该种方法对常规的抗肿瘤药物也有相同效果,所以目前还不能确定该方法能普遍适用。有文献报道过二巯基丁二酸能修饰氧化铁纳米粒子,能把羧基修饰到金属氧化物纳米粒子上,并形成了很高的表面负电荷。而例如TiO2这样的金属氧化物纳米粒子已被证实对肿瘤细胞具有光动力催化杀伤作用。这给我们一种启示,如果能找到合适的表面修饰剂对抗肿瘤药物进行修饰,使其具有更好的靶向性和稳定性,那么以叶酸-白蛋白纳米粒为基础的药物载体就能得到更广泛的应用。

三 药物选择

方法1:光动力疗法

所选药物:Au改性TiO2纳米复合物

所选载体:叶酸偶联壳聚糖纳米微球

利用光敏剂治疗癌症,是近年来发展起来的行之有效的一种新方法,其特点是利用光敏剂在光照后发生的一系列化学反应,生成强氧化性的活性氧和自由基来消灭癌细胞。研究表明,纳米TiO2无毒,光催化活性高且化学性质稳定,适合作为治疗癌症的光敏剂。TiO2光催化杀伤癌细胞的作用机理在于TiO2是一种具有n型半导体性质的化合物,在紫外光照射下会产生光生电子(e-)-空穴(h+)对。其产生的空穴具有强氧化性,可以与介质中的水反应产生能够氧化损伤癌细胞结构和成分的OH·和HO2·自由基,其作用机理如图4所示。由此可以推断,TiO2光催化杀伤癌细胞效率的高低取决于光生空穴数量的多少。但是TiO2表面产生的光生空穴很容易与光生电子复合,从而大大降低了TiO2光催化杀伤癌细胞的效率。

图3 紫外灯光照下Au/TiO2表面电荷转移过程

有关文献报道,在TiO2表面掺杂贵金属Au可以有效防止电子-空穴对的复合,促进电子-空穴对的有效分离。近年来Au改性的TiO2(Au/TiO2)已经被用于改善TiO2光催化分解有机物的活性,提高TiO2转换太阳能的效率。由上述可知,TiO2表面修饰纳米Au能提高纳米TiO2光催化杀伤癌细胞的效率,其作为光敏剂治疗癌症的有效性将大大提高。

为了实现将Au改性TiO2纳米复合物作为光敏剂杀伤结肠癌细胞的目的,我设计了利用叶酸偶联壳聚糖纳米微球作为药物载体,将药物靶向性导入结肠癌细胞的方法。用这种药物运载方式,一方面是为了实现对结肠癌肿瘤病灶的靶向性,另一方面是为了维持Au沉积量的稳定,防止在运送过程中由于外源因素导致药物的变性和失效。

由于未找到关于对Au改性TiO2纳米复合物的表面修饰的相关报道,所以我们只能通过相关文献对TiO2纳米粒子进行表面修饰的报道,对该方法的实验结果进行猜想。

有文献报道了用沉淀法制备了羧基功能化离子液体表面修饰半导体TiO2纳米颗粒,相关反应式见图4。Cl-离子液体表面修饰TiO2纳米微粒,首先是钛酸四正丁酯在OH-的进攻下水解生成Ti(OH)4。在加热回流情况下,Ti(OH)4的失水与相互聚合是两个同时发生并相互竞争的反应,既可以失水生成TiO2无机粒子[式(1)],又可以互相聚合生成Ti-O-Ti键[式(2)],聚合链上的Ti原子再与离子液体阳离子上的羧基键合,形成带正电的金属-有机分子螯合修饰层[式(3)]。在溶剂中,带正电修饰层的生成,既防止了TiO2纳米微粒的生长,又使带正电的纳米微粒相互排斥,从而防止了相互团聚。而我们所重视的,不仅仅是这种制备纳米微粒的方法本身,而是其形成的带正电的表面修饰层。

图4 羧基功能化离子液体表面修饰半导体TiO2纳米颗粒反应相关化学式

有文献报道了壳聚糖可以作为催化剂载体,特别作为一种金属催化剂的载体。壳聚糖分子中存在大量的-OH和-NH2,有很好的亲水性,并且对金属离子有很好的配位作用。壳聚糖中的氨基基团在中性溶液中就能与金属离子鳌合,所以容易对其进行化学修饰。

利用以上研究结果,我们可以做出一个比较大胆的猜想:使用某种离子液体修饰Au改性TiO2纳米复合物颗粒,形成带正电的表面修饰层,再使其与叶酸修饰的壳聚糖纳米球螯合,通过叶酸受体的介导,实现对结肠癌细胞特异性的靶向药物系统。由于缺乏实验依据,并且无法对改性后的纳米粒子是否与原来的纳米粒子具有相同的螯合效果等关键节点做出合理的解释,这个药物设计的可行性还有待证实。

方法2:siRNA沉默疗法

所选药物:端粒酶逆转录酶基因的siRNA

所选载体:叶酸偶联壳聚糖纳米微球

目前已经在广泛的人类癌瘤组织中检测到端粒酶活性和人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达。在消化系恶性肿瘤中,如结肠癌中,端粒酶也呈较高的阳性表达。有文献报道在胃癌组织、结直肠癌肝转移组织均检测到端粒酶异常激活,hTERT基因表达上调。利用端粒酶、hTERT基因只在肿瘤细胞中表达,而在正常体细胞中不表达的特点,如果选择其作为治疗靶

点,可确保特异地抑制癌细胞的生长,而对正常细胞不产生明显的副作用,极大地提高了肿瘤基因治疗的安全性。利用RNA干扰技术可以高效、特异敲低细胞内特定mRNA水平的特性,通过导入hTERT特异siRNA来敲低细胞内hTERT的水平,从而产生对肿瘤生长的抑制作用。

在这个方法中,同样使用之前的叶酸修饰的壳聚糖纳米球作为药物载体。壳聚糖为阳离子聚合体,可在稀酸溶液中膨胀并形成凝胶。因含有游离氨基并在酸性条件下能结合氢离子,成为带正电荷的电解质,故在酸性溶液中壳聚糖是正电荷多聚物。由于裸露的RNA在碱性条件下带负电荷,直接进入体内后迅速被RNase降解,失去生物活性。因此有保护作用的RNA载体对于RNA的体内应用具有重要意义。在该方法的药物设计中,我选择壳聚糖为载体材料,期望能制备包裹siRNA的叶酸修饰壳聚糖纳米球,实现对结肠癌肿瘤病灶的靶向性治疗。

壳聚糖分子在酸性条件下带正电荷,RNA分子在碱性条件下带负电荷。利用这一特点,有文献报道了采用复凝聚法制备RNA壳聚糖纳米粒的过程。纳米粒主要是以RNA为骨架,在硫酸钠对壳聚糖的脱水作用和壳聚糖与RNA的静电作用下,壳聚糖分子将RNA分子压缩并包裹,形成疏水颗粒并生成纳米粒混悬液。在制备过程改变壳聚糖、硫酸钠、RNA的浓度、配比等制备条件,可调控制备出壳聚糖纳米粒粒径大小。该实验的结果在某种程度上支持了我的药物设计猜想的可行性。

但不可否认,由于没有相关实验,我虽然能找到报道成功制备RNA壳聚糖纳米粒的文献,却依然无法确定使用之前文献中报道的具有沉默作用的siRNA是否能重复该RNA壳聚糖纳米粒制备的过程。并且,我们必须考虑的是,在壳聚糖纳米粒被叶酸修饰后,实验结果会不会产生变化。所以我的对药物设计的猜想,制备包裹siRNA的叶酸修饰壳聚糖纳米球靶向性治疗结肠癌,其可行性还有待实验证实。

四 相关讨论

在我的设计中,最关键的一点就是叶酸与叶酸受体的特异性结合。只有通过这种特异性结合才能实现对结肠癌肿瘤的靶向性。可很多时候,人体内的生理情况并不像培养皿中一样简单明了,许多因素都可能干扰叶酸对叶酸受体的识别。如何增强这种特异性识别,是我的设计面临的一个难点。事实上,在成功应用叶酸受体介导靶向治疗的实验动物模型中,肿瘤组织都表达最佳水平且均一的叶酸受体。然而对于人体肿瘤叶酸受体表达结果显示,叶酸受体在不同细胞中的表达存在较大差异并且表达不均一。为解决这个问题,我们可以选用地塞米松增强叶酸受体的表达。相关文献报道,地塞米松等转录调节剂可以选择性上调叶酸受体阳性肿瘤细胞中叶酸受体的表达。我们在用叶酸受体靶向治疗的过程中,可以同时辅以转录调节剂的使用,以增强靶向药物系统的效果。

在载体设计过程中,所使用的载体对人体正常细胞的损伤也是必须考虑的问题。在研究叶酸受体的内吞作用时,我们可以发现,细胞可通过叶酸受体介导的内吞作用将叶酸吸收入胞内,而叶酸通过其羧基与药物或药物载体系统连接形成叶酸复合物后,其与细胞表面叶酸受体的亲和力基本保持不变,即叶酸受体对叶酸复合物仍具有高度亲和性,浓度为10-10mol/L的叶酸即足以饱和所接触到的叶酸受体。肿瘤细胞表面的叶酸受体和以叶酸复合物为主体的递药系统结合后,细胞膜即发生内陷,叶酸受体与叶酸结合物形成细胞内小泡而被内吞入胞

内,在内涵体的酸化作用下(pH值为5),叶酸受体与叶酸复合物脱离,之后叶酸受体再回到细胞膜表面;叶酸结合物则逸出内涵体,将药物释放在细胞质内。这样,递药系统即可使药物选择性攻击肿瘤细胞,实现了针对特定部位病变细胞的靶向递药。递药系统有效进入肿瘤细胞,发挥靶向治疗作用,从而避免对正常细胞的损伤。此外,正常组织中叶酸受体主要定位于极化上皮表面,如近端肾小管极性侧、脑室脉络丛等,此类叶酸受体面向肾小管或脑室等组织的管腔侧,无法与血液接触。因此,血循环中叶酸复合物无法与正常组织中叶酸受体接触,故不易对正常组织造成损伤。

在这篇附带着自己很多猜想的论文中,我尽量做到有根有据,用已有的实验来支持我的猜想。在每一个分步的写作过程中,都写出了文献中的相关实验。虽然有的实验并不是专门为生物医学的用途而设计的(比如合成某些金属催化剂),但我想只要加以改进,这些实验还是可以用在我们研究生物医学纳米材料领域的。

当然,这也只是我的猜想。

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