前 言
随着化学杀菌剂对生态环境，有益生物及人体危害程度的日益严重，以及植物病原菌日益增加的抗药性，利用一些生物防治菌作为生物杀菌剂来防治植物病害，以减轻化学农药对环境污染的研究引起了世界各国科学家的广泛兴趣。木霉菌(Trichoderma spp)自被发现对植物病原菌有抑制作用以来，一直作为一种重要的植物病害生物防治因子而倍受关注。从Weindling于1932年首次发现木素木霉菌(T.lignorum)对多种植物病原菌具有寄生作用以来，应用其进行植物病害的防治已有大量的报道。近几年随着多种商品化木霉制剂研制开发的成功，使得木霉菌应用于植物真菌病害生物防治的研究得到迅速发展。为植物病原真菌的生物防治在实际操作上的可行性利用提供了有效的探索途径，并展示出可喜的应用前景【1】。
目前世界范围内逐渐发现的木霉菌多达数十种，其中利用较为广泛的有哈茨木霉(T.harzianum)、绿色木霉(T.virid)、多孢木霉(T.polysporum)等。随着对木霉菌拮抗机制研究的不断成熟，发现木霉对植物病原菌的拮抗作用是多方面的，但较为重要的机制主要是木霉的竞争作用、重寄生作用及抗生作用【2】。目前对于木霉的诱变方法很多，主要的有化学、物理、生物等方法：
化学方法包括化学诱变、复合处理及定向培育和驯化。化学诱变是利用化学物质对微生物进行诱变，引起基因突变或真核生物染色体的畸变称为化学诱变。化学诱变的物质很多，但只有少数几种效果明显，如烷化剂、吖啶类化合物等。复合处理是指同一种诱变剂的重复使用，两种或多种诱变剂先后使用，两种或多种诱变剂同时使用等方法对目标菌种进行处理。诱变剂的复合处理常有一定的协同效应，增强诱变效果，其突变率普遍比单独处理的高【3】。定向培育和驯化是人为用某一特定环境条件长期处理某一微生物群体，同时不断将他们进行移种传代，以达到累积和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。由于自发突变的变异频率较低，变异程度较轻，故变异过程均比诱变育种和杂交育种慢得多。
物理诱变通常采用的是辐照诱变，利用紫外线、X-射线、激光、电离辐射、γ-射线、离子束等方式对出发菌进行辐照。其中紫外光可以使DNA形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对，可以引起突变或死亡。另外嘧啶二聚体的形成，还可以妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录。
利用紫外诱变的方法选育出大量产量高、活性强的优良微生物菌种是诱变筛选优良菌种的常规方法。其设备简单、诱变效率高、操作安全简便，此外，紫外诱变在核酸中往往造成比较单一的损伤，所以在DNA的损伤与修复研究中也有一定的意义【4】。
生物方法，即采用现代生物技术，对菌种实行定向的改造，以求获得新特性的菌种。如Ti质粒的插入等。
近年来，新的诱变方法不断引入，也为菌种的选育提供了其他的选择，如离子注入、
1
激光诱变等。
复合诱变是指两种或多种诱变剂的先后使用，同一种诱变剂的重复作用和两种或多种诱变剂的同时使用。普遍认为,复合诱变具有协同效应。两种或两种以上诱变剂合理搭配使用复合诱变较单一诱变效果好。复合因子处理是指两种或两种以上的诱变因子诱发菌体突变。复合因子诱变较单一因子诱变在效果有很大优势。各种诱变因子的作用机制不一样，主要是DNA分子上的不同基因位点对各种诱变剂吸收峰值有较大差异，即不同诱变剂对基因作用位点有一定的专一性，有的甚至具有特异性，因此多因子复合处理，可以取长补短，改变DNA分子上多种基因的遗传稳定性，能导致较大的突变，得到更多的突变类型【5】。
某一菌株长期使用诱变剂之后,除产生诱变剂“疲劳效应”外,还会引起菌种生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢等,在实际生产中多采用几种诱变剂复合处理、交叉使用的方法进行菌株诱变。
木霉菌对许多植物病原菌有拮抗作用。然而在目前的作物生产中，许多病害的控制依然以使用化学农药为主。虽然杀菌剂对许多植物病害能产生直接的理想杀灭效果，但有效的化学制剂在整个生态系统中经常发生负作用，甚至有害于植物自身及其周围的环境，同时也对农田生态系统中存在的大量微生物产生不良影响，而其中不少微生物表现出对植物病原物的较强的拮抗性能。采用木霉菌来抑制植物病原菌可以有效地保护植物表面许多有益的生防菌种，从而可进一步提高对病原菌的抑制效果，也可以解决使用化学农药的残留问题。因此，利用木霉菌防治植物真菌病害，在建立环保型生态农业．提高农产品质量，以及在农业可持续性发展战略方有着广阔的开发前景和重大的意义。
由于木霉菌本身属于真菌生物，对化学制剂的传统农药比较敏感，在大田作业时不能与传统化学药剂混施，无法达到生物防治和化学防治的双重效果，在农业生产中受到了许多的限制，成为将木霉菌这一生物防治手段运用到生产实践当中的巨大障碍。
为了将木霉的生物防治制剂的大面积运用，本文选取哈茨木霉作为实验材料，通过紫外线和含药平板复合诱变的方法，研究菌株诱变过程，探讨提高哈茨木霉抗药性的方法，分析影响其抗药性的因素，从而为木霉菌这一先进的生物防治手段运用到现代的农业生产中来，服务于农业，造福于农业的目标提供科学依据。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株 番茄灰霉病菌（Botrytis cinerca）菌株
2
1.1.2供试药剂
百菌清75%可湿性粉剂（利民化工有限责任公司）。 1.1.3供试仪器
LRH-250-G光照培养箱（广东医疗器械厂）、HVE-50型高压蒸汽灭菌锅、H2Q-QG振荡器（哈尔滨东联电子技术有限公司）、HB-920型超净工作台（哈尔滨东联电子技术有限公司）、KF-1102型电子天平（龙腾电子公司）、血球计数板（广东医疗器械厂）、光学显微镜（北京电子光学设备厂）。 1.1.4培养基制作
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂17-20g；水1000mL。制作方法：将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1000ml煮沸半小时，用纱布滤去马铃薯，加水补足1000ml，然后加糖和琼脂完全熔化后，趁热用纱布过滤。而后分装到烧瓶中，加棉花塞后在0.1Mpa至0.15Mpa间高压蒸汽下灭菌20min。
含百菌清培养基：配制10000mg/kg浓度的百菌清农药母液，将母液按所需药液浓度的10倍进行稀释,然后将药液的稀释液与PDA培养基以1:9的比例混合,制备含药平板。
1.2方法
1.2.1菌种活化
将于冰箱中保存的哈茨木霉的菌种，与超净工作台上转接于含有PDA培养基的培养皿上，与培养箱中培养约5天，观察其生长情况，备用。 1.2.2哈茨木霉菌种对百菌清的药物敏感度（EC50）测定
设置六组梯度的百菌清含药平板（0、200、400、600、800mg/L），每个浓度3次重复。将活化后的菌种通过接种针接种至培养皿中央，放入培养箱中培养，每日天使用十字交叉法测量下其菌落直径并记录。按以下公式计算其生长抑制率。 抑制率(％)=[ (对照菌落直径-处理菌落直径) /对照菌落直径] *100
再将各抑制率换算成抑制率概率值， 以各处理中杀菌剂浓度对数值作自变量x值， 以相应处理对菌丝的抑制率概率值为依变量 y值，用线性回归法求出供试杀菌剂的毒力曲线方程 Y= a+bX，计算 EC50（抑制中浓度)【6】。 1.2.3 孢子悬浮液的配制及浓度确定
取已培养完全、菌丝布满平板的Th菌株，加入5ml无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬浮液置于已灭菌50ml三角瓶内，瓶中预先放置数粒无菌玻璃球，充分振摇后用灭菌的脱脂棉进行过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，最终使滤液体积达到10.0ml，待测孢子悬浮液即得。
计数时用16中格血球计数板，要按对角线方位，取左上、在下、右上、右下的4个中格（即100小格）的孢子数。由于孢子在计数室中处于不同的空间位置，要在不同焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部孢子，防止遗漏。如孢子位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
3
将孢子悬浮液用无菌水稀释至107，吸取适量的稀释液至血球计数板的计数室内，然后加上盖玻片，静置约5min，先在低倍镜下找到计数室，再转换成高倍镜观察并计数
【7】
。
1.2.4紫外线辐照处理
将活化菌种培养5d，待产生大量绿色分生孢子后，用无菌水轻轻洗涮，制成107孢子/ml悬浮液。涂布在两种浓度（200mg/kg、250mg/kg）的平板上，置于超净工作台的紫外灯下去盖照射10min和20min两组时间，距离为50cm。即刻放入25℃避光环境中培养，3组重复。统计平板上生长菌落数，并转接至浓度高于原含药平板的平板上进行培养。选取5组生长迅速的突变型木霉菌株。 1.2.5百菌清对诱变菌株的抑制
使用打孔器在培养2d的各突变体木霉菌落边缘截取5mm菌块，将菌块移植到百菌清0mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、浓度的选择性培养基平板中央，一个培养基一个菌饼，重复3次，并设置空白对照。放入培养箱培养，每日天使用十字交叉法测量下其菌落直径并记录。求出突变菌株的抑制率。
抑制率(％)=[ (对照菌落直径-处理菌落直径) /对照菌落直径] *100
再将各抑制率换算成抑制率概率值， 以各处理中杀菌剂浓度对数值作自变量x值， 以相应处理对菌丝的抑制率概率值为依变量 y值，用线性回归法求出供试杀菌剂的毒力曲线方程 Y= a+bX，计算 EC50（抑制中浓度)。 1.2.6抗药哈茨木霉的遗传稳定性测定
将所得的诱变哈茨木霉突变菌株分别接种在PDA平板上，在 2 5℃恒温培养箱中培养，每5 d转接1次，连续转接5次，每处理3次重复。观察亲本及一代、三代、五代处理菌株每次转接后的生长特性并在含600mg/kg浓度的 75％百菌清可湿性粉剂的PDA上培养进行生长状况记录，计算百菌清对突变木霉菌的生长抑制率。 2.7诱变哈茨木霉的生长速率和产孢能力
将各诱变的哈茨木霉菌株接种在PDA平板上，25℃培养2d，用打孔器沿菌落边缘截取5mm的菌块接入PDA平板中央，置入25℃恒温培养箱中，每天测量菌落生长直径，连续3d；于7d时在PDA平板中加入10ml无菌水，制作孢子悬浮液，取1ml悬浮液放入100ml装有无菌水的锥形瓶中，于200r/min的摇床振荡20min，用血球计数器测量产孢量。每处理3次重复
【8】
。
生长速率=[（R3-R2）-(R2-R1)]/2
1.2.8诱变哈茨木霉的对番茄灰霉病菌的拮抗性测定
采用对峙平板法，将诱变哈茨木霉菌株分别与番茄灰霉对峙接种在PDA平板的两端，接种点距离平板中心2cm处，菌块直径5mm，以单独接种病原菌株作为对照。每处理重复 3次，置于2 5℃恒温箱中培养，每天测量抗药突变木霉菌株菌和病原菌的相向半径以及对照病原菌菌落半径，并按以下公式计算其抑菌率。
抑菌率（％）=[(病原菌对照菌落直径-病原菌落的直径)/病原菌对照菌落直径]*100
4
R1为对照灰霉菌菌落直径，R2为灰霉菌菌落直径。哈茨木霉覆盖灰霉菌的分级标准为：Ⅰ：哈茨木霉菌丝占据培养皿的100%；Ⅱ：哈茨木霉菌丝占据培养皿的2/3；Ⅲ：哈茨木霉菌丝占据培养皿的1/3—2/3；Ⅳ：哈茨木霉菌丝占据培养皿
2、结果与分析
2.1抗百菌清的哈茨木霉的诱变选育。
表1： 复合诱变后菌落数统计 单位：个
时间 浓度 200mg/kg 250mg/kg CK
A 3 1
10min B 2 0 生长旺盛
C 2 污染
A 3 1 生长旺盛
20min B 0 0 10
C 污染 3 8
A、B、C为同一处理的3组重复
紫外照射对哈茨木霉的分生孢子有强烈的致死作用。在10min和20min的照射水平下，诱导的哈茨木霉菌株平均每平板产生1.2个变异菌株。在不同浓度和不同时间共诱变出15个的变异菌株，将其转接至浓度300mg/kg的含药平板上继续生长, 将其中生长良好、长势旺盛的5株诱变菌株继续进行研究,5个菌株的编号分别为Th-200-10-C1、Th-200-10-B2、Th-200-20-A2
、
Th-200-10-A1
、
图1：处于含药平板的Th菌落
Th-200-20-A1,皆为从200mg/ml的诱变平板上变异而来.这些菌株的菌落呈白绿色，较小、菌丝密实、呈毡状或花瓣状卷曲。
2.2百菌清对哈茨木霉出发菌株及诱变菌株的敏感度测定
通过对出发哈茨木霉菌株的敏感度测试，确定其原菌种对于百菌清农药的抗性状况，为以后的实验提供基础，同时作为对哈茨木霉诱变效果的客观依据。实验数据表明（见表2），亲本菌株对百菌清有较强的敏感性，在高浓度的百菌清的含药平板中几乎无法成活,亲本菌株在不同浓度的含药平板条件下培养5d，其菌落直径均为1cm左右。
由表2可知，五个诱变的哈茨木霉菌株与未诱变的原菌株相比，抗药性有明显差异。亲本菌株的EC50的值为61.8219mg/kg，Th-200-20-A2菌株的敏感性最强，其EC50为55.35 mg/kg,Th-200-10-B2菌株的抗药性最强,为167.09mg/kg，比原出发菌株的抗药性
5
提高了2.7倍。说明经过诱变选育，得到的菌株对百菌清具有明显的抗药性。其他3个菌株(Th-200-10-C1、Th-200-10-A1、Th-200-20-A1)的抗药性皆有大幅提高。
表2 诱变木霉菌的敏感性测定
木霉菌株 Trichoderma harzianum Th-200-10-C1 Th-200-10-B2 Th-200-20-A2 Th-200-10-A1 Th-200-20-A1 出发菌株Th
毒力方程 Virulence equation Y=1.1094X+1.9474 Y=1.6809X+3.1222 Y=2.7818X+1.3223 Y=0.4032X+2.2392 Y=1.0738X+2.0633 Y=2.8785X+1.2159
2R
EC50
50% effective concentration（mg/kg） 113.4741 167.0853 55.3489 124.1194 127.142 61.8219
0.7387 0.901 0.9251 1.0012 1.053 0.9114
2.4诱变哈茨木霉菌株的遗传性测定
由表3可知，由紫外线诱导与含药培养基驯化产生的5个木霉突变型菌株 NF9-200-10-C1、NF9-200-10-B2、NF9-200-20-A2、NF9-200-10-A1、NF9-200-20-A1,经连续5次转接后，在600mg/kg含药平板上的生长抑制率比出发菌株略有提高，且随传代培养后抑制率变化不大，表明抗药性随着传代培养没有消失，其中Th-200-10-B2菌株的F3出现高抗药性，但F5代的生长抑制率又有所升高,其抗药性变化的机制还未明确。
表3 各代菌种在600mg/kg含药平板的抑制率
菌株
strain Th-200-10-C1 Th-200-10-B2 Th-200-20-A2 Th-200-10-A1 Th-200-20-A1 出发菌株Th
1代 Original generation 70.1% 61.5% 72.0% 80.0% 61.7%
3代 3th generation 61.5% 44.8% 65.1% 66.0% 67.4% 70.9%
5代 5th generation 68.1% 68.4% 64.7% 72.8% 68.7%
2.5诱变菌株的生长速率与产孢能力测定
由表4知，各诱变木霉菌株的生长速率均比亲本菌株低，但它们之间差异不大。从诱变木霉菌株的产孢量与出发菌株相比，均有所降低，特别是编号Th-200-10-B2的菌株的产孢量比出发菌株降低了42.59%，有大幅下降，说明辐照对其产生了不利的诱变效果。
6
表4 诱变菌株的生长速率与产孢能力
菌株 strain Th-200-10-C1 Th-200-10-B2 Th-200-20-A2 Th-200-10-A1 Th-200-20-A1
Th
生长速率
Growth rate（mm/d）
33.75 34.75 33.58 35.25 33.50 36.02
产孢量
9
Sporus quantity(*10/ml)
4.8 2.3 4.2 3.1 4.6 5.4
2.6诱变哈茨木霉对番茄灰霉病菌的拮抗性测定
由表5可知，各诱变木霉菌均有生长，其中Th-200-10-C1、Th-200-10-B2、 Th-200-20-A2、Th-200-10-A1对番茄灰霉都具有强烈的抑制作用，对番茄灰霉的抑制率
表5：哈茨木霉对番茄灰霉病菌的拮抗性（48h）
菌株
strain Th-200-10-C1 Th-200-10-B2 Th-200-20-A2 Th-200-10-A1 Th-200-20-A1
灰霉
哈茨木霉 R2 (mm) 17.2 27.1 10.1 20.3 3.8 —
番茄灰霉 R1 (mm) 15.2 13.7 17.4 14.7 28.2 35.3
抑菌率 Bacteriostatic
rate
56.94% 61.19% 50.71% 58.36% 20.11% —
覆盖情况 Coverage（7d）
Ⅱ Ⅱ Ⅲ Ⅱ Ⅳ —
均达50%以上，编号为NF9-200-20-A1的诱变菌株对番茄灰霉的抑制率较低，为20.11%，可能是辐照影响了其生物防治机制。
3结论与讨论
本实验采用紫外线与含百菌清培养基相结合的复合诱变的方法，选育出对百菌清产
生一定抗药性的突变哈茨木霉4株（Th-200-10-C1、Th-200-10-B2、Th-200-10-A1、Th-200-20-A1）其中Th-200-10-B2的抗药性最高，其EC50达到167.0853mg/kg，较出发菌种提高了2.7倍。实验结果表明采用紫外线和含药平板复合诱变的方法，可以有效的产生抗药性菌株。
通过对筛选的诱变菌株传代培养，各代菌株较出发菌株的抗药性略有提升，无明显的衰退现象发生，其中NF9-200-10-B2的F3代有大幅度的抗药性提升。但F5代的生长抑制率又有所升高,其抗药性变化的机制还未明确。各筛选菌株的生长速率及产孢能力与出发菌株略有差异，但差异不大。
通过对诱变菌株与番茄灰霉病菌的对峙培养，各诱变菌株对番茄灰霉均有抑制作
7
用，抑制率最高达61.19%。其中NF9-200-20-A1菌株的拮抗性有明显降低。
实验诱变出百菌清产生抗性的突菌株4株，亲本木霉菌株相比较,一些主要性状略有消减，但生长速率、产孢能力以及拮抗作用等均接近或较近于出发菌株，抗药性却高于亲本菌株，这无疑提供了对环境适应能力更强的生防木霉菌株，为木霉的生物制剂在田间应用时不受或少受杀菌剂的影响提供了可参考的依据，同时也为实现生物农药与化学农药综合协同作用提供了参考。
紫外线作为一种物理诱变因子，具有诱变效果明显和方法简单等优点，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具，通过扩大突变体的筛选基数，可得到性能优良的变异菌株【9】。
实验证实，先单一将菌株进行紫外线诱变，即诱变时所用PDA培养基为无药培养基，然后再利用含药(百菌清)平板进行培养，不易得到诱变木霉突变菌株，而通过紫外线诱导和含药培养基培养相结合的方法却较易诱导产生诱变突变体【10】。试验结果显示，对于内吸性杀菌剂(如多菌灵等)木霉突变菌株的诱变须进行紫外线重复诱变与多次含药平板培养方可得到合适的诱变菌株【11】。
前人试验结果显示，将菌株通过紫外线诱导和含药培养基驯化相结合的方法较易诱导产生抗药性突变体。（张丽荣，紫外线诱变拮抗木霉产生对百菌清抗药性菌株的研究）但本实验采用的是紫外线诱导和化学诱变结合的方法，产生的诱变菌株第一代抗药性明显，但随着传代的增多，抗药性衰退明显。
在对诱变菌株的EC50测定的实验中，未预见到对照菌株生长速率问题，仍使用和样本一致的平板，导致临近第三天菌落已经布满平板，导致后期的数据由于无对照作废。这些事故的发生都是由于设想的不全面造成的，也为今后的研究提供了经验。
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前 言
随着化学杀菌剂对生态环境，有益生物及人体危害程度的日益严重，以及植物病原菌日益增加的抗药性，利用一些生物防治菌作为生物杀菌剂来防治植物病害，以减轻化学农药对环境污染的研究引起了世界各国科学家的广泛兴趣。木霉菌(Trichoderma spp)自被发现对植物病原菌有抑制作用以来，一直作为一种重要的植物病害生物防治因子而倍受关注。从Weindling于1932年首次发现木素木霉菌(T.lignorum)对多种植物病原菌具有寄生作用以来，应用其进行植物病害的防治已有大量的报道。近几年随着多种商品化木霉制剂研制开发的成功，使得木霉菌应用于植物真菌病害生物防治的研究得到迅速发展。为植物病原真菌的生物防治在实际操作上的可行性利用提供了有效的探索途径，并展示出可喜的应用前景【1】。
目前世界范围内逐渐发现的木霉菌多达数十种，其中利用较为广泛的有哈茨木霉(T.harzianum)、绿色木霉(T.virid)、多孢木霉(T.polysporum)等。随着对木霉菌拮抗机制研究的不断成熟，发现木霉对植物病原菌的拮抗作用是多方面的，但较为重要的机制主要是木霉的竞争作用、重寄生作用及抗生作用【2】。目前对于木霉的诱变方法很多，主要的有化学、物理、生物等方法：
化学方法包括化学诱变、复合处理及定向培育和驯化。化学诱变是利用化学物质对微生物进行诱变，引起基因突变或真核生物染色体的畸变称为化学诱变。化学诱变的物质很多，但只有少数几种效果明显，如烷化剂、吖啶类化合物等。复合处理是指同一种诱变剂的重复使用，两种或多种诱变剂先后使用，两种或多种诱变剂同时使用等方法对目标菌种进行处理。诱变剂的复合处理常有一定的协同效应，增强诱变效果，其突变率普遍比单独处理的高【3】。定向培育和驯化是人为用某一特定环境条件长期处理某一微生物群体，同时不断将他们进行移种传代，以达到累积和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。由于自发突变的变异频率较低，变异程度较轻，故变异过程均比诱变育种和杂交育种慢得多。
物理诱变通常采用的是辐照诱变，利用紫外线、X-射线、激光、电离辐射、γ-射线、离子束等方式对出发菌进行辐照。其中紫外光可以使DNA形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对，可以引起突变或死亡。另外嘧啶二聚体的形成，还可以妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录。
利用紫外诱变的方法选育出大量产量高、活性强的优良微生物菌种是诱变筛选优良菌种的常规方法。其设备简单、诱变效率高、操作安全简便，此外，紫外诱变在核酸中往往造成比较单一的损伤，所以在DNA的损伤与修复研究中也有一定的意义【4】。
生物方法，即采用现代生物技术，对菌种实行定向的改造，以求获得新特性的菌种。如Ti质粒的插入等。
近年来，新的诱变方法不断引入，也为菌种的选育提供了其他的选择，如离子注入、
1
激光诱变等。
复合诱变是指两种或多种诱变剂的先后使用，同一种诱变剂的重复作用和两种或多种诱变剂的同时使用。普遍认为,复合诱变具有协同效应。两种或两种以上诱变剂合理搭配使用复合诱变较单一诱变效果好。复合因子处理是指两种或两种以上的诱变因子诱发菌体突变。复合因子诱变较单一因子诱变在效果有很大优势。各种诱变因子的作用机制不一样，主要是DNA分子上的不同基因位点对各种诱变剂吸收峰值有较大差异，即不同诱变剂对基因作用位点有一定的专一性，有的甚至具有特异性，因此多因子复合处理，可以取长补短，改变DNA分子上多种基因的遗传稳定性，能导致较大的突变，得到更多的突变类型【5】。
某一菌株长期使用诱变剂之后,除产生诱变剂“疲劳效应”外,还会引起菌种生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢等,在实际生产中多采用几种诱变剂复合处理、交叉使用的方法进行菌株诱变。
木霉菌对许多植物病原菌有拮抗作用。然而在目前的作物生产中，许多病害的控制依然以使用化学农药为主。虽然杀菌剂对许多植物病害能产生直接的理想杀灭效果，但有效的化学制剂在整个生态系统中经常发生负作用，甚至有害于植物自身及其周围的环境，同时也对农田生态系统中存在的大量微生物产生不良影响，而其中不少微生物表现出对植物病原物的较强的拮抗性能。采用木霉菌来抑制植物病原菌可以有效地保护植物表面许多有益的生防菌种，从而可进一步提高对病原菌的抑制效果，也可以解决使用化学农药的残留问题。因此，利用木霉菌防治植物真菌病害，在建立环保型生态农业．提高农产品质量，以及在农业可持续性发展战略方有着广阔的开发前景和重大的意义。
由于木霉菌本身属于真菌生物，对化学制剂的传统农药比较敏感，在大田作业时不能与传统化学药剂混施，无法达到生物防治和化学防治的双重效果，在农业生产中受到了许多的限制，成为将木霉菌这一生物防治手段运用到生产实践当中的巨大障碍。
为了将木霉的生物防治制剂的大面积运用，本文选取哈茨木霉作为实验材料，通过紫外线和含药平板复合诱变的方法，研究菌株诱变过程，探讨提高哈茨木霉抗药性的方法，分析影响其抗药性的因素，从而为木霉菌这一先进的生物防治手段运用到现代的农业生产中来，服务于农业，造福于农业的目标提供科学依据。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株 番茄灰霉病菌（Botrytis cinerca）菌株
2
1.1.2供试药剂
百菌清75%可湿性粉剂（利民化工有限责任公司）。 1.1.3供试仪器
LRH-250-G光照培养箱（广东医疗器械厂）、HVE-50型高压蒸汽灭菌锅、H2Q-QG振荡器（哈尔滨东联电子技术有限公司）、HB-920型超净工作台（哈尔滨东联电子技术有限公司）、KF-1102型电子天平（龙腾电子公司）、血球计数板（广东医疗器械厂）、光学显微镜（北京电子光学设备厂）。 1.1.4培养基制作
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂17-20g；水1000mL。制作方法：将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1000ml煮沸半小时，用纱布滤去马铃薯，加水补足1000ml，然后加糖和琼脂完全熔化后，趁热用纱布过滤。而后分装到烧瓶中，加棉花塞后在0.1Mpa至0.15Mpa间高压蒸汽下灭菌20min。
含百菌清培养基：配制10000mg/kg浓度的百菌清农药母液，将母液按所需药液浓度的10倍进行稀释,然后将药液的稀释液与PDA培养基以1:9的比例混合,制备含药平板。
1.2方法
1.2.1菌种活化
将于冰箱中保存的哈茨木霉的菌种，与超净工作台上转接于含有PDA培养基的培养皿上，与培养箱中培养约5天，观察其生长情况，备用。 1.2.2哈茨木霉菌种对百菌清的药物敏感度（EC50）测定
设置六组梯度的百菌清含药平板（0、200、400、600、800mg/L），每个浓度3次重复。将活化后的菌种通过接种针接种至培养皿中央，放入培养箱中培养，每日天使用十字交叉法测量下其菌落直径并记录。按以下公式计算其生长抑制率。 抑制率(％)=[ (对照菌落直径-处理菌落直径) /对照菌落直径] *100
再将各抑制率换算成抑制率概率值， 以各处理中杀菌剂浓度对数值作自变量x值， 以相应处理对菌丝的抑制率概率值为依变量 y值，用线性回归法求出供试杀菌剂的毒力曲线方程 Y= a+bX，计算 EC50（抑制中浓度)【6】。 1.2.3 孢子悬浮液的配制及浓度确定
取已培养完全、菌丝布满平板的Th菌株，加入5ml无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬浮液置于已灭菌50ml三角瓶内，瓶中预先放置数粒无菌玻璃球，充分振摇后用灭菌的脱脂棉进行过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，最终使滤液体积达到10.0ml，待测孢子悬浮液即得。
计数时用16中格血球计数板，要按对角线方位，取左上、在下、右上、右下的4个中格（即100小格）的孢子数。由于孢子在计数室中处于不同的空间位置，要在不同焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部孢子，防止遗漏。如孢子位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
3
将孢子悬浮液用无菌水稀释至107，吸取适量的稀释液至血球计数板的计数室内，然后加上盖玻片，静置约5min，先在低倍镜下找到计数室，再转换成高倍镜观察并计数
【7】
。
1.2.4紫外线辐照处理
将活化菌种培养5d，待产生大量绿色分生孢子后，用无菌水轻轻洗涮，制成107孢子/ml悬浮液。涂布在两种浓度（200mg/kg、250mg/kg）的平板上，置于超净工作台的紫外灯下去盖照射10min和20min两组时间，距离为50cm。即刻放入25℃避光环境中培养，3组重复。统计平板上生长菌落数，并转接至浓度高于原含药平板的平板上进行培养。选取5组生长迅速的突变型木霉菌株。 1.2.5百菌清对诱变菌株的抑制
使用打孔器在培养2d的各突变体木霉菌落边缘截取5mm菌块，将菌块移植到百菌清0mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、浓度的选择性培养基平板中央，一个培养基一个菌饼，重复3次，并设置空白对照。放入培养箱培养，每日天使用十字交叉法测量下其菌落直径并记录。求出突变菌株的抑制率。
抑制率(％)=[ (对照菌落直径-处理菌落直径) /对照菌落直径] *100
再将各抑制率换算成抑制率概率值， 以各处理中杀菌剂浓度对数值作自变量x值， 以相应处理对菌丝的抑制率概率值为依变量 y值，用线性回归法求出供试杀菌剂的毒力曲线方程 Y= a+bX，计算 EC50（抑制中浓度)。 1.2.6抗药哈茨木霉的遗传稳定性测定
将所得的诱变哈茨木霉突变菌株分别接种在PDA平板上，在 2 5℃恒温培养箱中培养，每5 d转接1次，连续转接5次，每处理3次重复。观察亲本及一代、三代、五代处理菌株每次转接后的生长特性并在含600mg/kg浓度的 75％百菌清可湿性粉剂的PDA上培养进行生长状况记录，计算百菌清对突变木霉菌的生长抑制率。 2.7诱变哈茨木霉的生长速率和产孢能力
将各诱变的哈茨木霉菌株接种在PDA平板上，25℃培养2d，用打孔器沿菌落边缘截取5mm的菌块接入PDA平板中央，置入25℃恒温培养箱中，每天测量菌落生长直径，连续3d；于7d时在PDA平板中加入10ml无菌水，制作孢子悬浮液，取1ml悬浮液放入100ml装有无菌水的锥形瓶中，于200r/min的摇床振荡20min，用血球计数器测量产孢量。每处理3次重复
【8】
。
生长速率=[（R3-R2）-(R2-R1)]/2
1.2.8诱变哈茨木霉的对番茄灰霉病菌的拮抗性测定
采用对峙平板法，将诱变哈茨木霉菌株分别与番茄灰霉对峙接种在PDA平板的两端，接种点距离平板中心2cm处，菌块直径5mm，以单独接种病原菌株作为对照。每处理重复 3次，置于2 5℃恒温箱中培养，每天测量抗药突变木霉菌株菌和病原菌的相向半径以及对照病原菌菌落半径，并按以下公式计算其抑菌率。
抑菌率（％）=[(病原菌对照菌落直径-病原菌落的直径)/病原菌对照菌落直径]*100
4
R1为对照灰霉菌菌落直径，R2为灰霉菌菌落直径。哈茨木霉覆盖灰霉菌的分级标准为：Ⅰ：哈茨木霉菌丝占据培养皿的100%；Ⅱ：哈茨木霉菌丝占据培养皿的2/3；Ⅲ：哈茨木霉菌丝占据培养皿的1/3—2/3；Ⅳ：哈茨木霉菌丝占据培养皿
2、结果与分析
2.1抗百菌清的哈茨木霉的诱变选育。
表1： 复合诱变后菌落数统计 单位：个
时间 浓度 200mg/kg 250mg/kg CK
A 3 1
10min B 2 0 生长旺盛
C 2 污染
A 3 1 生长旺盛
20min B 0 0 10
C 污染 3 8
A、B、C为同一处理的3组重复
紫外照射对哈茨木霉的分生孢子有强烈的致死作用。在10min和20min的照射水平下，诱导的哈茨木霉菌株平均每平板产生1.2个变异菌株。在不同浓度和不同时间共诱变出15个的变异菌株，将其转接至浓度300mg/kg的含药平板上继续生长, 将其中生长良好、长势旺盛的5株诱变菌株继续进行研究,5个菌株的编号分别为Th-200-10-C1、Th-200-10-B2、Th-200-20-A2
、
Th-200-10-A1
、
图1：处于含药平板的Th菌落
Th-200-20-A1,皆为从200mg/ml的诱变平板上变异而来.这些菌株的菌落呈白绿色，较小、菌丝密实、呈毡状或花瓣状卷曲。
2.2百菌清对哈茨木霉出发菌株及诱变菌株的敏感度测定
通过对出发哈茨木霉菌株的敏感度测试，确定其原菌种对于百菌清农药的抗性状况，为以后的实验提供基础，同时作为对哈茨木霉诱变效果的客观依据。实验数据表明（见表2），亲本菌株对百菌清有较强的敏感性，在高浓度的百菌清的含药平板中几乎无法成活,亲本菌株在不同浓度的含药平板条件下培养5d，其菌落直径均为1cm左右。
由表2可知，五个诱变的哈茨木霉菌株与未诱变的原菌株相比，抗药性有明显差异。亲本菌株的EC50的值为61.8219mg/kg，Th-200-20-A2菌株的敏感性最强，其EC50为55.35 mg/kg,Th-200-10-B2菌株的抗药性最强,为167.09mg/kg，比原出发菌株的抗药性
5
提高了2.7倍。说明经过诱变选育，得到的菌株对百菌清具有明显的抗药性。其他3个菌株(Th-200-10-C1、Th-200-10-A1、Th-200-20-A1)的抗药性皆有大幅提高。
表2 诱变木霉菌的敏感性测定
木霉菌株 Trichoderma harzianum Th-200-10-C1 Th-200-10-B2 Th-200-20-A2 Th-200-10-A1 Th-200-20-A1 出发菌株Th
毒力方程 Virulence equation Y=1.1094X+1.9474 Y=1.6809X+3.1222 Y=2.7818X+1.3223 Y=0.4032X+2.2392 Y=1.0738X+2.0633 Y=2.8785X+1.2159
2R
EC50
50% effective concentration（mg/kg） 113.4741 167.0853 55.3489 124.1194 127.142 61.8219
0.7387 0.901 0.9251 1.0012 1.053 0.9114
2.4诱变哈茨木霉菌株的遗传性测定
由表3可知，由紫外线诱导与含药培养基驯化产生的5个木霉突变型菌株 NF9-200-10-C1、NF9-200-10-B2、NF9-200-20-A2、NF9-200-10-A1、NF9-200-20-A1,经连续5次转接后，在600mg/kg含药平板上的生长抑制率比出发菌株略有提高，且随传代培养后抑制率变化不大，表明抗药性随着传代培养没有消失，其中Th-200-10-B2菌株的F3出现高抗药性，但F5代的生长抑制率又有所升高,其抗药性变化的机制还未明确。
表3 各代菌种在600mg/kg含药平板的抑制率
菌株
strain Th-200-10-C1 Th-200-10-B2 Th-200-20-A2 Th-200-10-A1 Th-200-20-A1 出发菌株Th
1代 Original generation 70.1% 61.5% 72.0% 80.0% 61.7%
3代 3th generation 61.5% 44.8% 65.1% 66.0% 67.4% 70.9%
5代 5th generation 68.1% 68.4% 64.7% 72.8% 68.7%
2.5诱变菌株的生长速率与产孢能力测定
由表4知，各诱变木霉菌株的生长速率均比亲本菌株低，但它们之间差异不大。从诱变木霉菌株的产孢量与出发菌株相比，均有所降低，特别是编号Th-200-10-B2的菌株的产孢量比出发菌株降低了42.59%，有大幅下降，说明辐照对其产生了不利的诱变效果。
6
表4 诱变菌株的生长速率与产孢能力
菌株 strain Th-200-10-C1 Th-200-10-B2 Th-200-20-A2 Th-200-10-A1 Th-200-20-A1
Th
生长速率
Growth rate（mm/d）
33.75 34.75 33.58 35.25 33.50 36.02
产孢量
9
Sporus quantity(*10/ml)
4.8 2.3 4.2 3.1 4.6 5.4
2.6诱变哈茨木霉对番茄灰霉病菌的拮抗性测定
由表5可知，各诱变木霉菌均有生长，其中Th-200-10-C1、Th-200-10-B2、 Th-200-20-A2、Th-200-10-A1对番茄灰霉都具有强烈的抑制作用，对番茄灰霉的抑制率
表5：哈茨木霉对番茄灰霉病菌的拮抗性（48h）
菌株
strain Th-200-10-C1 Th-200-10-B2 Th-200-20-A2 Th-200-10-A1 Th-200-20-A1
灰霉
哈茨木霉 R2 (mm) 17.2 27.1 10.1 20.3 3.8 —
番茄灰霉 R1 (mm) 15.2 13.7 17.4 14.7 28.2 35.3
抑菌率 Bacteriostatic
rate
56.94% 61.19% 50.71% 58.36% 20.11% —
覆盖情况 Coverage（7d）
Ⅱ Ⅱ Ⅲ Ⅱ Ⅳ —
均达50%以上，编号为NF9-200-20-A1的诱变菌株对番茄灰霉的抑制率较低，为20.11%，可能是辐照影响了其生物防治机制。
3结论与讨论
本实验采用紫外线与含百菌清培养基相结合的复合诱变的方法，选育出对百菌清产
生一定抗药性的突变哈茨木霉4株（Th-200-10-C1、Th-200-10-B2、Th-200-10-A1、Th-200-20-A1）其中Th-200-10-B2的抗药性最高，其EC50达到167.0853mg/kg，较出发菌种提高了2.7倍。实验结果表明采用紫外线和含药平板复合诱变的方法，可以有效的产生抗药性菌株。
通过对筛选的诱变菌株传代培养，各代菌株较出发菌株的抗药性略有提升，无明显的衰退现象发生，其中NF9-200-10-B2的F3代有大幅度的抗药性提升。但F5代的生长抑制率又有所升高,其抗药性变化的机制还未明确。各筛选菌株的生长速率及产孢能力与出发菌株略有差异，但差异不大。
通过对诱变菌株与番茄灰霉病菌的对峙培养，各诱变菌株对番茄灰霉均有抑制作
7
用，抑制率最高达61.19%。其中NF9-200-20-A1菌株的拮抗性有明显降低。
实验诱变出百菌清产生抗性的突菌株4株，亲本木霉菌株相比较,一些主要性状略有消减，但生长速率、产孢能力以及拮抗作用等均接近或较近于出发菌株，抗药性却高于亲本菌株，这无疑提供了对环境适应能力更强的生防木霉菌株，为木霉的生物制剂在田间应用时不受或少受杀菌剂的影响提供了可参考的依据，同时也为实现生物农药与化学农药综合协同作用提供了参考。
紫外线作为一种物理诱变因子，具有诱变效果明显和方法简单等优点，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具，通过扩大突变体的筛选基数，可得到性能优良的变异菌株【9】。
实验证实，先单一将菌株进行紫外线诱变，即诱变时所用PDA培养基为无药培养基，然后再利用含药(百菌清)平板进行培养，不易得到诱变木霉突变菌株，而通过紫外线诱导和含药培养基培养相结合的方法却较易诱导产生诱变突变体【10】。试验结果显示，对于内吸性杀菌剂(如多菌灵等)木霉突变菌株的诱变须进行紫外线重复诱变与多次含药平板培养方可得到合适的诱变菌株【11】。
前人试验结果显示，将菌株通过紫外线诱导和含药培养基驯化相结合的方法较易诱导产生抗药性突变体。（张丽荣，紫外线诱变拮抗木霉产生对百菌清抗药性菌株的研究）但本实验采用的是紫外线诱导和化学诱变结合的方法，产生的诱变菌株第一代抗药性明显，但随着传代的增多，抗药性衰退明显。
在对诱变菌株的EC50测定的实验中，未预见到对照菌株生长速率问题，仍使用和样本一致的平板，导致临近第三天菌落已经布满平板，导致后期的数据由于无对照作废。这些事故的发生都是由于设想的不全面造成的，也为今后的研究提供了经验。
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